检测登革热、基孔肯尼亚和麻疹病毒的引物探针组及方法

摘要

本发明公开了重组酶聚合酶扩增检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒引物探针组和试剂盒及检测方法，包括具有SEQ ID NO.1‑6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7‑9所示核苷酸序列的探针。本公开还提供了一种重组酶聚合酶扩增检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒的试剂盒，所述试剂盒包括本公开所述的引物探针组。通过上述技术方案本公开显著地提高了对登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒检测的敏感性、特异性和简便性。

说明书

技术领域

本公开涉及生物技术领域，具体地，涉及一种检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒的引物探针组及试剂盒和检测方法。

背景技术

登革热病毒属于黄病毒科(Flaviviruses)、黄病毒属(FlaviviruS)，为RNA病毒，常引起登革热急性传染病。登革热患者通常急性起病，首发症状为发热，可伴畏寒，24小时内体温可达40℃。部分病例发热3-5天后体温降至正常，1-3天后再度上升，称为双峰热型。发热时可伴头痛，全身肌肉、骨骼和关节疼痛，明显乏力，并可出现恶心，呕吐，腹痛，腹泻等胃肠道症状。基孔肯尼亚病毒(Chikungunya virus，CHIKV)属披膜病毒科甲病毒属的Semliki forest(SF)抗原复合群。基孔肯尼亚病毒感染人体后起病较急，潜伏期1-12天，通常3-7天，随后表现为突发高热、关节疼痛、皮疹，皮疹常见于面部或四肢伸展侧。麻疹病毒(measles virus)是麻疹的病原体，属于副粘病毒科麻疹病毒属。传染性很强，以皮丘疹、发热及呼吸道症状为特征。

根据流行病学史、临床表现及实验室检查结果，可作出登革热病毒的诊断。即使在流行病学史不详的情况下，根据临床表现、辅助检查和实验室检测结果也可作出诊断。但是由于登革热病毒引发的临床表现多样，与基孔肯尼亚热病毒导致的发热伴出血疾病和麻疹引起发热伴皮疹疾病难以区分鉴定。加之基孔肯尼亚病毒和登革热病毒是蚊媒病毒，其特殊的传播方式导致先前的研究集中在登革热病毒和基孔肯尼亚病毒的鉴别上，从而忽略了与麻疹病毒相似的早期临床症状。在实际临床工作中，由于三种病毒具有不同的毒力，且具备一定的传染性，因而快速诊断登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒就成为早期诊断和治疗的关键。建立快速、准确、简便、特异的登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒的多重快速现场检测技术，对病例的快速识别、诊断和治疗具有重要意义。

发明内容

本公开的目的是解决现有技术检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒时所存在的问题，提供一种登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒的检测引物探针和试剂盒，并建立一种基于重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术的登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒的快速、灵敏、特异，简便的检测方法。

为了实现上述目的，本公开的第一个方面提供重组酶聚合酶扩增检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒引物探针组，其中，包括具有SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列的探针；

其中，SEQ ID NO.7所示核苷酸序列中，自5’端起第30位碱基标记有FAM发光基团，第31位碱基后连接脱碱基位点，第33位碱基标记淬灭基团BHQ1，3’末端标记有磷酸盐基团；SEQ ID NO.8所示核苷酸序列中，自5’端起第32位碱基标记有VIC发光基团，第33位碱基后连接脱碱基位点，第35位碱基标记淬灭基团BHQ1，3’末端标记有磷酸盐基团；SEQ ID NO.9所示核苷酸序列中，自5’端起29位碱基标记有CY5发光基团，第31位碱基后连接脱碱基位点，第32位碱基标记淬灭基团BHQ3，3’末端标记有磷酸盐基团。

本公开的第二个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总RNA；

(2)以所述总RNA为模板，并使用本公开第一个方面所述的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；

(3)收集FAM、VIC和CY5检测通道荧光信号，得到检测结果：

a)若FAM荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有登革热病毒；

b)若VIC荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有基孔肯尼亚病毒；

c)若CY5荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有麻疹病毒。

本公开的第三个方面提供一种重组酶聚合酶扩增检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本公开第一个方面所述的引物探针组。

