一株贝莱斯芽孢杆菌在防治辣椒疫病中的应用

摘要

本发明属于农作物病害生物防治技术领域，公开了一株贝莱斯芽孢杆菌在防治辣椒疫病中的应用，生防菌株FJ17‑4，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（

说明书

技术领域

本发明涉及植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌在防治辣椒疫病中的应用。

背景技术

由辣椒疫霉菌Phytophthora> Leonian侵染引起的辣椒疫病是一种毁灭性土传病害。近年来，辣椒疫病在世界许多国家危害日益严重，成为辣椒生产的主要限制因子。Hausbeck等就美国不同地区辣椒疫病对产量的损失进行了研究，发现一般田块产量损失达30%左右，严重田块几乎绝产；Silvar等研究表明，在西班牙南部地区辣椒疫病严重的地块可造成苗期植株全部死亡；李智军等研究结果显示，辣椒疫病造成的产量损失轻者达20%～30%，重者超过80%以上。兰成忠等研究调查显示，辣椒疫病在福建省的发生危害日益严重，重病田损失率达30-100%，由于连作、温暖高湿等因素，辣椒疫病已给辣椒种植带来严重的损失，一般年份损失20-30%，严重时损失高达100%，甚至造成绝收，该病害已成为影响辣（甜）椒生产的主要障碍之一。

利用抗病品种是防治辣椒疫病最直接有效的方法，但辣椒疫霉菌存在丰富的生理小种，大多数抗性品种很难同时具备抗多种生理小种的能力，部分高抗品种由于缺少优良的园艺性状使其在生产上的种植推广受到限制。另外，辣椒疫霉菌属于异宗配合卵菌，存在无性和有性两种繁殖方式，在寄主抗性选择压力下存在一定的变异性，致使病原群体呈现出复杂的遗传结构，出现新的生理小种，增加了抗性品种的选育难度。目前辣椒疫病的防治仍然以化学杀菌剂为主，大量化学农药的反复使用，适成了环境的严重污染、农产品农药残留及病原菌抗性产生和再度猖獗。因此，生产上急需一种绿色的防治措施以保障农业的可持续发展。大量研究表明，芽孢杆菌属菌株对植物病害具有良好的生物防治作用。

本发明从土壤中分离到一株对辣椒疫病菌具有较高拮抗能力的细菌，经微生物分类学鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus>）。本发明为微生物源农药的进一步研制和开发提供优良的出发菌株，同时对减少环境污染、降低农药残留、避免病原菌抗药性产生和再度猖獗和维持农业可持续发展具有重大的理论和生产意义。

发明内容

本发明的目的针对辣椒疫病在蔬菜生产中危害的严重性及化学杀菌剂大量反复使用存在的弊端，提供了一株贝莱斯芽孢杆菌在防治辣椒疫病中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一株分类命名为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillusvelezensis）的生防菌株FJ17-4，已于2017年9月18日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC>

本发明还提供了一种含有生防菌株FJ17-4的生防菌剂，该生防菌剂活性成分为贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌株，含菌量为1×10⁹～10¹⁰CFU/mL。

本发明还提供了一种利用生防菌株FJ17-4制备生防菌剂的方法，其步骤如下：

（1）将低温保存的生防菌株FJ17-4划线于LB培养基平板上，在28℃下培养24小时，得到活化的株；

（2）用灭菌的接种环刮取一环步骤（1）活化的菌株接种于100 mL LB液体培养基中，于振荡摇床中28℃，180rmp条件下培养至培养液OD600为0.5～0.8，获得种子液；

（3）将种子液接种于LB液体培养基中，28℃，180rmp条件下扩大培养24 h，然后4000rpm离心10 min，收集菌体，用灭菌水将菌株进行稀释制成活菌浓度为1×10⁹-1×10¹⁰CFU/mL的菌悬浮液，获得所述生防菌剂。

其中，所述种子液的接种量优选为1～2%。所述LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，琼脂粉15 g，水1000mL，pH 7.2；所述的LB 液体培养基配方为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，水1000mL，pH 7.2。

所述的保藏号为CGMCC No.14642的生防菌株FJ17-4制备的生防菌剂在防治辣椒疫病中的应用。该生防菌剂可以兑水喷雾或灌根使用。

本发明的有益效果：

与现有技术相比，本发明为辣椒疫病提供了具有防治作用的生防菌株及生防菌剂，可用于辣椒疫病的生物防治。本发明避免了辣椒疫病防治中大量化学农药的使用，有利于绿色蔬菜辣椒的生产，这对减少化学杀菌剂的使用、降低农药污染和避免病原菌抗性产生等具有重要的意义。

附图说明

图1为生防菌株FJ17-4的菌落形态。

图2为生防菌株FJ17-4的扫描电镜观察图。

图3为菌株FJ17-4基于16SrRNA基因序列比对结果以Alicyclobacillus>acidocaldarius>DSM 446 (AJ496806)为外枝构建的Neighbor-Joining系统发育树；

