一种催化效率提高的L-乳酸脱氢酶突变体及其构建方法

摘要

本发明公开了一种催化效率提高的L‑乳酸脱氢酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明在L‑乳酸脱氢酶基础上，通过定点突变生物技术改造L‑乳酸脱氢酶分子结构，得到一株L‑乳酸脱氢酶大肠杆菌工程菌，突变酶比酶活提高6.1倍，催化活性提高4.2倍。本发明解决了L‑乳酸脱氢酶催化活性低的限制性问题，为L‑乳酸脱氢酶分子改造提供了一条新的思路。

说明书

技术领域

本发明涉及一种催化效率提高的L-乳酸脱氢酶突变体及其构建方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

NADH依赖型L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase，L-LDH)能够不对称还原α-酮酸生成手性α-羟基酸，其广泛应用于生物制药、材料和食品等行业。例如L-苯乳酸(L-phenyllactic acid)是一种天然抑菌剂，也可由L-LDH不对称还原苯丙酮酸(phenylpyruvic acid，PPA)催化生成，可以替代食品添加剂和动物饲料中的抑菌剂，也可以作为合成多种药物的前体，还可以作为一种潜在的聚乳酸替代物，合成聚苯乳酸新型高分子材料。

一些化学和生物方法可用于合成手性α-羟基酸，但与化学法相比，生物酶法由于其条件温和，环境友好，生成产物纯度高等优点，已成为主要合成方法。但现已发现的大多数野生型L/D-LDH对带有长脂肪链或芳香基团侧链的底物(苯甲酰甲酸，PPA，草酰乙酸等)表现出较低的活性，在一定程度上限制了L/D-LDH的广泛应用。随着人们对L/D-LDH的结构、功能和作用机理的认识不断深入，采用基因工程技术改造酶分子以获得具有优良酶学性质的L/D-LDH的研究得到了迅速发展。Jiang等采用定点突变方法将Pseudomonas stutzeriSDM L-LDH中的Val108替换为Ala，获得一个新突变酶，该突变酶对L-扁桃酸的催化效率(kcat/Km)较野生型酶提高了50.1倍。Zheng等在L.bulgaricus ATCC 11842D-LDH的基础上，将其52位点的Tyr突变为Leu，使得突变酶对PPA的活性显著提高。Aslan等对Geobacillus stearothermophilus的L-LDH(BsLDH)实施了定点饱和突变，从突变文库中，获得了一个最优突变体1G7(D101Y102)，其催化PPA的活性明显高于BsLDH。

本发明采用单点突变技术，基于同源建模方法，通过突变特定氨基酸优化L-乳酸脱氢酶分子结构、提高其催化活性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种催化活性提高的L-乳酸脱氢酶突变体及其构建方法。

本发明提供一种催化活性提高的L-乳酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。

所述突变体的核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。

所述突变体是在如序列SEQ ID NO.2所示的氨基酸的基础上，将第229位的异亮氨酸突变成了丙氨酸(I229A)。

所述编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列是SEQ ID NO.4所示的序列。

本发明还提供一种表达所述L-乳酸脱氢酶突变体的基因工程菌。

所述基因工程菌的制备方法，是以携带编码L-乳酸脱氢酶基因的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体基因的重组质粒，将重组质粒转化到大肠杆菌BL21中即得到重组大肠杆菌基因工程菌。

所述表达载体是以下任意一种：pET-22b(+)、pET-28a(+)、pET-32a(+)、pET-41a(+)。

所述表达载体，在本发明的一种实施方式中是pET-22b(+)。

所述大肠杆菌宿主菌是以下任意一种：E.coli BL21、E.coli JM109、E.coli DH5α、或E.coli TOP10。

所述大肠杆菌宿主菌，在本发明的一种实施方式中是E.coli BL21。

所述的制备方法，具体是：

(1)以携带序列如SEQ ID NO.4所示Lcldh基因的重组质粒pET-22b(+)-Lcldh为模板，序列如SEQ ID NO.5所示的F1primer、序列如SEQ ID NO.6所示的R1primer为引物，进行突变PCR，即得到编码的第229位氨基酸由异亮氨酸突变成了丙氨酸的重组质粒pET-22b(+)-Lcldh^I229A；

(2)将上一步得到的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌基因工程菌LcLdhBL21。

本发明的有益效果：本发明在L-乳酸脱氢酶基础上，通过定点突变生物技术改造L-乳酸脱氢酶分子结构，得到一株L-乳酸脱氢酶大肠杆菌工程菌，突变酶比酶活提高6.1倍，催化活性提高4.2倍。本发明解决了L-乳酸脱氢酶催化活性低的限制性问题，为L-乳酸脱氢酶分子改造提供了一条新的思路。

