骨肉瘤miRNA检测的内参基因的鉴定

摘要

本发明公开了在骨肉瘤病人中稳定表达的内参miRNA基因，包括hsa‑miR‑128a‑5p或者hsa‑miR‑128a‑5p和let‑7d构成的组合。该内参基因可以用于骨肉瘤病人miRNA检测中目标基因的标准化，可以实现不同实验室间研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理。

说明书

技术领域

本发明专利涉及到一种用于骨肉瘤miRNA检测的内参miRNA基因的鉴定。

背景技术

骨肉瘤(osteosarcoma，OSA)是常见的恶性骨肿瘤，由恶性增殖的肉瘤细胞直接产生肿瘤性骨样组织或不成熟骨，其组织学特点是增生的梭形肿瘤细胞直接产生骨样基质或不成熟骨，几乎所有骨肉瘤转移均经血液转移至肺，少数转移至脑、肾等内脏器官及经淋巴结转移。骨肉瘤的侵袭和转移严重影响患者的生活质量和预后。虽然临床骨科工作者一直致力于对其防治的研究，但近几年骨肉瘤总体5年生存率仍然徘徊不前，因此，寻找到骨肉瘤早期精确诊断和治疗的有效靶点任重而道远。

miRNA是一种由19～22个成熟核苷酸组成的小分子非编码RNA(non-coding RNAmolecules，ncRNAs)，于1993年由Ambros课题组在研究线虫时首次发现。迄今为止，miRNA在所有动植物中都存在，约占基因组的4％。它们在细胞的发生、分化、增殖和凋亡起着重要的作用。此外，基于目标基因功能的基础上，miRNA对癌症具有广泛的调节作用，它们可以作为肿瘤抑制因子，也可以作为致瘤因子。主要的作用机制包括：miRNA位点的缺失、扩增、突变，表观遗传水平改变，转灵调控因子的异常表达等。miRNA在组织和细胞中的表达表现为显著的肿瘤相关性、组织特异性和表达稳定性。并且miRNA在外周血中的表达同样具有肿瘤相关性和组织特异性，同时与RNA比较，其表达稳定性更为显著。目前已有研究通过高通量测序或者基因芯片技术检测miRNA的表达水平来确定跟骨肉瘤相关的miRNA，包括miR-4714-3p、miR-1299、miR-6779-5p、miR-1292、miR-3688-3p、miR-5010等。

在基因表达研究中有各种因素可导致样品偏差，比如RNA的数量和质量，但是表达数据能通过内参基因的校正来修正这种偏差。miRNA内参基因的选择非常重要。有研究表明，内参基因的选择可对RT-PCR结果产生显著影响，若内参基因选择不恰当，将使样本间的基因表达差异被掩盖或者过度夸大，导致出现错误甚至与事实相反的结论。此外，由于miRNA的特异性表达与肿瘤类型密切相关，因此在选择内参基因时需考虑肿瘤类型、样本来源以及实验方法等因素，以针对性地选择合适的内参基因。近年来出现了用人工合成的非人类(如线虫)miRNA作为miRNA检测标准化的外源性对照，但是，外源性对照不能纠正样本采集的差异，所以并不是理想的选择。同时，一些内源性基因常被用作组织/细胞miRNA检测的内参基因，比如5SrRNA、18SrRNA和U6等，但是由于这些基因不是miRNA，不能代表miRNA的组分，而且这些基因的提取、反转录和PCR扩增的效率可能与miRNA有所不同。因此，这些基因也不是最理想的选择。目前尚无研究对骨肉瘤研究中miRNA标准化的最佳参照基因进行系统性的鉴定和评估，因此，本领域迫切需要开发能够作为骨肉瘤研究中microRNA标准化的参照基因，并建立检测miRNA，特别是循环miRNA的有效标准化方案。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种骨肉瘤miRNA检测的内参miRNA基因的鉴定。

具体地，本发明提供一种miRNA在制备用于骨肉瘤miRNA检测的内参试剂的应用，其特征在于：所述miRNA为hsa-miR-128a-5p。

本发明还提供一种miRNA的组合在制备用于骨肉瘤miRNA检测的内参试剂的应用，其特征在于：所述组合为hsa-miR-128a-5p和let-7d构成的组合。

其中hsa-miR-128a-5p的序列为：5’-CGGGGCCGUAGCACUGUCUGAGA-3’，let-7d的序列为：5’-AGAGGUAGUAGGUUGCAUAGUU-3’。

本发明还提供用于骨肉瘤miRNA检测的内参试剂在制备诊断骨肉瘤的试剂盒中的应用。提供一种诊断骨肉瘤的试剂盒，该试剂盒含有用于检测内参miRNA hsa-miR-128a-5p或者hsa-miR-128a-5p和let-7d的组合的试剂。

进一步地，所述试剂盒还包含用于miRNA提取及qRT-PCR反应所需的RNA分离液、试剂和酶，以及标准品或/和对照品。

本发明还提供一种检测骨肉瘤患者血浆或血清中miRNA的相对表达量的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测血浆或血清的总RNA并反转录为cDNA；

