蛋白质OsMADS14在调控植物种子灌浆、千粒重和结实率中的应用

摘要

本发明公开了蛋白质OsMADS14在调控植物种子灌浆和/或千粒重和/或结实率中的应用。所述调控植物种子灌浆具体为促进植物种子灌浆。所述促进植物种子灌浆的表现具体可为种子千粒重增加和/或结实率增加。所述调控植物千粒重为增加植物千粒重。所述调控植物结实率为提高植物结实率。实验证明，蛋白质OsMADS14及其编码基因能调控植物种子灌浆、调控植物千粒重和调控植物结实率：向osmads14突变体中导入蛋白质OsMADS14的编码基因，得到千粒重增加和结实率提高的转基因植物。因此，蛋白质OsMADS14及其编码基因在调控水稻种子灌浆和/或千粒重和/或结实率中具有重要的理论意义和实用价值。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质OsMADS14在调控植物种子灌浆和/或千粒重和/或结实率中的应用。

背景技术

水稻，作为世界上最重要的粮食作物之一，养育了世界上超过50％的人口。然而，最近的研究表明，在水稻三大生产国，中国、印度和印度尼西亚分别有78％、37％和81％的水稻生产区的水稻产量从1961年到2008年一直停滞不前。水稻产量的保证很大程度上依赖于种子的正常发育，而在水稻种子的正常发育过程中灌浆是一个关键环节。截止目前，水稻灌浆的具体机理还不清楚，因此，研究参与种子灌浆的因子对粮食作物的产量保证具有重要意义。

水稻产量受单位面积穗数、穗粒数和千粒重三个因素的影响，三者关系的协调是取得水稻高产的关键。作为产量构成因子之一的千粒重对最稳定且受环境条件的影响相对较小，历来被育种者所重视，因此提高水稻粒重是水稻高产育种的重要途径之一。结实率也是水稻产量的重要构成要素，对产量的影响仅次于穗数，提高水稻结实率可直接增加穗粒数，进而提高水稻产量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何促进水稻种子的灌浆和/或增加水稻千粒重和/或提高水稻结实率。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质OsMADS14在调控植物种子灌浆和/或千粒重和/或结实率中的应用。

上述应用中，所述蛋白质OsMADS14可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物种子灌浆和/或千粒重和/或结实率相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2由246个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质OsMADS14的核酸分子在调控植物种子灌浆和/或千粒重和/或结实率中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述编码所述蛋白质OsMADS14的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：

b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质OsMADS14的DNA分子；

b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质OsMADS14的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

序列表中序列1由741个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的蛋白质OsMADS14的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质OsMADS14的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质OsMADS14且具有蛋白质OsMADS14功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质OsMADS14的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述调控植物种子灌浆具体可为促进植物种子灌浆。所述促进植物种子灌浆具体可表现为植物千粒重增加和/或植物结实率提高。所述调控植物千粒重具体可为增加植物千粒重。所述调控植物结实率具体可为提高植物结实率。

上述应用中，所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：

c1)双子叶植物；

c2)单子叶植物；

c3)禾本科植物；

c4)水稻；

c5)水稻osmads14突变体。

所述水稻osmads14突变体具体可为韩国突变体数据库(网址为：http://ship.plantsignal.cn/links.do)的产品，产品编号为3A-60793.R，其背景为水稻品种Dongjin。

为解决上述技术问题，本发明还提供了培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为方法一，可包括将编码所述蛋白质OsMADS14的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比千粒重增加和/或结实率提高。

上述方法中，所述编码所述蛋白质OsMADS14的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)所示的DNA分子：

b1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质OsMADS14的DNA分子；

b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质OsMADS14的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

