检测HBsAg/anti-HBs复合物体系中有效成分的量的方法和应用

摘要

本发明涉及检测HBsAg/anti‑HBs复合物体系中有效成分的量的方法，包括：1)提供所述复合物体系，其包含HBsAg/anti‑HBs复合物、游离IgG和游离HBsAg；2)对所述体系进行亲和层析，收集含有游离HBsAg的流穿峰a；3)提供参照HBsAg溶液，其含有与所述体系的HBsAg总量相同的HBsAg；对参照HBsAg溶液进行亲和层析，收集含有HBsAg的流穿峰b；4)检测流穿峰a中游离HBsAg的量a、流穿峰b中HBsAg的量b，用量a、量b、所述体系中的HBsAg总量，计算所述体系中游离HBsAg的量。该方法可应用于HBsAg/anti‑HBs复合物型乙肝疫苗的质量控制。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体而言，涉及一种检测HBsAg/anti-HBs复合物体系中有效成分的量的方法和应用。

背景技术

免疫复合物(immune complexes，IC)型疫苗是将抗原与相应的特异性抗体以适当的比例混合形成抗原抗体复合物，作为抗原，添加或不添加佐剂制备而成的疫苗。IC增强免疫应答的机制可能有以下几点：IC中抗体Fc段与抗原提呈细胞(antigen presentingcell，APC)表面的Fc受体结合，介导IC内化，可提高IC中抗原成分的提呈；IC通过抗体的Fc段结合树突状细胞(dendritic cells，DC)表面的Fc受体，可充当天然佐剂并调解DC成熟；IC可直接激活效应细胞，诱导较强的MHC I和MHC II类“交叉提呈”反应；少量IC被淋巴滤泡里的滤泡树突细胞(follicular dendritic cells，FDC)捕获并且能够长时间停留在FDC表面，这对T细胞依赖的抗体反应起着重要的作用。

免疫复合物型乙肝疫苗包含由重组乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surfaceantigen，HBsAg)和乙型肝炎人免疫球蛋白(human hepatitis B immunoglobulin，HBIG)组成的HBsAg/anti-HBs复合物，其易被APC摄取及提呈，进而可激发机体产生有效的体液免疫和细胞免疫应答。免疫复合物型乙肝疫苗与市售酿酒酵母乙肝疫苗相比，可以诱导产生更高滴度的抗HBsAg抗体(anti-HBs)和细胞免疫应答。

免疫复合物型乙肝疫苗的制备工艺为：1)通过“配比试验”确定HBsAg与HBIG的合适比例；2)将HBsAg与HBIG按照该比例 混合，在一定的温度下孵育一定的时间，将该溶液定义为“复合物”；3)向“复合物”中加入上述等量HBsAg，继续混匀，将该溶液定义为“加过量抗原复合物”，该溶液为免疫复合物型乙肝疫苗的原液；4)将“加过量抗原复合物”与等量的铝佐剂对倍吸附，即为疫苗半成品；5)安瓿分装，即为成品。

免疫复合物型乙肝疫苗的有效成分为HBsAg/anti-HBs复合物及游离的HBsAg，两者的含量检测对于疫苗的质量控制至关重要。免疫复合物型乙肝疫苗生产所用HBsAg为酿酒酵母表达的基因工程重组乙肝病毒表面抗原，其纯度在95％以上；HBIG为来源于人血浆、通过低温乙醇法制备的血液制品，其IgG纯度在90％以上，但是其中除含有抗HBsAg的抗体anti-HBs之外，还含有大量针对其他病原体/抗原的IgG。

由于抗原抗体反应为可逆的动态平衡反应，疫苗原液(即“加过量抗原复合物”)体系中含有以下几种成分：HBsAg/anti-HBs复合物、游离的HBsAg、游离的IgG(大量非特异性IgG，微量anti-HBs)。这一动态平衡的特点，限制了分离方法，将各组分分离并精确定量检测是免疫复合物型疫苗生产质控的难点。长时间以来，免疫复合物型乙型肝炎疫苗中有效成分的精确检测是困扰相关领域的研究者和技术人员的难题，现有技术中尚缺乏针对免疫复合物型疫苗各有效成分的有效且精确的检测方法。