本发明的有益效果在于：

本公开建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒的三重检测方法，能够实现形态学、免疫学、LAMP以及单重实时荧光检测所无法完成的快速、全面、敏感、特异、自动的结果判定，达到如下的检测效果：

(一)耗时短

逆转录重组酶聚合酶扩增技术(RT-RPA)不需将RNA转化为cDNA再进行扩增反应，只需要将RPA体系与逆转录酶混合，构建RT-RPA反应体系，就可直接以RNA为模板，实现逆转录与检测过程的一体化。整个反应20min即可完成，而RT-PCR、Real-time PCR、LAMP等技术仅逆转录过程就需要10-30min的时间，整个反应需要60-90min才可完成。

(二)对仪器平台要求低

RPA反应可在常温下进行，不需要配备专门的热循环扩增仪，更好的实现了登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒的现场应急检测。

(三)特异性好

RPA可识别引物结合区的SNP，使得其对非检测目标有极强的辨识能力，而LAMP和普通Real-time PCR则无法识别SNP，这使得RPA检测的特异性明显优于LAMP和Real-timePCR。本发明所建立的检测方法特异性还体现在一整套引物探针的特异性。所有引物探针都经过Blast比对分析，具有高度的保守性和特异性；同时经过特异性实验验证能够很好的区分包括黄热病毒、西尼罗病毒、森林脑炎病毒(森张株、牡丹江株)、乙型脑炎病毒、马尔堡病毒、风疹病毒等的核酸，证明检测方法具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来。

(四)最低检出限

本发明所建立的检测方法的最低检出限可达到10拷贝/反应。

(五)成本较低

本发明所建立的通过重组酶聚合酶等温扩增技术检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒的方法在操作性上降低了人力成本和时间成本。该方法无需复杂高端仪器，反应条件仅为一步，无需复杂操作。

(六)预防假阴性结果

本发明反应体系中添加的阳性内质控(IAC)，可以有效的提示因为操作失误、PCR抑制物等原因造成的假阴性检测结果。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开提供了一种重组酶聚合酶扩增检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒引物探针组，包括具有SEQ ID NO.1-6所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.7-9所示核苷酸序列的探针；

其中，SEQ ID NO.7所示核苷酸序列中，自5’端起第30位碱基标记有FAM发光基团，第31位碱基后连接脱碱基位点，第33位碱基标记淬灭基团BHQ1，3’末端标记有磷酸盐基团；SEQ ID NO.8所示核苷酸序列中，自5’端起第32位碱基标记有VIC发光基团，第33位碱基后连接脱碱基位点，第35位碱基标记淬灭基团BHQ1，3’末端标记有磷酸盐基团；SEQ ID NO.9所示核苷酸序列中，自5’端起第29位碱基标记有CY5发光基团，第31位碱基后连接脱碱基位点，第32位碱基标记淬灭基团BHQ3，3’末端标记有磷酸盐基团。

上述引物组适用于重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)，RPA是模拟生物体内DNA复制、基于重组酶、聚合酶介导的扩增原理发展而来。重组酶和引物形成微丝在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single strand DNA-binding protein，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，引物与模板DNA开始配对形成复制所需的3’羟基末端，在DNA聚合酶的作用下，在25-43℃进行复制延伸，形成新的DNA互补链。随着反应进行，反应产物以指数级增长，5-20min即可完成检测。与常规PCR反应不同的是，RPA反应所需引物长度通常为30-38nt。引物序列的设计与选择对RPA的结果至关重要，其长度的增加也使引物设计及选择难度增加。本发明中提供的引物组在适宜的引物浓度条件下，可以互不影响的在一次扩增中同时检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒，多重检测时每个目标最低检出限均达到5拷贝/体系。

与引物配套使用的探针在设计过程中，不仅考虑到了不同目标基因在一个反应体系中共扩增的问题，还考虑到了要避免探针出现发夹结构、引物二聚体等多种影响因素，本发明中的探针混合物能够全面覆盖登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒，特异性良好并且覆盖度高。

在RPA扩增体系中，本发明提供的上述探针混合物与引物组配合使用可以实现模板扩增的实时监控，所述探针其中两个碱基上各标记一个荧光基团和淬灭基团，在两个基团之间有脱碱基位点(dSpacer)，该位点可被来自大肠杆菌的3’-5’核酸外切酶识别，可以使两个基团分离，从而使荧光信号与扩增产物的累积相同步，这样结合荧光扩增检测仪便可在10-20分钟内检测到荧光曲线。