序列表中序列1由741个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

所述“将编码所述蛋白质OsMADS14的核酸分子导入受体植物”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向载体插入编码所述蛋白质OsMADS14的核酸分子得到的重组质粒。所述重组载体具体可为重组质粒pCAMBIA23a－P－C。所述重组质粒pCAMBIA23a－P－C为将载体pCAMBIA23a的BamHⅠ识别序列和KpnⅠ识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表的序列1所示的DNA分子，将HindⅢ识别序列和SalⅠ识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表的序列3所示的DNA分子，得到的重组质粒。所述重组质粒pCAMBIA23a－P－C表达序列表中序列2所示的OsMADS14蛋白。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为方法二，可包括在出发植物中抑制所述蛋白质OsMADS14的表达和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述出发植物相比Os02g44108基因的表达量下降和/或种子的多糖含量下降；所述Os02g44108基因的核苷酸序列如序列表的序列4所示。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种植物育种方法。

本发明所提供的植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质OsMADS14的含量或活性，从而增加植物千粒重和/或提高植物结实率。

上述任一所述的方法中，所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：

c1)双子叶植物；

c2)单子叶植物；

c3)禾本科植物；

c4)水稻；

c5)水稻osmads14突变体。

上述方法中，所述水稻osmads14突变体具体可为韩国突变体数据库(网址为：http://ship.plantsignal.cn/links.do)的产品，产品编号为3A-60793.R，其背景为水稻品种Dongjin。

上文中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述核酸分子转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖所述核酸分子，也可用常规育种技术将所述核酸分子转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

实验证明，蛋白质OsMADS14及其编码基因能调控植物种子灌浆、调控植物千粒重和调控植物结实率：向osmads14突变体中导入蛋白质OsMADS14的编码基因，得到千粒重增加和结实率提高的转基因植物。因此，蛋白质OsMADS14及其编码基因在调控水稻种子灌浆和/或千粒重和/或结实率中具有重要的理论意义和实用价值。

附图说明

图1为osmads14突变体的表型。

图2为OsMADS14基因的表达模式分析。

图3为osmads14突变体的互补检测。

图4为osmads14突变体的表型分析。

图5为实施例4的实验结果。

图6为实施例4的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

水稻品种Dongjin购自中国农科院作物科学研究所。水稻品种Dongjin在下文中命名为野生型水稻或Dongjin。

光照交替培养即光培养和暗培养交替，条件为：28℃；14小时光照培养/10小时黑暗培养；光照培养时的光照强度为90μE/m²/s。

YEB液体培养基：将牛肉浸膏5g、酵母膏1g、蛋白胨5g、蔗糖5g、MgSO₄·7H₂O>

诱导培养基：将50×N6大量母液20mL、100×B5微量母液10mL、200×MS铁盐母液5mL、1000×B5有机母液1mL、水解酪蛋白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2.8g、2，4-D 2.0mg、蔗糖30.0g和植物凝胶4.5g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min。

共培养培养基：将50×N6大量母液20mL、100×B5微量母液10mL、200×MS铁盐母液5mL、1000×B5有机母液1mL、水解酪蛋白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2.8g、2,4-D 2.0mg、蔗糖30.0g、植物凝胶4.5g、羧苄青霉素100mg和头孢霉素400mg溶于1L蒸馏水，调节pH至5.2，121℃灭菌15min，待冷却至50～60℃时加入经过0.22μM过滤除菌的葡萄糖10g、羧苄青霉素100mg和头孢霉素400mg和乙酰丁香酮，乙酰丁香酮在体系中的终浓度为100μM。

一次筛选培养基：将50×N6大量母液20mL、100×B5微量母液10mL、200×MS铁盐母液5mL、1000×B5有机母液1mL、水解酪蛋白300mg、谷氨酰胺500mg、脯氨酸2.8g、2，4-D2.0mg、蔗糖30.0g、植物凝胶4.5g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至50～60℃时加入经过0.22μM过滤除菌的潮霉素30mg、羧苄青霉素100mg和头孢霉素400mg。

二次筛选培养基：除将一次筛选培养基中的潮霉素30mg替换为潮霉素50mg，其它成分及含量均不变。

分化培养基：将20×MS大量母液50mL、200×MS微量母液5mL、200×MS铁盐母液5mL、200×MS有机母液5mL、水解酪蛋白1000mg、谷氨酰胺500mg、蔗糖30.0g、山梨醇20g、NAA0.4mg、6-BA 2.0mg、KT 1mg和植物凝胶4.5g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min。