发明内容

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种检测HBsAg/anti-HBs复合物体系中有效成分的量的方法和应用。

具体而言，本发明提供了：

(1)一种检测HBsAg/anti-HBs复合物体系中有效成分的量的方法，包括：

1)提供HBsAg/anti-HBs复合物体系，该体系包含HBsAg/anti-HBs复合物、游离IgG和游离HBsAg；所述有效成分为所述游离HBsAg和所述HBsAg/anti-HBs复合物；

2)对所述HBsAg/anti-HBs复合物体系进行亲和层析，其中所述亲和层析的介质能够吸附HBsAg/anti-HBs复合物和游离IgG；收集含有游离HBsAg的流穿峰a；

3)提供参照HBsAg溶液，所述参照HBsAg溶液含有与所述HBsAg/anti-HBs复合物体系的HBsAg总量相同的HBsAg；对所述参照HBsAg溶液进行所述亲和层析，收集含有HBsAg的流穿峰b；

4)特异性地检测流穿峰a中的游离HBsAg的量a，以及流穿峰b中的HBsAg的量b，用量a、量b、以及所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的HBsAg总量，计算所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的游离HBsAg的量。

(2)根据(1)所述的方法，其中所述方法还包括：

5)对所述HBsAg/anti-HBs复合物体系进行亲和层析，其中所述亲和层析的介质能够吸附HBsAg/anti-HBs复合物和游离HBsAg；将吸附于层析介质上的HBsAg/anti-HBs复合物和游离HBsAg洗脱下来，收集含有该HBsAg/anti-HBs复合物和该游离HBsAg的洗脱峰a；

6)检测所述洗脱峰a中的蛋白量，用该蛋白量和步骤4)所得HBsAg/anti-HBs复合物体系中的游离HBsAg的量，计算所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的HBsAg/anti-HBs复合物的量。

(3)根据(1)或(2)所述的方法，其中所述HBsAg/anti-HBs复合物体系为免疫复合物型乙肝疫苗原液。

(4)根据(1)或(2)所述的方法，其中步骤2)和3)中所述的亲和层析为蛋白A亲和层析。

(5)根据(2)所述的方法，其中步骤5)中所述的亲和层析为肝素亲和层析。

(6)根据(1)或(2)所述的方法，其中在步骤4)中，采用免疫学方法特异性地检测所述量a和所述量b。

(7)根据(1)或(2)所述的方法，其中在步骤4)中，计算量a比量b的比值，并计算该比值与所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的HBsAg总量的乘积，由此得到所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的游离HBsAg的量。

(8)根据(2)所述的方法，其中在步骤6)中，用所述洗脱峰a中的蛋白量减去步骤4)所得HBsAg/anti-HBs复合物体系中的游离HBsAg的量，由此得到所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的HBsAg/anti-HBs复合物的量。

(9)根据(2)所述的方法，其中步骤5)所述的洗脱采用磷酸盐缓冲液作为洗脱液。

(10)根据(2)所述的方法，其中所述方法还包括i)提供参照HBIG溶液，该参照HBIG溶液含有与所述HBsAg/anti-HBs复合物体系的IgG总量相同的IgG；对该参照HBIG溶液进行步骤5)所述的亲和层析，将参照HBIG溶液中非特异性吸附于该亲和层析的介质上的IgG洗脱下来，收集含有该IgG的洗脱峰b，检测该洗脱峰b中的蛋白量；并且

其中在步骤6)中，用所述洗脱峰b中的蛋白量、所述洗脱峰a中的蛋白量、以及步骤4)所得HBsAg/anti-HBs复合物体系中的游离HBsAg的量，计算所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的HBsAg/anti-HBs复合物的量。