(2)以步骤(1)获得的cDNA为模板，分别检测其中目的miRNA的编码序列的含量和hsa-miR-128a-5p的编码序列的含量；

(3)根据步骤(2)的结果，以所述hsa-miR-128a-5p为内参基因，计算目的miRNA的相对表达量。

进一步地，提供一种检测骨肉瘤患者血浆或血清中miRNA的相对表达量的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测血浆或血清的总RNA并反转录为cDNA；

(2)以步骤(1)获得的cDNA为模板，分别检测其中目的miRNA的编码序列的含量和hsa-miR-128a-5p和let-7d的编码序列的含量；

(3)根据步骤(2)的结果，以所述hsa-miR-128a-5p和let-7d为内参基因，计算目的miRNA的相对表达量。

本发明提供的血清/血浆miRNAs检测内参的优点在于：

(1)血清/血浆miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA内参的成功研究有助于血清/血浆miRNAs在骨肉瘤疾病早期诊断及预后判断等方面价值的临床转化，以及不同实验室之间研究结果的比较。

(2)血清/血浆miRNAs内参检测试剂盒可用于检测不同受试者血清/血浆中的内参miRNAs，有助于反映不同受试者内参miRNA的基线表达水平，用于控制个体生物学差异导致的miRNA表达水平差异，以凸显真正与疾病相关的差异表达miRNA。

(3)采用严密的筛选和验证方案，本发明人初期采用基因芯片对骨肉瘤和正常人血清/血浆miRNAs进行表达量分析，以获取稳定表达的血清/血浆miRNAs，并应用qRT-PCR(探针法和染料法)的方法进行了单个样本验证；以上方法和策略的应用保证了血清/血浆miRNAs内参检测试剂盒的准确性。

总之，hsa-miR-345-5p或者hsa-miR-345-5p和hsa-miR-99b的组合在骨肉瘤患者中稳定表达，用hsa-miR-345-5p或者hsa-miR-345-5p和hsa-miR-99b的组合作为内参基因可以实现不同实验室间研究结果的比较，促进各实验结果的归一化处理，进而促进血清/血浆miRNA研究结果向临床成果转化，为临床医生提供更加精确的诊断、分型、预后判断以及个体化治疗的有力工具。以单个miRNA或两个miRNA的组合作为血清或血浆中的内参基因，适用于高、低通量的检测平台，对于大规模临床检测应用，降低了操作难度，简化了操作流程。

具体实施方式

实例1骨肉瘤病人外周血中miRNA表达分析

1、样品收集

骨肉瘤病人外周血均来自因骨肉瘤住院病例，30例原发性骨肉瘤患者及20名健康对照。原发性骨肉瘤患者组及健康对照组要求空腹至少12h，于次日清晨7：00～8：00室温下，抽取10ml静脉血于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，提取外周血单个核细胞PBMCs，加入1mlTrizol试剂(Invitrogen公司)，充分混匀，-80℃保存标本，以用于RNA提取。所有的血样和病理结果应真实可靠，研究经伦理委员会批准，患者知情同意。

2、方法

2.1、外周血总RNA的提取

按Triazol试剂盒说明书提取骨肉瘤病人和正常人外周血细胞的总RNA，通过凝胶电泳证明RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。步骤如下：

(1)收集病人外周血，离心收集细胞，每管加入1mLTrizol试剂，混匀，室温放置5min。加入氯仿200μL，用力振荡15sec，室温孵育2～3min。

(2)在4℃下以12000×g的速度离心15min，混合物分为红色的酚-氯仿相(下相)、白色的中间相以及无色的上层水相。总RNA分散在上层水相中。

(3)将上层水相转移到一个新的Eppendorf管中，加入1mL无水乙醇，混匀以沉淀RNA。

(4)室温孵育10min以上，在4℃下以12000×g的速度离心10min，可见白色的RNA沉淀贴于试管底壁。

(5)弃上清，用70％的乙醇洗涤RNA沉淀一次，在4℃下以7500×g的速度离心5min。

(6)弃上清，空气中自然干燥，用60μLDFPC水溶解沉淀，-70℃保存备用。

(7)总RNA完整性鉴定：取2μLRNA样品在1.5％琼脂糖凝胶电泳(60v，30min)，分出区带后EB染色，紫外灯下拍照观察。

(8)用核酸蛋白仪测定RNA的浓度及纯度。

2.2基因芯片杂交及数据分析

取100ng提取的外周血miRNA，使用安捷伦公司的miRNAComplete LabelingandHyb试剂盒，按照说明书步骤进行样本的标记和浓缩，使用安捷伦公司的人miRNA表达谱芯片进行杂交。使用芯片扫描仪进行图像扫描以后，把数据导入GeneSpringCX11.0软件进行数据的标准化处理及后续的分析，将芯片归一化后的有效数据应用专业软件进行分析。