生根培养基：将20×MS大量母液25mL、200×MS微量母液2.5mL、200×MS铁盐母液2.5mL、200×MS有机母液2.5mL、蔗糖15g和植物凝胶4.5g溶于1L蒸馏水，调节pH至5.8，121℃灭菌15min，待冷却至50～60℃时加入经过0.22μM过滤除菌的潮霉素30mg。

50×N6大量母液的溶质及其浓度为：141.50g/L KNO₃、20g/L>2PO₄、23.15g/L(NH₄)₂SO₄、9.25g/L>4·7H₂O、8.30g/L>2·2H₂O，溶剂为水，pH自然。

100×B5微量母液的溶质及其浓度为：0.3g/L H₃BO₃、1g/L>4·4H₂O、0.0025g/L>2·6H₂O、0.0025g/L>4·5H₂O、0.2g/L>4·7H₂O、0.025g/L>2MoO₄·2H₂O、0.075g/L>

1000×B5有机母液的溶质及其浓度为：2g/L甘氨酸、100g/L肌醇、1g/L烟酸、1g/L盐酸吡哆醇、10g/L盐酸硫胺素，溶剂为水，pH自然。

20×MS大量母液的溶质及其浓度为：38.00g/L KNO₃，8.80g/L>2·2H₂O，7.40g/L>4·7H₂O，3.40g/L>2PO₄，33.00g/L>4NO₃，溶剂为水，pH自然。

200×MS微量母液的溶质及其浓度为：4.46g/L>4·4H₂O，0.166g/L>3BO₃，1.72g/L>4·7H₂O，0.050g/L>2MoO₄·2H₂O，0.005g/L>4·5H₂O，0.005g/LCoCl₂·6H₂O，溶剂为水，pH自然。

200×MS铁盐母液的溶质及其浓度为：5.56g/L FeSO₄·7H₂O，7.46g/L>2·EDTA·2H₂O，溶剂为水，pH自然。

200×MS有机母液的溶质及其浓度为：20g/L肌醇，100mg/L烟酸，100mg/L盐酸吡哆醇，100mg/L盐酸硫胺素，400mg/L甘氨酸，溶剂为水，pH自然。

osmads14突变体购自韩国突变体数据库(网址为：http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE？JOB＝TEXT&TYPE＝GENE&QUERY＝Os03g54160)，编号为3A-60793.R，其背景为水稻品种Dongjin。

Trizol RNA提取试剂和反转录试剂盒为Promega公司产品。根癌农杆菌EHA105为天根生化科技(北京)有限公司的产品。载体pCAMBIA23a为上海北诺生物科技有限公司的产品。限制性内切酶BamHⅠ、KpnⅠ、HindⅢ和SalⅠ均为TaKaRa公司产品。原位杂交试剂为Roche公司产品。

实施例1、osmads14突变体的鉴定和表型观察

一、osmads14突变体的鉴定

OsMADS14基因包含8个外显子和7个内含子。对osmads14突变体进行测序，结果表明，osmads14突变体中的T-DNA插入在第一个内含子位置，是一个单基因纯合突变体。

二、osmads14突变体的表型观察

osmads14突变体植株的营养生长表型与野生型水稻没有明显差异，但结实率约为野生型水稻的30％～40％左右(图1中A)，并且获得的种子有一定程度的干瘪。与野生型水稻种子的形态相比(图1中B、C、D、E和F)，osmads14突变体种子的种皮变厚褐化，垩白严重，淀粉粒形态由野生型的规则六角棱形变成了圆球形(图1中G、H、I、J和K)。对处于发育过程中的osmads14突变体种子切片观察，结果表明，osmads14突变体种子可以完成受精，但在后续发育过程中淀粉积累不充分，导致种子随机停滞在灌浆的不同阶段，这是灌浆受阻的典型特征，也是导致osmads14突变体种子形态差异的根本原因。