(11)根据(10)所述的方法，其中用所述洗脱峰a中的蛋白量减去：所述洗脱峰b中的蛋白量、以及所述步骤4)所得HBsAg/anti-HBs复合物体系中的游离HBsAg的量，由此得到所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的HBsAg/anti-HBs复合物的量。

(12)根据(10)所述的方法，其中步骤i)所述的洗脱在与步骤5)所述的洗脱相同的条件下进行。

(13)根据(2)所述的方法，其中在步骤5)中，还包括收集含有游离IgG的流穿峰c，检测该流穿峰c中的蛋白量，以得到所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的游离IgG的量。

(14)根据(1)-(13)中任一项所述的方法在免疫复合物型乙型肝炎疫苗的质量控制中的应用。

本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：

本发明通过两步层析，实现了在不改变溶液体系的情况下，分 别对HBsAg/anti-HBs复合物、游离HBsAg、游离IgG含量的检测。本发明的方法构思巧妙、步骤简单、操作方便快速，并且经验证，该方法重复性、精密度良好。因此，适合应用于免疫复合物型乙肝疫苗的质量控制。

附图说明

图1为MabSelect SuRe亲和层析图谱。A为HBsAg溶液层析图谱；B为HBIG溶液层析图谱；C为加过量抗原复合物层析图谱。

图2为Capto^TM>

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明的目的在于提供一种检测HBsAg/anti-HBs复合物体系中有效成分的量的方法，以应用于复合物型乙型肝炎疫苗的质量控制。

如上文所述，由于抗原抗体反应为可逆的动态平衡反应，因此对免疫复合物型乙肝疫苗中的有效成分HBsAg/anti-HBs复合物和游离HBsAg的精确定量检测是一难点。

通过对免疫复合物型乙型肝炎疫苗体系的深入研究，以及对各种分离分析方法的仔细研究和大量实验摸索，本发明的发明人发现：

HBsAg在溶液中以病毒样颗粒(virus like particle，VLP)的形式存在，相对分子量为2,400kD，直径为22.8±0.4nm。anti-HBs的相对分子量为150kD，直径为5～10nm。由于疫苗原液中的游离HBsAg和HBsAg/anti-HBs复合物的分子量以及颗粒大小差异不显著，因此利用分子筛原理的凝胶过滤层析无法将HBsAg/anti-HBs复合物和游离HBsAg有效分离。此外，凝胶层析的回收率较低，不适合用于疫 苗的质量控制。

当利用HPLC的空间排阻色谱法进行分离时，结果显示分离度小于1.5，也不能将抗原抗体复合物体系中各组分完全分离。又考虑到HBsAg/anti-HBs复合物与游离HBsAg具有沉降系数的差异，因此分别利用PEG沉淀和密度梯度离心等方法，试图将其分离。然而，HBsAg/anti-HBs复合物与游离HBsAg的沉降系数差异不明显，存在范围交叠，因此很难做到精确分离。

基于以上发现，本发明的发明人进一步惊奇地发现，采用两步层析的方法进行组合检测，可以实现对HBsAg/anti-HBs复合物含量及游离HBsAg含量的精确定量。

由此，本发明提供了一种检测HBsAg/anti-HBs复合物体系中有效成分的量的方法，包括：

1)提供HBsAg/anti-HBs复合物体系，该体系包含HBsAg/anti-HBs复合物、游离IgG和游离HBsAg；所述有效成分为所述游离HBsAg和所述HBsAg/anti-HBs复合物；

2)对所述HBsAg/anti-HBs复合物体系进行亲和层析，其中所述亲和层析的介质能够吸附HBsAg/anti-HBs复合物和游离IgG；收集含有游离HBsAg的流穿峰a；

3)提供参照HBsAg溶液，所述参照HBsAg溶液含有与所述HBsAg/anti-HBs复合物体系的HBsAg总量相同的HBsAg；对所述参照HBsAg溶液进行所述亲和层析，收集含有HBsAg的流穿峰b；