图4为生防菌株FJ17-4对辣椒疫霉菌的平板拮抗效果。

图5为生防菌株FJ17-4菌体悬浮液对辣椒疫病的室内盆栽防治效果。

图6为生防菌株FJ17-4菌体悬浮液对辣椒疫病的室内离体果防治效果。

图7为生防菌株FJ17-4菌体悬浮液对辣椒疫病的田间防治效果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述， 但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

实施例1 含FJ17-4菌株的生防菌剂的制备

1、生防菌株FJ17-4的获取

生防菌株FJ17-4从福建省福州市闽清县云龙乡官庄村土壤中分离获得，采用平板稀释法对所采集土样中的细菌进行分离，所使的培养基为LB（胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，琼脂15g，水1000mL，pH 7.2）。根据不同菌落形态，对所分离细菌进行纯化，共分离纯化得到326株细菌。然后以黄瓜疫病菌为目标病原菌，采用平板对峙培养法（图4）对所纯化细菌对黄瓜疫病菌的拮抗能力进行测定，得到对黄瓜疫病菌具有拮抗作用初筛细菌18株。通过室内盆栽试验，进一步对初筛菌株的防病能力进行评估，最终得到具拮抗作用又有盆栽防治作用的菌株6株。综合拮抗和盆栽防病能力，选取FJ17-4拮抗菌为代表， 该菌对辣椒疫病菌菌丝生长具有较强的拮抗作用。

经形态学、生理生化及分子生物学16s rDNA鉴定，所分离生防菌株FJ17-4为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus>）。其形态学特征如图1、2所示：菌株革兰氏染色呈阳性；在LB培养基平板上，菌落表面扁平，粗糙不透明，乳白色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱，菌落中央凹状突起（图）；扫描电镜观察其菌体呈短杆状（图），最适生长温度为28℃；其生理生化特征如表1-表3所示，其16s rDNA序列如SEQ ID No.1所示，基于16SrRNA基因序列比对结果系统发育树如图2所示。

表1 菌株FJ17-4 生理生化特性-酶活、碳源氧化

+：阳性反应； -：阴性反应；W：弱阳性反应

表2 菌株FJ17-4 生理生化特性-利用碳源产酸

+：阳性，-：阴性，w：弱阳性

表3 菌株FJ17-4 生理生化特性-碳源利用

+：阳性，-：阴性，w：弱阳性

2、生防菌剂的制备

1）将低温保存的生防菌株FJ17-4划线于LB培养基平板上，在28℃下培养24 小时，得到活化的株。LB固体培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，琼脂粉16g，水1000mL，pH 7.2；

2）用灭菌的接种环刮取一环步骤（1）活化的菌株接种于100 mL LB液体培养基中，于振荡摇床中28℃，180rmp条件下培养至培养液OD600为0.7，获得种子液。LB 液体培养基配方为：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠5 g，水1000mL，pH 7.2；

3）将种子液以1:1000体积比接种于LB液体培养基中，28℃，180rmp条件下扩大培养24h，然后4000rpm离心10 min，收集菌体，用灭菌水将菌株进行稀释制成活菌浓度为1×10¹⁰CFU/mL的菌悬浮液，获得所述生防菌剂。

实施例2：FJ17-4菌株对辣椒疫病菌的拮抗活性

用对峙培养法，将保存于4℃中的辣椒疫霉菌接种到PDA平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为5 mm的圆形菌块。将菌丝块接种在改良的NB培养基平板（蛋白胨5g，葡萄糖10g，肉汁浸膏3g，氯化钠5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH=7.2）中央，在其四周距中心约25mm处分别接种FJ17-4，试验以清水为对照组。25℃培养，待菌丝长满平板后观察并记录抑菌圈的大小。

根据抑菌圈的大小对FJ17-4拮抗辣椒疫病菌的活性进行评估：0 mm，无抑制作用；＜2mm，有轻微的抑制作用；2-5mm，中等抑制作用；＞5mm，较强的抑制作用。根据病原菌在拮抗菌方向上的生长直径，计算FJ17-4对辣椒疫病菌的抑制率，抑制率算法如下：抑制率=[(50-R)/50]×100%，其中，因为辣椒疫病菌丝块接种于平板中央，而拮抗菌接种点离菌丝块的距离为25mm，在拮抗菌没有任何拮抗作用的条件下，病原菌生长至拮抗菌接种点的菌落直径应为50mm， R为病原菌在细菌方向的菌落半径。

检测结果见图4。由图4可见，生防菌FJ17-4对辣椒疫病菌生长具有较强的抑制效果，抑制圈半径为15mm，菌丝抑制率为60%。与阴性对照清水处理组相比，拮抗效果十分明显。