实施例2、OsMADS14基因的表达模式分析

一、实时定量检测种子灌浆前后的样本中OsMADS14基因的相对表达量

进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：

1、获得样本

取处于种子灌浆之前(受精的第1至3天)的osmads14突变体的种子，放入液氮保存，得到样本1－3DAP，以下简称1－3DAP。

取处于种子灌浆早期(受精的第4至6天)的osmads14突变体的种子，放入液氮保存，得到样本4～6DAP，以下简称4－6DAP。

取处于种子灌浆中期(受精的第7至9天)的osmads14突变体的种子，放入液氮保存，得到样本7－9DAP，以下简称7－9DAP。

取处于种子灌浆后期(受精的第10至12天)的osmads14突变体的种子，放入液氮保存，得到样本10－12DAP，以下简称10－12DAP。

取处于种子灌浆完成期(受精的第13至15天)的osmads14突变体的种子，放入液氮保存，得到样本13－15DAP，以下简称13－15DAP。

2、OsMADS14基因的表达模式分析

采用Trizol RNA提取试剂提取步骤1中样本(1－3DAP、4－6DAP、7－9DAP、10－12DAP或13－15DAP)的总RNA，将该总RNA用反转录试剂盒反转录出第一链cDNA，然后以该cDNA为模板，实时定量检测样本中OsMADS14基因的相对表达量(以ACTIN1基因作为内参基因)。检测OsMADS14基因的引物为5’-AATGGGACCAGACACAACCTC-3’和5’-CACACATGACACCAATGGAGA-3’。检测ACTIN1基因的引物为5’-CAAGATGATCTGCCGCAAATGC-3’和5’-TTTAACCAGTCCATGAACCCG-3’。

实验结果见图2中A。结果表明，OsMADS14基因在水稻种子灌浆前期和灌浆中期的相对表达量较高，在水稻种子灌浆后期OsMADS14基因的相对表达量逐渐下降，这与实施例1中步骤二观察到的osmads14突变体的表型完全一致。

二、原位杂交

采用原位杂交试剂对处于种子灌浆之前(受精的第1至3天)、种子灌浆早期(受精的第4至6天)、种子灌浆中期(受精的第7至9天)、处于种子灌浆后期(受精的第10至12天)或种子灌浆完成期(受精的第13至15天)的Dongjin的种子进行原位杂交实验。

实验结果见图2中B、C和D。结果表明，OsMADS14基因的表达主要集中在种子背部负责营养物质运输的维管束组织。

实施例3、利用互补实验验证OsMADS14基因与osmads14突变体表型的相关性

一、互补载体的构建

1、提取Dongjin的基因组DNA并以其作为模板，以人工合成的5’-CGGGATCCATGGGGCGGGGCAAGGTGCA-3’(下划线为限制性内切酶BamHⅠ的酶切识别序列)和5’-GGGGTACCTTAGCCGTTGATGTGGCTCA-3’(下划线为限制性内切酶KpnⅠ的酶切识别序列)为引物进行PCR扩增，得到约755bp的DNA片段1。

2、用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ酶切载体pCAMBIA23a，得到约10.4kb的载体骨架1。

3、将载体骨架1和DNA片段1连接，得到重组质粒pCAMBIA23a－C。

4、提取Dongjin的基因组DNA并以其作为模板，以人工合成的5’-CCAAGCTTTTGAGGAAGTGACGGAGCGG-3’(下划线为限制性内切酶HindⅢ的酶切识别序列)和5’-GCGTCGACCTTCCTCCTGTTCTTCCTCC-3’(下划线为限制性内切酶SalⅠ的酶切识别序列)为引物进行PCR扩增，得到约3000bp的DNA片段2。

