促红细胞生成素的等电聚焦电泳方法

摘要

本发明公开了促红细胞生成素的等电聚焦电泳方法，其是使用BIO‑RAD 111型电泳仪进行等电聚焦电泳，其中，每5mL制胶配方包括：25wt％丙烯酰胺单体溶液1mL、10.5M尿素3.33mL、60wt％蔗糖0.412mL、40wt％pH 2～4两性电解质溶液0.183mL、40wt％pH 3～10的两性电解质溶液0.075mL，最后加入预先混合的催化剂溶液0.1wt％FMN‑Na 25μl+10wt％AP7.5μl+TEMED 1.5μl；加样前先预电泳：200V，10min；电泳程序：第一阶段50V，30min；第二阶段100V，60min；第三阶段200V，30min；第四阶段450V，60min；第五阶段590V，直到电流为0。本发明方法可以将促红细胞生成素的不同等电点的电荷异构体分离开来，且对上限电压要求不高，不需要设备附加冷却装置。

说明书

技术领域

本发明属蛋白质电泳技术领域，更具体地说，本发明涉及可以分离促红细胞生成素的电荷异构体的等电聚焦电泳方法。

背景技术

人体中的促红细胞生成素(Erythropoietin，简写EPO)是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。它是一种含唾液酸的酸性糖蛋白，造血细胞因子超家族成员之一。未分化的干细胞分化成红细胞系干细胞，促红细胞生成素在此发挥作用，使之变为前成红细胞。对进一步再成熟为成红血细胞、网织红细胞，血红蛋白的合成以及流入末梢血管等均有促进作用。一般在贫血和低氧状态时，根据身体组织对氧的需要，促红细胞生成素的供给量将增加，但在肾脏贫血时其含量则非常低。服用红细胞生成素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度(即增加血液中红细胞百分比)。1989年第一个重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin，rHuEPO)制剂Epogen获美国食品药品监督管理局(FDA)批准。rHuEPO主要用于治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血、癌症及骨髓衰竭导致的贫血、失血后贫血等。

在某一pH的溶液中，氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH值称为该氨基酸或蛋白质的等电点。等电聚焦电泳的原理是两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的pH值有关。带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的pH值使相应的蛋白质不再带电)时，电流达到最小，不再移动。

EPO的等电聚焦电泳的方法介绍：

《中华人民共和国药典》2015年版三部0541电泳法第六法等电聚焦电泳法中的第二法与重组人促红素注射液(CHO细胞)中的“3.1.7等电聚焦”介绍了利用水平电泳槽对EPO进行等电聚焦电泳的方法，其主要内容如下：

1.仪器装置：恒压或恒流电源、带有冷却装置的水平电泳槽和制胶模具。

2.主要试剂

(1)A液：称取丙烯酰胺29.lg、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至100mL，双层滤纸滤过，避光保存。

(2)B液：10％过硫酸铵溶液，临用前配制。

(3)标准品：所选用的标准品的等电点范围一般应涵盖供试品的等电点。

(4)固定液：称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g,加水溶解并稀释至300mL。

(5)脱色液(平衡液)：取95％乙醇500mL、冰醋酸160mL，加水稀释至2000mL。

(6)染色液：称取考马斯亮蓝G250(或R250)0.35g，加脱色液300mL，在60～70℃水浴中加热，使溶解。

(7)保存液：取甘油30mL，加脱色液300mL，混匀。

(8)正极液(0.5mol/L磷酸溶液)：量取磷酸50mL，加水至1800mL。

(9)负极液(0.2mol/L氢氧化钠溶液)：称取氢氧化钠8g，加水溶解并稀释至1000mL。

3.制胶方法：取尿素9g、30％丙烯酰胺单体溶液6.0mL、40％pH 3～5知两性电解质溶液1.05mL，40％pH 3～10的两性电解质溶液0.45mL、水13.5mL，充分混匀后，加人N,N,N',N'-四甲基乙二胺15μL和10％过硫酸铵溶液0.3mL，脱气后制成凝胶。将配制好的凝胶液混匀后缓慢地注人水平模具内，室温下聚合。将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放在冷却板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免产生气泡。

4.电泳程序：用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条，然后分别放于正极与负极上，将加样滤纸放在凝胶上。分别加供试品溶液与标准品溶液各20μL。将电极对准电极条的中心，加盖，在上限电压2000V、上限电流50mA、功率为每lcm胶1W、温度4℃的电泳条件下，开始电泳，电泳30分钟后去掉加样滤纸，待电流不再变化时停止电泳。如有必要可在起始电压200V下预电泳30分钟。