在本公开所提供的引物探针组中：

检测登革热病毒的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.7所示。

检测基孔肯尼亚病毒的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.8所示。

检测麻疹病毒的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.9所示。

检测阳性内质控的上下游引物和探针的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12所示。其中，SEQ ID NO.12所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有ROX发光基团，第22位碱基后连接脱碱基位点，第25位碱基标记淬灭基团BHQ2，3’末端标记有磷酸盐基团。

在本公开的一种实施方式中，涉及一种重组酶聚合酶扩增(PRA)检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒的检测方法，其中，所述检测方法包括如下步骤：

(1)提取待测样本的总RNA；

(2)以所述总RNA为模板，并使用本公开第一个方面所提供的引物探针组，进行重组酶聚合酶扩增反应；

(3)收集FAM、VIC和CY5检测通道荧光信号，得到检测结果；

a)若FAM荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有登革热病毒；

b)若VIC荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有基孔肯尼亚病毒。

c)若CY5荧光通道有扩增曲线，则判定样品中含有麻疹病毒。

在本公开的一种实施方式中，用于进行内质控样本检测的引物探针为SEQ IDNO.10-11所示核苷酸序列的引物，以及，含有SEQ ID NO.12所示核苷酸序列的探针；并且，SEQ ID NO.12所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有ROX发光基团，第22位碱基后连接脱碱基位点，第25位碱基标记淬灭基团BHQ2，3’末端标记有磷酸盐基团。

在本公开的一种实施方式中，每条引物的最终使用浓度各自为0.3-0.5μM，每条探针的最终使用浓度各自为0.08-0.15μM。

在本公开的一种实施方式中，RPA反应的条件包括在37-42℃下恒温扩增20-30min。在本公开的一种特别优选的实施方式中，为了提高反应的灵敏度及特异性，RPA反应的条件包括在39℃下恒温扩增20min。

本公开的检测方法的直接目的不是获得诊断结果和健康状况，而只是对已经脱离人体或动物体的样品进行检测，所获得的仅仅是作为中间结果的信息。

本公开还提供了一种重组聚合酶扩增检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒的试剂盒，所述试剂盒含有前述RPA检测引物探针组。

优选的，所述试剂盒中还含有内质控序列模板。

在本公开的一种实施方式中，所述试剂盒还包括阳性内质控、逆转录酶、反应体系缓冲液、DNA重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、3’-5’核酸外切酶、dNTP和水中的至少一种。

以下，通过实施例进一步详细说明本公开。

以下实施例中试剂均为商购产品，引物、探针均在上海生工生物技术有限公司合成。

实施例1引物、探针合成

本公开的引物探针组选择特异性的检测基因或保守序列，需要保证引物探针区段分别能够全面覆盖登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒病毒。而且设计过程中要充分考虑不同目标基因的引物探针在一个反应体系内共扩增的问题，因此，引物探针设计时要综合的考虑到Tm值一致性、GC含量均一化，同时尽可能避免出现发夹结构、引物二聚体等情况，而由于RPA对引物长度要求为30-38nt，探针最长45nt，这样的序列容易在恒温条件下产生大量的引物二聚体从而影响实验效果，因此也对引物的设计提出了更高的要求，以保证后期不同引物探针同时扩增的概率。最终获得本公开提供的一套特异的引物探针序列(如表1所示)。

按照表1所示引物、探针序列，进行序列合成。序列中Y代表简并碱基T/C；R代表简并碱基A/G；探针中ROX、FAM、VIC、CY5为荧光基团，BHQ1、BHQ2、BHQ3为淬灭基团，均用于修饰T碱基；在探针的3’末端还连接有磷酸基团(phosphate)。

表1登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒RPA检测引物探针汇总表

检测登革热病毒的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.7所示。

检测基孔肯尼亚病毒的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQID NO.4、SEQ ID NO.8所示。

检测麻疹病毒的上下游引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.9所示。

检测阳性内质控的上下游引物和探针的核苷酸序列分别由SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11、SEQ ID NO.12所示。其中，SEQ ID NO.12所示核苷酸序列中，自5’端起第19位碱基标记有ROX发光基团，第22位碱基后连接脱碱基位点，第25位碱基标记淬灭基团BHQ2，3’末端标记有磷酸盐基团。

