柑橘溃疡病菌产生小分子作为噻唑类杀菌剂增效剂在病害防治中的应用

摘要

本发明公开了一种由柑橘溃疡菌

说明书

技术领域

本发明涉及生物防治技术植物保护领域，具体涉及柑橘溃疡菌Xanthomonas>axonopodis>pv.citri（Xac）产生的小分子化合物作为一种绿色安全的新型增效剂对提高噻唑类杀菌剂如噻唑锌的杀菌效果，降低化学农药施用量在病害防治的应用。

背景技术

在植物病害综合防控中，化学农药防治因其时效快，效果显著等特点广受青睐，中国是世界上滥用化学药剂最严重的国家之一。随着人们对个人健康、食品安全以及生态环境的关注和重视，在农业生产中减少化学药剂，特别是传统高毒和高残留的化学农药的用量势在必行。研发和推广低毒、低残留、环境相容性好、防治效果显著的新型农药；研发新型的农药增效剂以达到增加药效，降低农药的使用量具有迫切要求和光明前景。传统的增效剂是通过改善农药的润湿、展布、分散、滞留和渗透性能等提高化学农药的药效，但存在着合成较难，污染环境等不足。从病原菌的角度入手，通过改变病原微生物的生活习性，抑制及弱化病原菌的抗药性从而提高农药的杀菌效果，降低农药的使用量，降低成本，保护生态环境是未来的新型增效剂的发展方向，其不但可延长农药品种的生命期，更因为其绿色安全特性将受欢迎。

本发明的前期研究发现柑橘溃疡病病原Xac产生结构不同的新型小分子。例如Wang> et al..>XfDSF的结构如下：

。

但目前还没有研究所述小分子化合物对于提高药剂杀菌效果方面的报道。

发明内容

我们的研究发现无论在室内还是田间在柑橘溃疡病防治药剂噻唑锌中添加低浓度由病原菌Xac产生的小分子化合物能够显著提高药剂的杀菌效果，从而降低药试剂的使用量。所述小分子化合物是指DSF和/或XfDSF。

关于小分子化合物作为增效剂与农药混用在植物病害防治的使用未见报道。

本发明的目的在于提供小分子化合物的一个新用途。

本发明的目的通过以下技术方案来予以实现：

提供小分子化合物作为增效剂与噻唑类杀菌剂在防治柑橘溃疡病方面的应用。

所述的小分子化合物是从柑橘溃疡病原菌Xanthomonas axonopodis>pv.citri发酵培养液中提取或人工化学合成。

所述小分子化合物的提取方法是通过离心收集柑橘溃疡病菌Xac过夜培养液上清，通过加入乙酸乙酯萃取，利用高效液相色谱（HPLC）进行分离纯化，收集活性物质，经结构鉴定确认为Xac产生的DSF，及其衍生物XfDSF。

将分离提取并所制备的不同浓度小分子化合物与噻唑类杀菌剂（噻唑锌）混合处理病原菌Xac,统计菌落生长情况，比较不同浓度的小分子与噻唑类杀菌剂混合分别对室内及盆栽柑橘上的病原菌Xac的杀菌效果。试验结果表明，一定浓度的小分子化合物能够显著提高噻唑类杀菌剂（噻唑锌）对病原菌Xac的杀菌效果，将其开发成一种新型高效的杀菌增效剂在防治植物病害中具有光明前景。

基于以后生产应用成本控制，本发明提供了所述小分子化合物与噻唑类杀菌剂混合配制以0.01μM~1mM浓度范围应用于防治柑橘溃疡病，更优选的为10~500μM。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

研究小分子化合物作为增效剂与噻唑类杀菌剂混用能显著提高杀菌剂的药效，降低化学药剂的使用量，降低成本，解决病原菌对药剂日益突出的抗性问题具有重要的意义。

1）突破以往杀菌增效剂以改善药剂的理化性质为出发点，本发明从病原菌入手，通过利用细菌本身产生的天然的不饱和脂肪酸小分子化合物与噻唑类杀菌剂（噻唑锌）混用能够显著提高药效，减少杀菌剂的用药量为研发绿色环保的新型杀菌增效剂提出了新思路，同时为解决病原菌日益突出的抗药性问题具有重要意义。

2）确定了柑橘溃疡病菌小分子DSF作为增效剂用于防治柑橘属细菌性植物病害的技术方案。

附图说明

图1>XfDSF混配噻唑锌对柑橘溃疡菌杀菌增效作用（处理菌液稀10^-6倍），其中，注：1A：WT+5%>3OH；1B：Zn（单独用噻唑锌处理）；1C：噻唑锌500倍与60μM>XfDSF混配；1D：噻唑锌500倍与80μM>XfDSF混配；1E：噻唑锌500倍与100μM>XfDSF混配。

图2>XfDSF混配噻唑锌对柑橘溃疡菌杀菌增效作用统计结果，其中注：Zn表示为单独用噻唑锌500倍液处理菌液（作为阳性对照）；Zn-20~>XfDSF混配噻唑锌处理菌液；不同浓度信号XfDSF作为增效剂混配噻唑锌的增效比值=噻唑锌单用CFU/（噻唑锌+XfDSF增效剂）CFU