4)特异性地检测流穿峰a中的游离HBsAg的量a，以及流穿峰b中的HBsAg的量b，用量a、量b、以及所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的HBsAg总量，计算所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的游离HBsAg的量；

为了进一步检测HBsAg/anti-HBs复合物体系中的HBsAg/anti-HBs复合物的量，所述方法还包括：

5)对HBsAg/anti-HBs复合物体系进行亲和层析，其中所述亲和层析的介质能够吸附HBsAg/anti-HBs复合物和游离HBsAg；将吸附于层析介质上的HBsAg/anti-HBs复合物和游离HBsAg洗脱下来，收 集含有该HBsAg/anti-HBs复合物和该游离HBsAg的洗脱峰a；

6)检测所述洗脱峰a中的蛋白量，用该蛋白量和步骤4)所得HBsAg/anti-HBs复合物体系中的游离HBsAg的量，计算所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的HBsAg/anti-HBs复合物的量。

在步骤1)中，可以根据已知的方法配制HBsAg/anti-HBs复合物体系。在该复合物体系中，HBsAg的总量和HBIG的总量通常是已知的，即为配制时的使用量。在下文中，“HBsAg/anti-HBs复合物体系”还简称为“复合物体系”。

在免疫复合物型乙型肝炎疫苗中，铝佐剂吸附之后的疫苗半成品或成品在采用去污剂解吸附之后，抗原抗体复合物会解离，HBsAg颗粒会解离，此时检测的有效成分含量并不能真实反应其在疫苗中的实际含量。因此，本发明优选采用疫苗原液(即“加过量抗原复合物”)作为所述HBsAg/anti-HBs复合物体系，对其中的HBsAg/anti-HBs复合物及游离HBsAg的含量的进行检测，这样更加有利于进行疫苗质量控制。

在本发明的步骤2)中，采用亲和层析介质对HBsAg/anti-HBs复合物体系进行亲和层析，利用层析介质与IgG结合的特性，所述复合物溶液体系中的游离IgG与HBsAg/anti-HBs复合物可以吸附在层析介质上，而游离HBsAg则存在于流穿峰中。由于流穿峰中除游离HBsAg之外，还可能存在HBIG中除IgG之外的成分干扰，因此无法通过直接检测蛋白含量来测定游离HBsAg在所述体系中的含量。

由于在HBsAg/anti-HBs复合物体系中，HBsAg的总量已知(例如可以为120μg/ml)，因此本发明将含有相同量的同批次HBsAg的参照溶液进行与所述复合物体系同样的亲和层析，收集流穿峰。然后，采用免疫学方法特异性地对两者的流穿峰中的HBsAg抗原进行定量检测。这样，用所得的复合物体系的流穿峰中HBsAg的量(量a)、参照溶液的流穿峰中HBsAg的量(量b)、以及复合物体系中的HBsAg总量，即可精确地计算得到复合物体系中的游离HBsAg的量。

在一个实施方案中，在步骤4)中，计算量a比量b的比值，并 计算该比值与所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的HBsAg总量的乘积，由此得到所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的游离HBsAg的量。

优选地，步骤2)和3)中所述的亲和层析为蛋白A亲和层析。

还优选地，在步骤4)中，采用免疫学方法特异性地检测所述量a和所述量b。免疫学方法基于抗原抗体间的特异性反应进行特异性检测，其包括但不限于化学发光法、酶联免疫吸附法、磁微粒化学发光法等。

进一步地，通过第二步层析，还可以对HBsAg/anti-HBs复合物体系中的HBsAg/anti-HBs复合物进行准确定量。

因此，进一步地，本发明的方法还包括采用能够吸附游离HBsAg及HBsAg/anti-HBs复合物的层析介质对复合物体系进行层析，游离HBsAg及HBsAg/anti-HBs复合物会吸附于层析介质上，游离IgG流穿。通过将吸附于层析介质上的HBsAg及HBsAg/anti-HBs复合物洗脱下来，并对洗脱峰进行蛋白含量检测，用该蛋白量和步骤4)所得复合物体系中的游离HBsAg的量，即可准确计算所述复合物体系中的HBsAg/anti-HBs复合物的量。