附图说明：

图1为重组乳酸脱氢酶LcLDH^I229A的SDS-PAGE图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

L-乳酸脱氢酶酶活测定方法：

总反应体系包括50mmol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，0.2mmol/LNADH，5mmol/LPPA，对照组中不含NADH，其他成分相同。混匀后于35℃保温5min，加入适量的酶液。检测NADH在340nm处吸收值的变化。酶活性单位(U)定义为：在上述条件下，每分钟催化氧化1μmol NADH所需要的酶量。比活性定义为每毫克酶蛋白所含的酶活单位数(U/mg)。

实施例1：突变酶基因及其表达质粒的构建

将扩增得到的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的基因Lcldh，扩增产物与pUCm-T连接，转化E.coli JM109，经蓝白斑筛选、菌液PCR验证和DNA测序。将测序正确的重组质粒命名为pUCm-T-Lcldh。用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切pUCm-T-Lcldh，回收Lcldh，与经同样双酶切的pET-28a(+)连接，获重组质粒pET-28a(+)-Lcldh。

以pET-28a(+)-Lcldh重组质粒为模板，以F1primer(序列如SEQ ID NO.5所示)、R1primer(序列如SEQ ID NO.6所示)为引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体基因的重组质粒，命名为pET-22b(+)-Lcldh^I229A。

实施例2：产L-乳酸脱氢酶大肠杆菌工程菌构建

将实施例1得到的重组质粒pET-22b(+)-Lcldh^I229A转化E.coli>

1)接种LB平板活化的E.coli BL21于2mL LB培养基中，37℃，220r/min过夜培养；2％接种上述培养液于5mL LB培养基中，37℃，220r/min培养4h；

2)取上述菌液1.4mL放入1.5mLEP管中，冰浴10min，4000r/min离心2min，收集菌体；

3)加入1mL预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬上述细胞，冰浴10min，4000r/min，离心2min，收集菌体；

4)加入100μL预冷的0.1M CaCl₂溶液悬浮上述细胞，4℃保存30min即可转化；

5)取100μL感受态细胞于冰上完全解冻后，轻轻将细胞均匀悬浮，加入5μL连接液，轻轻混匀，冰上放置30min；

6)42℃水浴热激90s，冰浴15-20min；

7)加入400μL LB培养基，37℃，220r/min振荡培养1h；

8)室温下4000r/min离心5min，去掉450μL上清液，将剩余菌液吹打混匀后，涂布于Kan板上；

8)挑取上述平板中白色菌落，进行菌液PCR验证，验证正确的重组菌送至测序公司测序，命名测序正确的重组菌为LcLdhBL21。

实施例3：重组大肠杆菌诱导表达

将实施例2构建的重组菌LcLdhBL21在LB平板上活化，挑取单菌落至2mL LB培养基中，37℃、220r/min培养12h，按2％接种量接种至100mL/500mL LB培养基中，37℃，220r/min培养2h后加IPTG至终浓度0.4mM，20℃诱导表达8h，8000r/min离心5min收集菌体，超声破碎后得到粗酶液，将粗酶液用镍柱纯化，具体方法如下：

1)用超纯水洗柱3次以上；

2)用新配制的结合液洗柱3次；

3)上样：用水膜过滤发酵液，若量多，可反复过柱；上样量<＝8mL，一般4mL左右；用盖子将下方漏孔堵住，4℃结合30min或者过夜，收集流出液，可用于SDS-PAGE对照；

4)用结合液洗柱，收集穿透液(含杂蛋白或未被吸附的蛋白)，可用于SDS-PAGE对照；

5)洗脱液洗脱，收集洗脱样；

6)洗柱保存：5mL结合液、10mL超纯水、10mL 20％乙醇、加入5mL 20％乙醇4℃保存。

分析纯化后的重组L-乳酸脱氢酶(LcLDH^I229A)酶学性质，如表1，LcLDH^I229A催化效率提高了4.2倍，同时比酶活提高6.1倍。由于底物亲和力及催化效率的提高，增加了突变体LcLDH^I229A的比酶活。这表明该发明通过突变的创新方式提高了L-乳酸脱氢酶的酶学性质。

表1 LcLDH^I229A突变体反应动力学参数

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种催化效率提高的L-乳酸脱氢酶突变体及其构建方法

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Val Ala Ser Ile Thr Asp Lys Asp His Gln Lys Val Ile Leu Val Gly