图3 DSF混配噻唑锌对柑橘溃疡菌杀菌增效作用（处理菌液稀10^-6倍）。其中，注： 3A：WT+5%>3OH；3B：Zn（单独用噻唑锌处理）；3C：噻唑锌500倍与300μM>

图4 DSF混配噻唑锌对柑橘溃疡菌杀菌增效作用统计结果。其中，注：Zn表示为单独用噻唑锌500倍液处理菌液（作为阳性对照）；Zn-50~ Zn -500表示为选择50μM ~500μMDSF混配噻唑锌处理菌液；不同浓度信号DSF作为增效剂混配噻唑锌的增效比值=噻唑锌单用CFU/（噻唑锌+DSF增效剂）CFU。

图5>XfDSF混配噻唑锌对柑橘溃疡菌杀菌增效作用盆栽接种统计结果。其中，注：Zn表示为单独用噻唑锌500倍液处理已接种病原菌的盆栽嫩叶；Zn-60~>XfDSF混配噻唑锌500倍液处理已接种病原菌的植株嫩叶；不同浓度小分子XfDSF作为增效剂混配噻唑锌的增效比值=噻唑锌单用/（噻唑锌+XfDSF增效剂）。

图6 DSF混配噻唑锌对柑橘溃疡菌杀菌增效作用盆栽接种统计结果。注：Zn表示为单独用噻唑锌500倍液处理已接种病原菌的盆栽嫩叶；Zn-300~ Zn-500表示为选择300μM~500μM浓度范围之间DSF混配噻唑锌500倍液处理已接种病原菌的植株嫩叶；不同浓度小分子DSF作为增效剂混配噻唑锌的增效比值=噻唑锌单用/（噻唑锌+DSF增效剂）。

图7 DSF或XfDSF混配噻唑锌对水稻基腐病病原菌杀菌增效作用统计结果。其中：注：图7 A表示为培养基中加入0.5%甲醇对照；7B表示为单独用噻唑锌500倍液处理菌液；7C 表示为20μM>XfDSF混配噻唑锌处理菌液；图7>

具体实施方式

下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

实施例1至3采用的30%噻唑锌的母液浓度是10mg/mL,工作浓度是500倍稀释液。小分子化合物的供试浓度为100mM。本发明的实施例表明一定浓度范围的小分子化合物与噻唑类化学试剂混配作为生物源增效剂对柑橘溃疡病的防治有一定的增效杀菌的作用效果，符合本发明技术特征中部分噻唑类杀菌剂与小分子化合物的结合作为增效剂均能达到此增效效果。

实施例4采用的30%噻唑锌的母液浓度是10mg/mL,工作浓度是500倍稀释液。小分子的供试浓度为100mM。本发明的实施例表明一定浓度范围的小分子化合物与噻唑类化学试剂作为生物源增效剂对水稻基腐病菌EC1的防治有一定的增效杀菌的作用效果，符合本发明技术特征中部分噻唑类杀菌剂与小分子化合物的结合作为增效剂均能达到此增效效果。

实施例1 DSF及XfDSF的制备

将过夜培养的Xac种子液接入YEB培养基，28℃、200rpm培养24个小时后，通过离心收集柑橘溃疡病菌Xac培养液上清。所得上清待提取小分子用。

本发明采用的是常规的化合物分离提取的方法对发酵液中活性物质的分离与提取（具体方法也可参见说明书背景技术中提到的两篇现有技术文献）。在离心收集柑橘溃疡病菌Xac培养液上清后，加入与上清液等体积的乙酸乙酯，放入4℃静置2h后于20℃摇床处理1h,>XfDSF。

实施例2 小分子化合物与30%噻唑锌混配对柑橘溃疡病菌Xac的杀菌增效作用

用甲醇作为溶剂溶解提取物，与10mg/mL 噻唑锌试剂混合处理一定OD值的柑橘溃疡病菌液，用单位体积中的细菌群落总数(CFU)以测定不同浓度提取物对噻唑锌杀菌增效作用。具体操作是：

采用统计CFU法：用甲醇作为溶剂将小分子化合物配置成一定浓度的供试药剂，准确加入一定量的小分子化合物溶液混合500倍噻唑锌试剂到过夜培养至OD₆₀₀=1.0>Xac菌液中，将不同浓度小分子化合物、500倍噻唑锌试剂和菌液同时处理，单独用500倍噻唑锌处理菌液作为阳性对照，放于28℃、200rpm培养24个小时后，梯度稀释处理菌液并用200μL菌液处理液涂板（培养基为LB>9、1B单独用噻唑锌处理的CFU为2.5×10⁹、1C噻唑锌500倍与60μM>XfDSF混配处理的CFU为4×10⁸、1D噻唑锌500倍与80μM>XfDSF混配处理的CFU为1.6×10⁸、1E噻唑锌500倍与100μM>XfDSF混配处理的CFU为1.2×10⁸。结合图2得出：Zn-20表示为用20μM的XfDSF对噻唑锌的杀菌增效比值为1.3倍、Zn>XfDSF对噻唑锌的杀菌增效比值为6倍、Zn-60表示为用60μM的XfDSF对噻唑锌的杀菌增效比值为6.5倍、Zn-80表示为用80μM的XfDSF对噻唑锌的杀菌增效比值为16倍、Zn-100表示为用100μM的XfDSF对噻唑锌的杀菌增效比值为为21倍。结合图3，统计平板菌落数可得：3A不经处理的对照CK的CFU为4×10⁹、3B单独用噻唑锌处理的CFU为2.5×10⁹、3C噻唑锌500倍与300μM>8、3D噻唑锌500倍与400μM>8、1E噻唑锌500倍与500μM>7。