5、用限制性内切酶HindⅢ和SalⅠ酶切重组质粒pCAMBIA23a－C，得到约10.4kb的载体骨架2。

6、将载体骨架2和DNA片段2连接，得到重组质粒pCAMBIA23a－P－C。重组质粒pCAMBIA23a－P－C即为互补载体。

根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA23a－P－C进行结构描述如下：将载体pCAMBIA23a的BamHⅠ识别序列和KpnⅠ识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表的序列1所示的DNA分子(编码OsMADS14蛋白的核苷酸序列，即OsMADS14基因)、将HindⅢ识别序列和SalⅠ识别序列间的DNA小片段替换为核苷酸序列是序列表的序列3所示的DNA分子(Dongjin中OsMADS14基因的启动子序列)。重组质粒pCAMBIA23a－P－C可表达序列表中序列2所示的OsMADS14蛋白。

二、水稻的遗传转化

1、将步骤一构建的重组质粒pCAMBIA23a－P－C通过电击导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105-14。

2、将EHA105-14单克隆接种于20mL含卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB液体培养基，28℃、220rpm震荡培养12～16h后，然后按2％-4％(体积百分含量)的比例接种于含乙酰丁香酮100μM的YEB液体培养基，28℃、220rpm振荡培养至OD_600nm值达到0.5左右，得到农杆菌侵染液。

3、osmads14突变体种子去壳脱粒，置于100mL三角瓶中，加入70％(体积百分比)乙醇水溶液浸泡30sec，再置于25％(体积百分比)次氯酸钠水溶液中，120rpm震荡灭菌30min，无菌水冲洗3次，用滤纸吸干水分，然后将种子胚朝下置于诱导培养基上诱导愈伤，30℃全光照诱导7天，长出的愈伤掐芽后用于水稻转化。

4、完成步骤3后，取生长状态较好的胚性愈伤组织，浸泡于步骤2得到的农杆菌侵染液，28℃、80rpm摇床轻摇愈伤，侵染30min，然后，放在铺有一层灭菌滤纸的共培养培养基上，25℃暗培养4天。

5、取步骤4得到的愈伤组织，置于一次筛选培养基，光照交替培养2周后，更换新的一次筛选培养基，愈伤组织继续光照交替培养2周，将原愈伤组织上长出的抗性愈伤组织转移至二次筛选培养基上，光照交替培养2周。

6、完成步骤5后，取生长旺盛的抗性愈伤组织，置于分化培养基，光照交替培养3周，抗性愈伤组织上分化出抗性小芽。

7、完成步骤6后，取抗性小芽，置于生根培养基，光照交替培养，得到抗性植株。待抗性植株长至6～10cm时，进行开放式水培养，长出新根后移栽温室，得到T₀代拟转基因突变体植株。

以T₀代拟转基因突变体植株的基因组DNA为模板，以人工合成的

5'-ATGGGGCGGGGCAAGGTGCA-3'(序列表的序列1的第1-20位)和

5'-TTAGCCGTTGATGTGGCTCA-3'(序列表的序列1的第722-741位的反向互补序列)为引物，进行PCR扩增。PCR反应条件：95℃，5分钟；95℃40秒，56℃40秒，72℃40秒，35个循环；72℃延伸10分钟。

能够扩增获得大小约为741bp条带的即为阳性植株。每个阳性植株即为一个株系。随机选择三个株系，将其命名为互补株系L1、互补株系L2和互补株系L3。

三、转空载体植株的获得

按照步骤二的方法，用载体pCAMBIA23a代替重组质粒pCAMBIA23a－P－C，其它步骤均不变，得到转空载体突变体植株。

四、osmads14突变体的互补检测和表型分析

1、osmads14突变体的互补检测

分别取来自osmads14突变体植株、互补株系L1的植株、互补株系L2的植株、互补株系L3的植株或转空载体突变体植株受精后4-6天的种子，然后采用Trizol RNA提取试剂提取总RNA，将该总RNA用反转录试剂盒反转录出第一链cDNA，然后以该cDNA为模板，RT-PCR检测OsMADS14基因的相对表达量(以ACTIN1基因作为内参基因)。检测OsMADS14基因的引物为5’-AATGGGACCAGACACAACCTC-3’和5’-CACACATGACACCAATGGAGA-3’。检测ACTIN1基因的引物为5’-CAAGATGATCTGCCGCAAATGC-3’和5’-TTTAACCAGTCCATGAACCCG-3’。