实施例2特异性验证：

选择体外转录的黄热病毒、西尼罗病毒、森林脑炎病毒(森张株、牡丹江株)、乙型脑炎病毒、马尔堡病毒风疹病毒作为特异性评估样本。每种样本核酸浓度为0.001ng/μL，将上述每个样本的核酸混合作为特异性检测模板，利用表1的引物探针组合及表2的终浓度进行RPA扩增。

表2登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒引物及探针终浓度

目标引物终浓度探针终浓度登革热病毒0.4μM0.1μM基孔肯尼亚病毒0.4μM0.1μM麻疹病毒0.4μM0.1μM

RPA反应体系配置：总体系50μL，向含有RPA冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo(货号：TAEXO02KIT)反应管中加入再水化缓冲液29.5μL，醋酸镁溶液2.5μL(280mmol/L)，引物各2μL(10μM)，探针0.5μL(10μM)，逆转录酶1μL(200U/μL)，模板5μL，剩余用水补足。

RPA反应的反应条件：选择FAM、VIC、CY5和ROX作为报告基团，RPA反应程序如下：39℃10s，39℃10s，39℃10s(收集荧光)，40个循环。

RPA反应结果判断：空白对照、IAC和阴性对照成立，否则视实验结果无效；若FAM通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.1-2的引物对和SEQ ID NO.7的探针有非特异性扩增；若VIC通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.3-4的引物对和SEQ ID NO.8的探针有非特异性扩增；若CY5通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.5-6的引物对和SEQ ID NO.9的探针有非特异性扩增。

结果显示FAM、VIC和CY5通道均未出现非特异性扩增。

实施例3最低检出限验证：

用限制性内切酶SpeI和PvuII酶切重组有登革热病毒、基孔肯尼亚病毒及麻疹病毒基因序列的标准品质粒，将其线性化并进行体外转录；选取初始浓度为10⁴拷贝/μL转录产物等比例混合后梯度稀释作为模板I，分别稀释为10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10拷贝/μL、2拷贝/μL和1拷贝/μL作为模板II、III、IV、V、VI。体系配制和RPA反应条件同实施例2特异性评估。使得在反应体系中，病毒的浓度分别为5×10⁴拷贝/体系、5×10³拷贝/体系、5×10²拷贝/体系、50拷贝/体系、10拷贝/μL和5拷贝/体系。

RPA反应结果判断：空白对照、IAC和阴性对照成立，否则视实验结果无效；若FAM通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.1-2的引物对和SEQ ID NO.7的探针可检测出该浓度的模板；若VIC通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.3-4的引物对和SEQ ID NO.8的探针可检测出该浓度的模板；若CY5通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.5-6的引物对和SEQ ID NO.9的探针可检测出该浓度的模板。

结果显示本试剂盒对于目标的最低检出限均达到了5拷贝/体系。

实施例4覆盖度验证：

分别选择10株体外转录的登革热病毒(来自国家CDC，2006)、基孔肯尼亚病毒(来自国家CDC，2001)及麻疹病毒核酸作为覆盖度评估用模板(来自国家CDC，2009)，核酸检测浓度为0.001ng/μL，体系配制和RPA反应条件同实施例2特异性评估。

RPA反应结果判断：空白对照、IAC和阴性对照成立，否则视实验结果无效；若FAM通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.1-2的引物对和SEQ ID NO.7的探针可检测出该模板；若VIC通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.3-4的引物对和SEQ ID NO.8的探针可检测出该模板；若CY5通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.5-6的引物对和SEQ ID NO.9的探针可检测出该模板。

结果显示本发明试剂盒对所有30株体外转录的毒株均可覆盖检测出。

实施例5试剂盒的保存期试验

以100拷贝/μL的登革热病毒、基孔肯尼亚病毒和麻疹病毒体外转录RNA作为评估用模板。

在第0天时，分装成10份冻存于-70℃冰箱中。将组建完毕的试剂盒放置于-20℃保存，分别取0、10、15、30、60、90、120、150、180和360天的试剂盒进行保存期试验。保存期检测结果如表3所示。