在一个实施方案中，在步骤6)中，用所述蛋白量减去步骤3)所得HBsAg/anti-HBs复合物体系中的游离HBsAg的量，由此得到所述HBsAg/anti-HBs复合物体系中的HBsAg/anti-HBs复合物的量。

优选地，步骤5)中所述的亲和层析为肝素(Heparin)亲和层析。肝素含有硫酸基团，可以结合病毒的外膜蛋白，利用该性质，肝素亲和层析吸附了复合物体系中的HBsAg/anti-HBs复合物和游离的HBsAg，而使游离的IgG流穿。

由于在HBsAg/anti-HBs复合物体系中，HBIG的总量也是已知的，因此，优选地，为了得到更加精确的结果，本发明还包括i)将含有相同量的同批次HBIG的参照HBIG溶液与所述复合物体系进行与步骤5)同样的亲和层析，可以用与步骤5)相同的条件将非特异性吸附于层析介质上的IgG洗脱下来，收集洗脱峰，并对该洗脱峰进行蛋白含量检测，即得到能够非特异性吸附于层析介质上的IgG的量。用步骤6)所测得的洗脱峰a中的蛋白量减去非特异性吸附的IgG的量，再用所得值计算复合物体系中的HBsAg/anti-HBs复合物的量，由此消除了复合物体系中非特异性吸附的游离IgG的干扰。

从亲和层析介质上将HBsAg及HBsAg/anti-HBs复合物、以及非特异性吸附的IgG洗脱下来可以使用磷酸盐缓冲液，例如用10mMPB配制的2M NaCl缓冲液。

在本发明方法的上述步骤5)中，还可收集流穿峰，并对流穿峰进行蛋白含量检测，即可获得复合物体系中游离IgG的含量。

本发明的另一个方面提供了本发明所述的方法在免疫复合物型乙型肝炎疫苗的质量控制中的应用。

以下通过实施例的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些实施例不应被理解为对本发明保护范围的限制。

实施例

实施例所用材料和仪器的来源如下：

MabSelect SuRe亲和层析介质得自GE Healthcare

AKTA prime Plus层析仪得自GE Healthcare

XK16/20层析柱得自GE Healthcare

HBsAg得自北京天坛生物制品股份有限公司

HBIG得自成都蓉生药业有限责任公司

抗人IgG(Fc特异性)过氧化物酶抗体得自Sigma公司

AKTApurifier蛋白层析系统得自GE Healthcare

Capto^TM>

Lowry法低蛋白含量测定试剂盒得自上海荔达生物科技有限公司

乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒(化学发光法)得自郑州安图生物工程股份有限公司

实施例所用溶液配制如下：

1.PBS(pH7.4，0.02M)：0.593g>2PO₄·2H₂O，5.8gNa₂HPO₄·12H₂O和8.775gNaCl，加纯水完全溶解定容至1L，0.45μm>