部分实验结果见图3(osmads14为osmads14突变体，L1为互补株系L1，L2为互补株系L2，L3为互补株系L3；OsMADS14为OsMADS14基因，ACTIN1为ACTIN1基因)。互补株系L1的植株、互补株系L2的植株或互补株系L3的植株均能够获得741bp的条带，表明OsMADS14基因在互补株系L1的植株、互补株系L2的植株或互补株系L3的植株的种子中表达；osmads14突变体植株或转空载体突变体植株均不能够获得741bp的条带，表明OsMADS14基因在osmads14突变体植株或转空载体突变体水稻植株的种子中不表达。

结果表明，L1、L2和L3均为转OsMADS14基因的水稻植株。

2、转OsMADS14基因水稻植株的表型分析

对野生型水稻植株、转空载体突变体植株、osmads14突变体植株、互补株系L1的植株、互补株系L2的植株或互补株系L3的植株的结实率和千粒重进行比较和统计。实验重复三次，每次重复10穗。

结果表明，转空载体突变体植株和osmads14突变体植株的结实率和千粒重均无显著差异；互补株系L1的植株、互补株系L2的植株或互补株系L3的植株的千粒重有较大程度的恢复，种子形态见图4中A(左图为野生型水稻植株的成熟种子，右图为互补株系L1的植株的成熟种子)，结实率也有较大程度的恢复(图4中B，osmads14为osmads14突变体，WT为野生型水稻)。

上述结果表明，OsMADS14基因在调控水稻种子灌浆中具有重要的作用。

实施例4、OsMADS14基因在调控水稻种子Os02g44108基因的表达量和多糖含量中的应用

取受精后第五天处于灌浆期的野生型水稻植株或osmads14突变体植株的种子进行芯片分析，寻找差异基因，结果发现糖代谢过程中的相关基因发生明显变化，经大量序列分析和RT-PCR验证，发现Os02g44108基因在刚受精的种子中有较强表达，并且与野生型水稻植株相比，osmads14突变体植株的种子中Os02g44108基因的表达量上升(图5中A，WT为野生型水稻)。OsMADS14基因能够结合下游基因启动子区域CArG-box(CC(A/T)6GG)，而Os02g44108基因的启动子区域都有CArG-box，因此通过凝胶阻滞实验和荧光素酶活性检测实验验证OsMADS14蛋白是否能够结合到Os02g44108基因的启动子区域。荧光素酶活性检测实验结果见图5中B(control为Empty NYFP(N-terminal fragment of yellowfluorescent protein))，结果表明，OsMADS14蛋白结合到Os02g44108基因的启动子序列区后导致荧光强度的下降。凝胶阻滞实验也证明OsMADS14蛋白能够结合到Os02g44108基因的启动子区域。上述结果表明，OsMADS14蛋白能够在体外结合到Os02g44108基因的启动子特异区段，并且抑制其表达。

对水稻种子多糖含量进行检测，实验结果见图6(A为野生型水稻种子的过碘酸希夫反应结果，B为osmads14突变体种子的的过碘酸希夫反应结果，C为多糖含量的检测结果)。结果表明，osmads14突变体植株的种子中的多糖含量明显下降。

上述结果表明，OsMADS14基因在调控调控水稻种子Os02g44108基因的表达量和多糖含量中具有重要的作用。

<110> 中国科学院植物研究所

<120> 蛋白质OsMADS14在调控植物种子灌浆、千粒重和结实率中的应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 741