表3保存期试验结果

保存期登革热病毒基孔肯尼亚病毒麻疹病毒第0天+++第10天+++第15天+++第30天+++第60天+++第90天+++第120天+++第150天+++第180天+++第360天+++

由表3可知，试剂盒保存在-20℃冰箱，在不同保存期检测均为阳性，实验结果表明该试剂盒的保存期至少为一年。

对比例1

(1)引物、TAQMAN探针合成

根据表4所示的序列合成引物、探针序列。所述引物、探针用于多重实时荧光PCR(RT-PCR)检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒及麻疹病毒。

表4检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒及麻疹病毒的荧光PCR的引物探针汇总表

(2)特异性验证

选择体外转录的黄热病毒、西尼罗病毒、森林脑炎病毒(森张株、牡丹江株)、乙型脑炎病毒、马尔堡病毒、风疹病毒作为特异性评估样本。每种样本核酸浓度为0.001ng/μL，将上述每个样本的核酸混合作为特异性检测模板，进行RT-PCR扩增。

RT-PCR反应体系的配制：总体积为50μL，10μM引物每个2μL，10μM探针每个1μL，HSTaq DNA聚合酶1U，AWV RNA反转录酶0.4U，模板5μL，剩余用水补足。

RT-PCR反应程序：反转录50℃，15min；预变性95℃，10min；扩增40个循环95℃。15s，55℃，45s。

反应结果判断：若FAM通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.12-13的引物对和SEQ IDNO.15的探针有非特异性扩增；若VIC通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.16-17的引物对和SEQID NO.18的探针有非特异性扩增；若CY5通道有扩增曲线，则SEQ ID NO.19-20的引物对和SEQ ID NO.21的探针有非特异性扩增。

结果显示，以上反应均为阴性，对比例的引物和探针特异性高。

(3)最低检出限验证

使用浓度均为10⁵拷贝/μL的登革热病毒、基孔肯尼亚病毒及麻疹病毒核酸等比例混合后，梯度稀释至10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10拷贝/μL、2拷贝/μL及1拷贝/μL。按照以上所述反应体系分别加入模板，并按照以上所述的反应程序进行试验。

结果显示对比例对3种病毒的最低检出限为100拷贝/体系。

(4)覆盖度验证

分别选择10株体外转录的登革热病毒、基孔肯尼亚病毒及麻疹病毒核酸作为覆盖度评估用模板，核酸检测浓度为0.001ng/μL，根据如上所述RT-PCR反应体系和反应程序进行扩增。

结果显示Taqman探针对比例方案漏检1株登革热病毒转录毒株、2株基孔肯尼亚病毒转录毒株。

通过以上实施例和对比例的比较可以看出，本发明所建立的检测方法可以一次性的检测登革热病毒、基孔肯尼亚病毒及麻疹病毒，仅仅20min即可完成检测，而对比例的RT-PCR方法需要90min；本发明试剂盒可识别引物结合区的单核苷酸突变点，对非检测目标有极强的辨识能力；本发明试剂盒具有高度的特异性，能够将非检测目标准确区分开来，结构判断简易可靠；本试剂盒对于样本中的痕量核酸检测能力较强。

以上详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

序列表

<110> 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司

<120> 检测登革热、基孔肯尼亚和麻疹病毒的引物探针组及方法

<130> 7070ABT

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

tcaggccatc acaaatgcca cagcttgagc 30

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ttattgctgc gatttgtaag ggaggggtct c 31

<210> 3

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<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

gctgacagcg cctttttgaa ggccctgcaa c 31

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<211> 31

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

acatcatcct ccttgctggc ycactaccta t 31

<210> 5

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<212> DNA

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<400> 5

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cacaaaccat ggaagctgta cgcatggcgt agtggactag cggttagagg a 51

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<400> 9

catcttcacg tcgaaacaga ttgrtgcgtg atcccgatga tagatcatcc 50

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tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat c 31

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cagcccagta gtaggttgag gccg 24

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cttcgggctc atgagcgctt tgtttcggcg tggg 34

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tgtgtaagca gaatgttggc gt 22

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cctggacaga aacatctctg gaaagat 27

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<213> Artificial Sequence

<400> 19

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<212> DNA

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