实施例3： FJ17-4菌株（生防菌剂）对黄瓜枯萎病的防治效果

1）室内盆栽试验防治效果

将荷椒13甜椒品种播种于50格育苗盘中，将出苗后每穴留1株，待甜椒苗生长至4片真叶时，将孢子囊浓度为1×10⁷/mL的辣椒疫病菌悬浮液灌根于辣椒苗根部，每根10mL，将FJ17-4菌株发酵液（菌体浓度为1×10¹⁰CFU/mL）浇灌于已接种辣椒疫病菌的苗根部，每株10mL，以58%甲霜灵·代森锰锌可湿性粉剂700倍每株10mL为对照处理；以不作任何处理的已接种辣椒疫病菌的辣椒苗为空白对照。10天后，统计各处理组的发病率，计算防治效果。发病率（%）=（发病株数/总调查株数）×100%，防治效果（%）=[（空白对照发病率-处理发病率）/空白对照发病率]×100%。

由图5和表4可见，FJ17-4菌株菌悬液（生防菌剂）和58%甲霜灵·代森锰锌可湿性粉剂700倍对室内盆栽试验的辣椒疫病具有一定的防治效果，防治效果分别为81.63%和77.55%，FJ17-4菌株菌悬液的防治效果略高于58%甲霜灵·代森锰锌可湿性粉剂700倍的防治效果。

表4 贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌悬液对辣椒疫病的室内盆栽防治效果

2）室内离体果防治效果

采集可上市的荷椒13甜椒果实，采用70%乙醇对所采集的辣椒果实进行表面消毒。用灭菌手术刀片轻轻地在果实表面造成微型伤口用于创伤接种法接种辣椒疫病菌，每个创伤点接种直径为5mm的辣椒疫病菌菌丝块1片，在相对湿度为100%的28℃条件下保湿培养。24小时后，去除辣椒果实表面的菌丝块，将FJ17-4菌株发酵液（菌体浓度为1×10¹⁰CFU/mL）喷施于果实表面，喷施量以果实表面带水滴为准，以果实表面喷施58%甲霜灵·代森锰锌可湿性粉剂700倍对照处理；以果实表面喷施清水作为空白对照。将全部处理果实置于相对湿度100%的28℃条件下保湿培养。5天后，统计各处理组果实表面的病斑直径，计算防治效果。防治效果（%）=[（空白对照病斑直径-处理病斑直径）/空白对照病斑直径]×100%。

由图6和表5可见， FJ17-4菌株菌悬液（生防菌剂）和58%甲霜灵·代森锰锌可湿性粉剂700倍对离体果室内试验的辣椒疫病具有一定的防治效果，防治效果分别为83.33%和72.22%，FJ17-4菌株菌悬液的防治效果高于58%甲霜灵·代森锰锌可湿性粉剂700倍的防治效果。

表5 贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌悬液对辣椒疫病的室内离体果防治效果

3）大田防治效果

大田防治试验选择在往年辣椒疫病发生较为严重的福建省建瓯市东峰乡进坤口村进行。在辣椒疫病发病初期进行喷雾处理，试验设计与室内试验基本相同，设为3组，第1组使用FJ17-4菌株菌悬液进行喷雾处理，第2组使用58%甲霜灵·代森锰锌可湿性粉剂700倍进行喷雾对照处理，第3组使用清水喷雾为对空白对照，施药量以叶片滴水为准，每隔7天用药1次，用药时间分别为2017年4月22日、4月29日和5月6日，共3次，最后1次用药结束10天后（2017年5月16日）调查田间辣椒疫病的病情指数，计算各个处理的防治效果。具体方法如下：对每小区内的所有植株进行调查。记录调查株数，发病株数和病级数，计算病情指数。分级标准如下：0级：健康无症；1级：地上部仅叶、果有病斑；3级：地上茎、枝有褐腐斑；5级：茎基部有褐腐斑；7级：地上茎、枝与茎基部均有褐腐斑，并且部分枝条枯死；9级：全株枯死。根据调查总株数、发病株数和发病叶的病级数；计算病情指数；处理区和对照区病情指数比较计算防效。病情指数=∑（各级病株数×相对病级数值）÷（调查总株数×9）×100；防治效果（%）=［（CK病情指数—处理病情指数）÷CK病情指数］×100

从图7、表6可见，生防菌株FJ17-4菌悬液（生防菌剂）和58%甲霜灵·代森锰锌可湿性粉剂700倍对（大田）的辣椒疫病具有一定的防治效果，防治效果分别为80.31%和74.5%，FJ17-4菌株菌悬液（生防菌剂）的防治效果高于58%甲霜灵·代森锰锌可湿性粉剂700倍的防治效果，显示出较好的应用前景。

表6 贝莱斯芽孢杆菌FJ17-4菌悬液对辣椒疫病的田间防治效果

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院植物保护研究所

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌在防治辣椒疫病中的应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1447

<212> DNA

<213> 16s rDNA序列

<400> 1

gggcggcgtg cctatacatg cagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag 60

cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa 120

accggggcta ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt cagacataaa aggtggcttc 180

ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 240

aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 300

cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 360

agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa 420

caagtgccgt tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 540

aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 600

gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact 720

gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat 840

taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900

ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960

ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga gtgacaggtg 1020

gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1080

acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa 1140

ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg 1200

tgctacaatg gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc 1260

tgttctcagt tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat 1320

cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac 1380

cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt taggagccag ccgccgaagt 1440

ggaccta 1447

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