结合图4得出：Zn-50表示为用50μM的DSF对噻唑锌的杀菌增效比值为1.2倍、Zn-100表示为用100μM的DSF对噻唑锌的杀菌增效比值为1.1倍、Zn-200表示为用200μM的DSF对噻唑锌的杀菌增效比值为1.1倍、Zn-300表示为用300μM的DSF对噻唑锌的杀菌增效比值为2倍、Zn-400表示为用400μM的DSF对噻唑锌的杀菌增效比值为为16倍、Zn-500表示为用500μM的DSF对噻唑锌的杀菌增效比值为为30倍。

实施例3 小分子化合物与噻唑锌混配作为增效剂对柑橘溃疡病病菌防治温室盆栽试验

柑橘溃疡菌（Xanthomonas axonopodis>pv.Citri）菌液悬浮液的制备：将在LB培养基上划线培养2天后，挑取单菌落接入LB液体培养基中，在28℃恒温箱中过夜培养OD₆₀₀=0.5，待用接种。

室外盆栽实验在塑料大棚温室中进行。购买已种植2年以上的四季桔感病品种盆栽作为试验材料，选取大小相当、颜色相似、长势相同的四季桔嫩叶作为实验接种对象，在接种之前先对实验嫩叶用75%酒精消毒嫩叶表面，用注射器针头从叶背面刺穿叶子，在叶片远轴处两边均匀刺穿8个穿孔，再在穿孔上方接种5μL 的OD₆₀₀=0.5的菌液悬浮液，接种后置于室温、自然光照条件下培养，常规的水肥管理。

接种病原菌3d后的四季桔嫩叶分别喷洒用自来水配制的不同浓度小分子DSF混配500倍噻唑锌的供试试剂以及500倍噻唑锌作为阳性对照的处理药剂，LB培养基作为阴性对照，每片嫩叶喷涂药剂1mL，每个处理3个重复。

噻唑锌药剂混配不同浓度小分子化合物溶液分别处理已接种病原菌的四季桔叶片三天后，采样，将各个处理的叶子将带有病斑的区域剪碎于灭菌的研钵，加入少量石英砂和2mL LB培养基研磨至匀浆状于5mL 离心管中，并加3mL LB培养基，摇匀，用灭菌纱布过滤。将取得的滤液10000g/2分钟，1mL 培养基悬浮，重复两次后，用200μL LB培养基悬浮，稀释不同浓度梯度200μL涂板，观察病原菌落生长密度，并统计，结合图5结果：Zn-60表示为用60μM的XfDSF对噻唑锌的杀菌增效比值为2倍、Zn-80表示为用80μM的XfDSF对噻唑锌的杀菌增效比值为8倍、Zn>XfDSF对噻唑锌的杀菌增效比值为25倍。结合图6结果：Zn-300表示为用300μM的DSF对噻唑锌的杀菌增效比值为2倍、Zn-400表示为用400μM的DSF对噻唑锌的杀菌增效比值为5倍、Zn-500表示为用500μM的DSF对噻唑锌的杀菌增效比值为35倍。

实施例4 DSF或XfDSF与噻唑锌混配作为增效剂对水稻基腐病病原菌EC1的杀菌增效作用

用甲醇作为溶剂溶解提取物，与10mg/mL 噻唑锌混合处理一定OD值的水稻基腐病病原菌菌液，用单位体积中的细菌群落总数(CFU)以测定不同浓度提取物对噻唑锌杀菌增效作用。具体操作是：

采用统计CFU法：用甲醇作为溶剂将小分子化合物配置成一定浓度的供试药剂，准确加入一定量的小分子化合物溶液混合500倍噻唑锌试剂到过夜培养至OD₆₀₀=1.0>EC1菌液中，使菌液中小分子DSF的工作浓度范围在0.01μM~50μM之间，将不同浓度化合物DSF、500倍噻唑锌和菌液同时处理，单独用500倍噻唑锌处理菌液作为阳性对照，放于28^oC、200rpm培养24个小时后，梯度稀释处理菌液并用200μL菌液处理液涂板（培养基为LB>7、7B单独用噻唑锌处理EC1的CFU为6×10⁷、7C噻唑锌500倍与20μMXfDSF混配处理的CFU为2.5×10⁷、7D不经处理的对照CK的CFU为7.5×10⁷、7E单独用噻唑锌处理EC1的CFU为6×10⁷、7F噻唑锌500倍与100μM>5。