实施例2血清/血浆中miRNA的qRT-PCR验证

根据芯片杂交结果，选择符合下列标准的miRNA分子利用qRT-PCR技术进行进一步筛选：a)在骨肉瘤和对照组中的表达水平在前80名；b)在两组均稳定表达，且两组之间无明显差异(p≥0.05)。根据以上标准，共选出6个符合要求的miRNA分子(包括hsa-miR-128a-5p、let-7d、has-miR-100、has-miR-210-5p、has-miR-222、has-miR-425)，6个miRNA分子的序列如表1所示。此外，由于U6常被作为组织miRNA检测的内参分子，为验证其在血清中可否作为内参，U6也作为候选分子被纳入筛选。通过对上述6个miRNA及U6采用qRT-PCR技术在另外一组受试者(包括10例骨肉瘤和10例对照)中进行验证，有2个候选分子因表达水平较低而被排除(has-miR-210-5p、has-mir-222)。对剩余4个分子(及U6)，采用Normfinder、geNorm软件进行表达稳定性分析。

表1 miRNA候选内参序列

整个研究过程均实施严格质控，每个样本连续检测三次且所有检测均采用盲法，即在不清楚样本背景的情况下完成以避免偏倚。具体步骤如下：

(1)制备RNA样品：参见实施例1

(2)探针法实时定量PCR：使用ABI试剂盒。

a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。探针法的逆转录反应体系包括0.10μl 100mM dNTPs混合物、1μl逆转录酶(50U/μL)、2.0μl10X逆转录缓冲液、0.20μl RNA抑制剂以及2.5μl 5×逆转录引物(上述6个miRNA以及U6的逆转录引物混合物，每种miRNA加入3/4μl逆转录引物)。加入9.56μl的总RNA。反应步骤为16℃孵育30分钟，42℃反应30分钟，85℃孵育5分钟；

b)q-PCR：将cDNA加入5μl水稀释，取1μl稀释后的cDNA，分别加入0.25μl 20×MicroRNA检测探针(上述6个miRNA以及U6的探针)、2.5μl 2×基因表达Master Mix、1.25μl双蒸水，5μl体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI>

(3)染料法实时定量PCR：

a)通过RNA逆转录反应得到cDNA。染料法的逆转录的反应体系包括4μl 5×AMV缓冲液、2μl 10mM dNTP混合物(Takara公司)、0.5μl RNase抑制剂(Takara公司)、2μl AMV(Takara公司)以及1.5μl miRNA特异性反向引物的混合物(上述6个miRNA以及U6的特异性反向引物混合物)，每种加入1.5/4μl)。反应步骤为16℃孵育15分钟，42℃反应1小时，85℃孵育5分钟；

b)q-PCR：将cDNA按1/5体积稀释，取0.5μl稀释后的cDNA，加入0.15μl Taq酶(Takara公司)，0.5μl 20×EVAGREEN，0.1μl 10μM正向引物一种(即分别采用上述单一miRNA以及U6对应的正向引物)，0.1μl 10μM通用反向引物(URP：TGGTGTCGTGGAGTCG)，0.6μl 25mM MgCl₂，0.8μl>2O，10μl体系进行q-PCR。仪器使用的是ABI>

(4)数据处理与分析

对所有样本血清的各miRNA分子三次检测结果(Ct值)取平均值，排除表达水平较低(Ct值中位数大于35)的miRNA分子，对剩余分子采用One-wayANOVA方法分析各个miRNA在不同样本组之间是否有表达差异，运用Normfinder及geNorm计算各个miRNA的稳定性(见表2)。由表1可知，若采用单个miRNA作为血清内参，hsa-miR-128a-5p为稳定性最高的内参，而hsa-miR-128a-5p及let-7d的组合稳定性更佳。

因此，本发明人证明了has-miR-128a-5p或者has-miR-128a-5p/let-7d构成的组合能够稳定地在各骨肉瘤病人和健康对照中表达。

表2 miRNA内参的稳定性分析

实施例3表达稳定性的进一步验证

根据qRT-PCR筛选结果，has-miR-128a-5p或者has-miR-128a-5p/let-7d的组合为表达稳定候选内参基因。采用qRT-PCR方法在一组新的受试样本(包括10个骨肉瘤和10个对照样本)中对其稳定性进行验证，结果显示其在骨肉瘤和正常样本中均稳定表达，具有较好的稳定性。

实施例4血清/血浆miRNA内参检测试剂盒的制作

试剂盒包括血清/血浆miRNA引物(包括单独的has-miR-128a-5p或者has-miR-128a-5p/let-7d的引物组合，还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl₂，去核酸酶水，荧光染料或探针、Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照。此试剂盒的价值在于可检测骨肉瘤血清/血浆miRNA的内参，为不同实验室间研究结果的比较提供依据，以促进相关研究结果的临床转化，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出诊断和更有效的个体化治疗。