2.样品处理液(二乙醇胺-Triton X-100)：

20％二乙醇胺(DEA)母液配制：2mL DEA加入8mL PBS(pH7.4，0.02M)混匀，室温避光保存；

10％Triton X-100母液配制：1mL Triton X-100加入9mL PBS(pH7.4，0.02M)混匀，室温保存；

样品处理液：20％DEA母液1.25mL，10％Triton X-100母液0.2mL，PBS(pH7.4，0.02M)8.55mL混匀，室温避光存放。

3.10mM PB：

0.2M>2PO₄：31.2g>2PO₄·2H₂O，纯水完全溶解定容至1000mL，0.45μm滤膜过滤，室温保存；

0.2M>2HPO₄：71.6g>2HPO₄·12H₂O，纯水完全溶解定容至1000mL，0.45μm滤膜过滤，室温保存；

10mM PB(pH 7.4)：取0.2M>2PO₄ 19mL，0.2M>2HPO₄89mL，纯水定容至2000mL。

4.“加过量抗原复合物”：

根据“配比试验”所确定的比例，将20mL的HBsAg与13.9mL的HBIG混合，37℃孵育1小时，2-8℃过夜。再加入20ml HBsAg，用生理盐水调整HBsAg浓度到120μg/mL，此时HBIG的浓度为37.14mg/mL。

实施例1.“加过量抗原复合物”及单独HBsAg亲和层析

采用MabSelect SuRe亲和层析介质，AKTA prime Plus层析仪，XK16/20层析柱进行亲和层析。将供试品“加过量抗原复合物”(HBsAg总量为120μg/mL，HBIG总量为37.14mg/mL)上样，用2mL上样环，上样体积2mL，结合缓冲液为PBS，层析流速为2mL/分钟；收集流穿峰90mL，待紫外检测峰回到基线，用0.1M pH3.0甘氨酸-HCl溶液进行洗脱。参照为单纯HBsAg生理盐水溶液(HBsAg浓度为120μg/mL)，上样同“加过量抗原复合物”，收集流穿峰。

实施例2.流穿峰中HBsAg抗原含量检测

采用化学发光法(乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒(化学发光法))分别进行“加过量抗原复合物”及单纯HBsAg流穿峰中HBsAg抗原含量的检测：检测样品及标准品取0.2mL，加入0.2mL样品处理液(二乙醇胺-Triton X-100)，室温避光处理30分钟；用2％BSA，将单纯HBsAg流穿峰进行200倍稀释,加过量抗原复合物流穿峰进行100倍稀释，标准品进行系列稀释(160ng/mL、80ng/mL、40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL和1.25ng/mL)，标准曲线从160ng/mL到1.25ng/mL。将50μL稀释后待检样品及标准品加入酶标板中，按照试剂盒说明书检测。以标准品浓度的对数及对应发光值的对数做直线拟合，得到标准曲线，样品的发光值对数根据标准曲线中求出相应浓度对数，再进行反对数求得检测样品的浓度。

实施例3.“游离HBsAg”含量计算

游离HBsAg含量(μg/mL)＝加过量抗原复合物流穿峰HBsAg含量/参照HBsAg溶液流穿峰HBsAg含量×100％×120μg/mL＝40.35μg/mL/147.20μg/mL×100％×120μg/mL＝32.89μg/mL

实施例4.“游离HBsAg含量”检测方法专属性验证

(1)MabSelect SuRe亲和层析柱上样HBsAg：用生理盐水将同批次HBsAg蛋白浓度稀释到120μg/mL，进行MabSelect SuRe亲和层析。收集所有流穿峰，精确定量流穿溶液体积，化学发光法检测上样前后溶液中HBsAg含量，计算HBsAg的回收率为83％左右。

从图1(A)可以看出，HBsAg基本全部流穿出层析介质(保留时间14.08分钟)。再用0.1M pH3.0甘氨酸-HCl进行洗脱，洗脱后没有HBsAg峰出现，说明MabSelect SuRe亲和层析介质对HBsAg非特异性吸附非常低。

(2)MabSelect SuRe亲和层析介质上样HBIG：用生理盐水将同批次HBIG浓度稀释到与加过量抗原复合物中浓度相同，上样体积2mL，收集所有流穿峰(保留时间28.70分钟)，再用0.1M pH3.0甘氨酸-HCl进行洗脱，收集洗脱峰。用ELISA方法(双抗原夹心法)检测流穿峰中的anti-HBs，结果为阴性；采用ELISA方法检测流穿峰中的人IgG(采用抗人IgG(Fc特异性)过氧化物酶抗体)，结果为阴性。