1 5 1015

Asp Gly Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Tyr Ala Met Val Leu Gln Gly

202530

Ile Ala Gln Glu Ile Gly Ile Val Asp Ile Phe Lys Asp Lys Thr Lys

354045

Gly Asp Ala Ile Asp Leu Ser Asn Ala Leu Pro Phe Thr Ser Pro Lys

505560

Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Asp Ala Lys Asp Ala Asp Leu Val

65707580

Val Ile Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp

859095

Leu Val Asn Lys Asn Leu Lys Ile Leu Lys Ser Ile Val Asp Pro Ile

100 105 110

Val Asp Ser Gly Phe Asn Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val

115 120 125

Asp Ile Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Leu Ser Gly Phe Pro Lys Asn

130 135 140

Arg Val Val Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Gln

145 150 155 160

Ser Ile Ala Glu Met Val Asn Val Asp Ala Arg Ser Val His Ala Tyr

165 170 175

Ile Met Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Val Trp Ser His Ala

180 185 190

Asn Ile Gly Gly Val Thr Ile Ala Glu Trp Val Lys Ala His Pro Glu

195 200 205

Ile Lys Glu Asp Lys Leu Val Lys Met Phe Glu Asp Val Arg Asp Ala

210 215 220

Ala Tyr Glu Ile Ala Lys Leu Lys Gly Ala Thr Phe Tyr Gly Ile Ala

225 230 235 240

Thr Ala Leu Ala Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu Asn Ala

245 250 255

Val Leu Pro Leu Ser Val Tyr Met Asp Gly Gln Tyr Gly Leu Asn Asp

260 265 270

Ile Tyr Ile Gly Thr Pro Ala Val Ile Asn Arg Asn Gly Ile Gln Asn

275 280 285

Ile Leu Glu Ile Pro Leu Thr Asp His Glu Glu Glu Ser Met Gln Lys

290 295 300

Ser Ala Ser Gln Leu Lys Lys Ala Leu Thr Asp Ala Phe Ala Lys Asn

305 310 315 320

Asp Ile Glu Thr Arg Gln

325

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Val Ala Ser Ile Thr Asp Lys Asp His Gln Lys Val Ile Leu Val Gly

1 5 1015

Asp Gly Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Tyr Ala Met Val Leu Gln Gly

202530

Ile Ala Gln Glu Ile Gly Ile Val Asp Ile Phe Lys Asp Lys Thr Lys

354045

Gly Asp Ala Ile Asp Leu Ser Asn Ala Leu Pro Phe Thr Ser Pro Lys

505560

Lys Ile Tyr Ser Ala Glu Tyr Ser Asp Ala Lys Asp Ala Asp Leu Val

65707580

Val Ile Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp

859095

Leu Val Asn Lys Asn Leu Lys Ile Leu Lys Ser Ile Val Asp Pro Ile

100 105 110

Val Asp Ser Gly Phe Asn Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val

115 120 125

Asp Ile Leu Thr Tyr Ala Thr Trp Lys Leu Ser Gly Phe Pro Lys Asn

130 135 140

Arg Val Val Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Thr Ala Arg Phe Arg Gln

145 150 155 160

Ser Ile Ala Glu Met Val Asn Val Asp Ala Arg Ser Val His Ala Tyr

165 170 175

Ile Met Gly Glu His Gly Asp Thr Glu Phe Pro Val Trp Ser His Ala

180 185 190

Asn Ile Gly Gly Val Thr Ile Ala Glu Trp Val Lys Ala His Pro Glu

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Thr Ala Leu Ala Arg Ile Ser Lys Ala Ile Leu Asn Asp Glu Asn Ala

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260 265 270

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290 295 300

Ser Ala Ser Gln Leu Lys Lys Ala Leu Thr Asp Ala Phe Ala Lys Asn

305 310 315 320

Asp Ile Glu Thr Arg Gln

325

<210> 3

<211> 978

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtggcaagta ttacggataa ggatcaccaa aaagttattc tcgttggtga cggcgccgtt 60

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gacattttca aggacaagac aaagggtgac gcgattgact tgagcaacgc gctcccattc 180

acaagtccta agaagattta ttcagctgaa tacagcgatg ctaaggatgc tgatctggtt 240

gttatcacag ctggcgctcc tcagaagcct ggcgaaactc gtttggactt ggttaacaag 300

aacttgaaga tcttgaagtc cattgttgac ccaatcgttg attccggctt taacggtatt 360

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tccgtttaca tggatggtca atatggcttg aacgacatct acatcggtac cccagctgtg 840

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<210> 4

<211> 978

<212> DNA

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<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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