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 1

atggggcggg gcaaggtgca gctgaagcgg atcgagaaca agatcaaccg gcaggtgacc 60

ttctccaagc gcaggtcggg gctgctcaag aaggcgaatg agatctccgt gctctgcgac 120

gccgaggtcg cgctcatcat cttctccacc aagggcaagc tctacgagta cgccaccgac 180

tcatgtatgg acaaaatcct tgaacgttat gagcgctact cctatgcaga aaaggtcctt 240

atttcagctg aatctgacac tcagggcaac tggtgccacg aatataggaa actgaaggct 300

aaggttgaga caatacagaa atgtcaaaag cacctcatgg gagaggatct tgaatctttg 360

aatctcaaag agctgcagca gctggagcag cagctggaaa attcgttgaa acatatcaga 420

tccagaaaga gccaactaat gctcgagtcc attaacgagc ttcaacggaa ggaaaagtca 480

ctgcaggagg agaataaggt cctacagaaa gaactggtgg agaagcagaa agtccagaag 540

caacaagtgc aatgggacca gacacaacct caaacaagtt cctcatcatc ctccttcatg 600

atgagggaag cccttccaac aactaatatc agtaactacc ctgcagcagc tggcgaaagg 660

atagaggatg tagcagcagg gcagccacag catgttcgca ttgggctgcc accatggatg 720

ctgagccaca tcaacggcta a 741

<210> 2

<211> 246

<212> PRT

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 2

Met Gly Arg Gly Lys Val Gln Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1 5 1015

Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Ser Gly Leu Leu Lys Lys Ala

202530

Asn Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Ile Phe

354045

Ser Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Glu Tyr Ala Thr Asp Ser Cys Met Asp

505560

Lys Ile Leu Glu Arg Tyr Glu Arg Tyr Ser Tyr Ala Glu Lys Val Leu

65707580

Ile Ser Ala Glu Ser Asp Thr Gln Gly Asn Trp Cys His Glu Tyr Arg

859095

Lys Leu Lys Ala Lys Val Glu Thr Ile Gln Lys Cys Gln Lys His Leu

100 105 110

Met Gly Glu Asp Leu Glu Ser Leu Asn Leu Lys Glu Leu Gln Gln Leu

115 120 125

Glu Gln Gln Leu Glu Asn Ser Leu Lys His Ile Arg Ser Arg Lys Ser

130 135 140

Gln Leu Met Leu Glu Ser Ile Asn Glu Leu Gln Arg Lys Glu Lys Ser

145 150 155 160

Leu Gln Glu Glu Asn Lys Val Leu Gln Lys Glu Leu Val Glu Lys Gln

165 170 175

Lys Val Gln Lys Gln Gln Val Gln Trp Asp Gln Thr Gln Pro Gln Thr

180 185 190

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Met Met Arg Glu Ala Leu Pro Thr Thr