以上结果证明在此条件下，HBIG中的所有IgG均被MabSelectSuRe亲和层析介质吸附，流穿峰中没有anti-HBs，也没有人IgG。图1(B)层析图谱中可见一小峰，分析可能为痕量的IgM、IgA或人血白蛋白。

(3)MabSelect SuRe亲和层析介质分离加过量抗原复合物：用生理盐水将加过量抗原复合物稀释到HBsAg蛋白浓度为120μg/mL，上样体积2mL，收集所有流穿液体，再用0.1MpH3.0甘氨酸-HCl进行洗脱，收集洗脱液。用ELISA方法检测流穿峰和洗脱峰中的HBIG，检测流穿液中的HBsAg抗原含量。结果证明流穿峰中没有anti-HBs，所有anti-HBs均在洗脱液中，由此初步证明加过量抗原复合物在洗脱液中，而不在流穿峰中。加过量抗原复合物溶液的流穿峰1位置(保留时间14.62分钟)与单纯HBsAg流穿峰位置(保留时间14.08分钟)一致，说明流穿峰1即为加过量抗原复合物中的游离HBsAg；检测该流穿液中的HBsAg抗原含量，即可初步确定为加过量抗原复合物中游离HBsAg的含量。流穿峰2与单独HBIG层析时流穿峰位置一致。峰3为洗脱峰。

实施例5.“游离HBsAg含量”检测方法重复性验证

同一批样品在与实施例1和2相同的情况下，连续3天，每天测定1次，结果如下。

表1重复性(n＝3)

注：CV审定标准为≤30％

实施例6.“游离HBsAg含量”检测方法中间精密度验证

不同人员测定精密度：三名人员对同一批样品按照实施例1和2的方法进行检测，结果如下。

表2同一批样品三名人员检测结果(n＝3)

注：CV审定标准为≤30％

同一人员按照实施例1和2的方法对用三批HBsAg在不同时间以相同的配制工艺制备的加过量抗原复合物进行三次重复检测，结果 如下。

表3中间精密度(n＝3)

注：CV审定标准为≤30％

实施例7.Capto^TM>

AKTApurifier蛋白层析系统，XK16/20层析柱，Capto^TM>

实施例8.蛋白浓度检测及计算

采用Lowry法低蛋白含量测定试剂盒分别检测加过量抗原复合 物的洗脱峰和流穿峰的蛋白含量、以及HBIG对照样品的洗脱峰和流穿峰的蛋白含量，按照试剂盒说明书检测。标准品进行系列稀释，标准品浓度梯度为20μg/mL、15μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、0μg/mL，按照试剂盒说明书检测。

结果计算：

HBsAg/anti-HBs复合物含量＝(加过量抗原复合物溶液洗脱峰蛋白量-HBIG洗脱峰蛋白量)-游离HBsAg含量＝(262.6μg/mL-80.56μg/mL)-32.89μg/mL＝149.15μg/mL

游离IgG含量＝加过量抗原复合物溶液流穿峰蛋白含量×流穿峰体积/1mL/1000＝283μg/mL×120mL/1mL/1000＝33.96mg/mL

实施例9.“HBsAg/anti-HBs复合物”检测方法专属性验证

HBsAg对照样品、HBIG对照样品、加过量抗原复合物分别进行Capto^TM>

(1)单独HBsAg溶液层析

HBsAg对照样品进行Capto^TM>

由图2(A)可见，单独HBsAg进行Capto^TM>TM>

(2)单独HBIG溶液层析

HBIG对照样品进行Capto^TM>

由图2(B)可见，单独HBIG进行Capto^TM>

上样前蛋白量为24330μg，流穿峰蛋白量为24758.4μg，洗脱峰蛋白量为14.52μg。HBIG的蛋白回收率为101.82％。说明HBIG中绝大部分IgG直接流穿或是经5％B液洗脱下来，只有极少部分的IgG被Capto^TM>