5.固定、染色与脱色：与染色电泳结束后，即将凝胶放人固定液中固定20分钟以上；取出，放人平衡液中20～30分钟；再放人染色液中40～60分钟，然后用脱色液浸洗至背景无色，取出放入保存液中30分钟；亦可做成干胶保存。

BIO-RAD的111型水平电流仪说明书提供的等电聚焦的方法主要内容包括：

1.仪器装置：Model 111Mini IEF Cell

2.主要试剂

(1)25％丙烯酰胺溶液：称取丙烯酰胺24.25g，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺0.75g，加适量水溶解，并稀释至100mL，用0.45μm滤器滤去杂质，4℃、避光保存1个月。

(2)25％甘油：25g甘油溶于50mL水，再用水稀释至100mL。

(3)0.1％FMN-Na溶液：50mgFMN-Na溶于50mL水中。4℃、避光保存1个月

(4)10％过硫酸铵溶液：100mg过硫酸铵溶于1mL水，混匀。

(5)N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED：室温、避光保存。

(6)固定液：125g三氯乙酸，40g磺基水杨酸，300mL甲醇，加水稀释到1000mL。

(7)染色液：400mg考马斯亮蓝G-250，冰醋酸100mL，5g硫酸铜(加入乙醇前将硫酸铜溶于水)，270mL乙醇，加水稀释至1000mL。

(8)脱色液A：120mL乙醇，70mL冰醋酸，5g硫酸铜(加入乙醇前将硫酸铜溶于水)，加水稀释至1000mL。

(9)脱色液B：250mL乙醇，70mL冰醋酸，加水稀释至1000mL。

3.制胶(以下配方可以配制两块胶)

(1)单体－两性电解质溶液：水5.5mL、25％丙烯酰胺溶液2.0mL、25％甘油2.0mL、40％的两性电解质0.5mL

(2)催化剂溶液：10％AP15μL、0.1％FMN-Na50μL、TEMED3μL

(3)取一支持膜，分别在两面滴上水，水扩散的一面为亲水面，反之为疏水面。在玻璃板一面的一端加水，将支持膜的疏水面与水接触，慢慢让支持膜与玻璃板紧密相贴，去除支持膜与玻璃板间的气泡和多余的水，并将支持膜亲水面向下置于胶槽上。将配好的单体－电解质溶液脱气5min，加入混合好的催化剂溶液，轻轻搅拌或振荡混匀。用移液管取胶液，从玻璃板的一边到另外一边缓慢地移动移液管，让胶液自动流入支持膜内与胶槽之间的夹缝内，流入过程中防止气泡产生。在室温、强光下聚合45分钟；将聚合的凝胶和玻璃板撬出，胶面向上平置，在强光继续放置15分钟以内以使胶完全聚合。

4.电泳条件：第一阶段100V，15min；第二阶段200V，15min；第三阶段450V，60min。

5.固定、染色与脱色：电泳结束后，即将凝胶放入固定液中30min；取出放入染色液染色1-2h；而后放入脱色液A中，换液2～3次，浸洗至背景几乎无色，再放入脱色液B中，去除残余的染料和CuSO4。染色和脱色的总时间不能超过3～4个小时(浸泡时间过长可能使胶脱离支持膜)。

两种方法的比较：

中国药典提供的方法所需的上限电压很高(2000V)，水平电泳仪需冷却装置，这对电泳仪电源与电泳仪都有很高的要求。BIO-RAD的111型水平电流仪构造简单，操作非常方便；电极为可拆卸的石墨电极，清洗与保存方便；不需电泳液与电极缓冲液，将点样后将凝胶直接放于电极上即可开始电泳；由于电泳方法中提供的最大电压为450V，对电泳仪电源要求不会太高；此电泳仪无需冷却装置，但是无法将EPO的各条带分开，所有条带都压缩在酸性端成为一个条带。现试图寻找一种方法利用BIO-RAD的111型水平电泳仪分离EPO的不同等电点条带(电荷异构体)。

发明内容

本发明的目的在于：克服现有技术中对上限电压要求很高，以及无法将EPO的各条带分开的缺陷，提供一种可将EPO的各条带分开的等电聚焦电泳方法。

参照BIO-RAD 111型等电聚焦电泳仪说明书提供的电泳方法，无法将EPO的各条带分开，所有条带都压缩在酸性端成为一个条带。在此基础上，本发明对电泳条件进行了一系列调整，成功分离EPO不同等电点的条带，调整内容主要包括以下两方面：

(1)调整制胶配方：25wt％丙烯酰胺单体溶液1mL，10.5M尿素3.33mL，60wt％蔗糖0.412mL，40wt％pH 2～4两性电解质溶液0.183mL，40wt％pH 3～10的两性电解质溶液0.075mL，最后加入预先混合的催化剂溶液(0.1wt％FMN-Na 25μl、10wt％AP 7.5μl、TEMED1.5μl)，总体积为5mL。