195 200 205

Asn Ile Ser Asn Tyr Pro Ala Ala Ala Gly Glu Arg Ile Glu Asp Val

210 215 220

Ala Ala Gly Gln Pro Gln His Val Arg Ile Gly Leu Pro Pro Trp Met

225 230 235 240

Leu Ser His Ile Asn Gly

245

<210> 3

<211> 2916

<212> DNA

<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 3

ttgaggaagt gacggagcgg ttaggggttt tggcctcatt ttgaattgat ggggtgagct 60

actctcttgt atcgtgagcc cacttatcga attgataaat ggtgcacttt tttgaaaaaa 120

gaattctata ggagtttctt aaaaaccaca taaatccatt ttcaagttca tggtagtaat 180

gcttcattaa tcggatacta atgtctcagc gtgttttcca tgctaacatg agcaaaatcg 240

aacagggacc agagagatga tttgaggtgt ggggggtgga gactatggtt gagcttcagt 300

taataagata tatacttggt attttgctta cattttcatt tttttcccct tgtcacagca 360

aattccccaa gcataacatg tgagtgtgac aacacagttc ctgttctctt agcttatctt 420

ggattcaatc ccctcatcca aaattaaatt ccatttgttc cctatttcag aggggaattt 480

ctcggggtat ctctagtatt tagcaacact ttaatgtgtc ctatatattc ccttggttca 540

tcccctatag tcatttccca tgattctctg ttcccttggg tccactatgt acaggtattg 600

cacatataaa tcatgaaact accaaatgca ttggcaattg caagttgatg tacaactata 660

gaagtgtgtt tatttgggga tgaagtggga tatgttaggt ccatccttat tttctgagat 720

gggatagccc catctatgtc tttggcataa gggatataat gctcttattt tttttataag 780

gaatgtgagg gtgtggcccg catctcaatt cgagtccgtt aatttttttc atataaagtt 840

gacctggatc tagaaaaata ttccatttca aggattattc tgtcccacct gttatcgaac 900

cgaacaccct gaaaatagat ttgtccccac atgactatct catccctttc aaccaaatac 960

attataactt attgacggtt ctgcagctct ggctcgtttc ggaaaagagc tatgatggag 1020

gctcgggctc agctaatttg gcttacaagc tgagctgagc tttttgtcct cacctagttc 1080

tgcccatggg gaatctaaca ttatcaatca tacaccatat cttaaagaga tgctgctatg 1140

atacgtcaag aagtcaagtt ttaaggtaga atatatggta gttgggaaaa tagaatcatt 1200

acataaatgt tagaaaatag ggatgccaac gcgacatgct tgcaggcttt gaggcccagt 1260

aaacctaatt gtactttttt ttcatccatt tttattatat acttgttgat gaaaattaac 1320

ttagaatatg ggctcttatg taagatagca tcgcctgcat ccttacaaag agacagatag 1380

atccaatcgt acaattaaat cagtaatttt ataagagaat gaaataacat tctagctagt 1440

gtatccaaga atgcacagtg aagtccgtat ttaagtccca tccaaaacga tgtgatgtta 1500

gatctgatcc aaaatattta ataatgtagc tcaagttttg catagcccct gagaaccaga 1560

caagccaatg ttaaaattcc tactgtgcat agggagggca atcaatcatc ctactgcatg 1620

agtaggtccc tgcttcctgt tcaaaatact ttctccgttc tacgaagact acatttttag 1680

aacaaagcta acaaactaat ggtgagagaa gaaaaatcaa atgaacactc attaatacga 1740

aaataaatta tcgtcaaatg ataacctagg aataattttg agttacagat taattatagg 1800

taagaaagaa caaagttaaa gcgatcgaaa atgaagtcta tttaaggacc agtttagtat 1860

ggctctagct atagctccac tcattctata gctggagtcc aaccaaatag tttctacacc 1920

taaaatagaa atatagttgg ctagagcgtt atcacaaaat aaactagaga ggtggagttg 1980

agttcagacc gctacacaac ttcactttaa actttaactc ctaaagttaa attttaagag 2040

atgaagatct actaaacagg ctttaatacg gaggaaatgc attcatccac aaaggtcaaa 2100

agcagcagaa agagaacgaa tgcctttgct gcattcaacc caaagcagag ctgcaggggt 2160

gccaactgcc aatcaggcaa tcatccactc tgggagcgac aggcgacgcc attgatgggc 2220

acaccccctc gccggggccg acgggagacg agacgacgca ggcactgttt tgcggccgac 2280

ccaagccaag ccaagccagg agccatcccg tcccatcacg acgcattgct gccgcggcct 2340

aattgggcag gaaaagccat ggcccacccc caccgcctgg ccagacgaga cggcccaaaa 2400

aaggatcggc ccagaaaagc ccacgagagt acgacgcacg cacgcgtcgc cgggaggcgg 2460

ggcccgggcc ggcgccgcct cgcccaatgg ccgttcgaca gcggaggcga tcgaaaccac 2520

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tccccccatt tcctcctcct cctcctcctc gtcgtcgtcg tctcccccac tcgatcgatc 2640

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aggaggagga ggaggaggag gaagaacagg aggaag 2916

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<211> 1557

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<213> 水稻（Oryza sativa L.）

<400> 4

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