(3)加过量抗原复合物层析

加过量抗原复合物进行Capto^TM>

由图2(C)可见，加过量抗原复合物进行Capto^TMHeparin层析，可见流穿峰；5％B液洗脱后，可见蛋白峰；100％B液洗脱后，可见较小蛋白峰。峰1、峰2样品合并，记为“流穿峰”；峰3记为“洗脱峰”。采用Lowry法分别对上样前、流穿峰及洗脱峰样品进行蛋白浓度检测，并计算蛋白量。上样前蛋白量为25048μg，流穿峰蛋白量为26464.8μg，洗脱峰蛋白量为95.76μg。加过量抗原复合物的蛋白回收率为106％。结合图2A、2B、2C进行分析：峰1、峰2为游离的IgG峰，峰3主要为HBsAg/anti-HBs复合物和游离的HBsAg，除此之外，还应该含有极少量的非特异性吸附的IgG。因此在进行HBsAg/anti-HBs复合物含量计算时，应该用峰3总的蛋白量减去游离HBsAg的量(通过MabSelect>TMHeparin层析，检测峰3蛋白含量测得)。

表4 Lowry法检测溶液蛋白浓度

实施例10.“HBsAg/anti-HBs复合物”检测方法重复性验证

同一批样品在相同的情况下，按照实施例7和8的方法，连续3天，每天测定1次，结果如下。

表5重复性结果

注：CV审定标准为≤30％

实施例11.“HBsAg/anti-HBs复合物”检测方法精密度验证

不同人员测定精密度：三名人员按照实施例7和8的方法对同一批样品进行检测，结果如下。

表6同一批样品三名人员检测结果(n＝3)

注：CV审定标准为≤30％。

同一批样品三名人员检测结果(HBsAg/anti-HBs复合物含量：μg/mL)。

表7同一批样品三名人员检测结果(n＝3)

注：CV审定标准为≤30％。

同一人员对三批样品(采用三批HBsAg在不同时间以相同的工艺制备的“加过量抗原复合物”)进行三次重复检测，结果如下。

表8中间精密度(游离IgG含量：mg/mL，n＝3)

注：CV审定标准为≤15％。

表9中间精密度(HBsAg/anti-HBs复合物含量：μg/mL，n＝3)

注：CV审定标准为≤30％

实施例12.“HBsAg/anti-HBs复合物”检测方法准确性验证

在无“加过量抗原复合物标准物质”(即疫苗原液标准品)的情况下，选取一批免疫复合物型乙型肝炎疫苗原液(即“加过量抗原复合物”)，加入高、中、低三种浓度的HBsAg溶液，对所得溶液按照实施例7进行Capto^TM>

具体而言，将“加过量抗原复合物”溶液分为体积相同的6份，其中3份加入高、中、低不同量的HBsAg样品，制成HBsAg加入浓度不同的3个回收样本；在另3份“加过量抗原复合物”溶液中对应加入同样体积的生理盐水，制成3个基础样本。3份回收样本及相对应的基础样本采用Capto^TM>

基础样本浓度为基础样本经Capto^TM>

回收样本浓度为回收样本经Capto^TM>

回收样本中HBsAg/anti-HBs复合物含量和HBsAg蛋白含量＝回收样本浓度×洗脱峰体积/上样体积-HBIG洗脱峰浓度/上样体积；

基础样本中HBsAg/anti-HBs复合物含量和HBsAg蛋白含量＝基础样本浓度×洗脱峰体积/上样体积-HBIG洗脱峰浓度/上样体积；

回收样品和基础样品的差别在于前者又加入了部分HBsAg，所以二者之差即回收HBsAg浓度，即加入的HBsAg实际检测到的量。

加入HBsAg浓度为向“加过量抗原复合物”中所加入的HBsAg样品的浓度(即加入的HBsAg浓度理论值)。

回收率％＝回收HBsAg浓度/加入HBsAg浓度×100％

表10加入不同浓度HBsAg回收率

结果表明：利用Capto^TM>