(2)增加加样前的预电泳(200V下电泳10min)。

(3)调整电泳程序：增加低电压过程，以使不同等电点的条带尽量分开，同时加大聚焦电压，使相同等电点蛋白尽量聚集在一条很窄的条带上：第一阶段50V，30min；第二阶段100V，60min；第三阶段200V，30min；第四阶段450V，60min；第五阶段590V，直到电流为0，电源鸣叫。

为了达到更好的分离效果，所述等电聚焦电泳的染色时间至少为120min。

为了达到更好的分离效果，正极液为1mol/L磷酸溶液，负极液为1mol/L氢氧化钠溶液。

为了达到更好的分离效果，所述制胶后在4W的LED光下聚合1小时30分钟。

本发明上述方法适合分离等电点在2～6范围内的促红细胞生成素。

相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明方法通过调整制胶配方和电泳程序，可以将促红细胞生成素的不同等电点的电荷异构体分离开来，且对上限电压要求不高，不需要设备附加冷却装置。

附图说明

图1为按照BIO-RAD的111型水平电流仪说明书提供的等电聚焦的方法进行等电聚焦电泳分离EPO。

图2为按照本发明方法进行等电聚焦电泳分离EPO。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。

除水以外，以下实施例和实验例中用于配制试液的试剂均为市购。

实施例

1.仪器装置

电流仪电源DYY-8C型，生产厂家：北京六一仪器厂。

电泳仪Model 111Mini IEF Cell，生产厂家：BIO-RAD。

水平摇床WD-9405B型，生产厂家：北京六一仪器厂。

2.试剂与试液配制

(1)水(电阻率不低于18.2MΩ.cm)。

(2)25wt％丙烯酰胺：称取丙烯酰胺24.25g，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺0.75g，加适量水溶解，并稀释至100mL，用0.45μm滤器滤去杂质，置棕色试剂瓶中，2～8℃保存，有效期6个月。

(3)10.5M尿素：称取31.53g尿素溶解于适量水中，最后加水至50mL。

(4)60wt％蔗糖：称取6g蔗糖溶解于5mL水中，最后加水至10mL。

(5)0.1wt％FMN-Na溶液：100mgFMN-Na溶于10ml水配成1％FMN-Na溶液，然后取1ml1％FMN-Na溶液溶于9ml水中。

(6)10wt％过硫酸铵溶液：称取100mg过硫酸铵溶于1mL水，混匀。

(7)N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED)：室温、避光保存。

(8)40％两性电解质(pH 2～4)：2～8℃、避光保存。

(9)40％两性电解质(pH 3～10)：2～8℃、避光保存。

(10)固定液：125g三氯乙酸，40g磺基水杨酸，300mL甲醇，加水稀释到1000mL。

(11)染色液：400mg考马斯亮蓝G-250，冰醋酸100mL，5g硫酸铜(加入乙醇前将硫酸铜溶于水)，270mL乙醇，加水稀释至1000mL。

(12)脱色液A：120mL乙醇，70mL冰醋酸，5g硫酸铜(加入乙醇前将硫酸铜溶于水)，加水稀释至1000mL。

(13)脱色液B：250mL乙醇，70mL冰醋酸，加水稀释至1000mL。

(14)正极液(1mol/L磷酸溶液)：量取磷酸6.84mL，加水至100mL。

(15)负极液(1mol/L氢氧化钠溶液)：称取氢氧化钠4g，加水溶解并稀释至100mL。

3.测定法

3.1制胶

取一支持膜，分别在两面滴上水，水扩散的一面为亲水面，反之为疏水面。

在玻璃板一面的一端加水，将支持膜的疏水面与水接触，慢慢让支持膜与玻璃板紧密相贴，去除支持膜与玻璃板间的气泡和多余的水，并将支持膜亲水面向下置于胶槽上。

取25wt％丙烯酰胺单体溶液1mL，10.5M尿素3.33mL，60wt％蔗糖0.412mL，40wt％pH2～4两性电解质溶液0.183mL，40wt％pH 3～10的两性电解质溶液0.075mL，混匀后将配好的单体－电解质溶液脱气5min，最后加入预先混合的催化剂溶液(0.1wt％FMN-Na 25μl、10wt％AP 7.5μl、TEMED 1.5μl)，轻轻搅拌或振荡混匀。用10mL移液管吸取胶液，从玻璃板的一边到另外一边缓慢地移动移液管，使胶液流入支持膜内与胶槽之间的夹缝内，流入时防止气泡产生，在室温、强光(可用4W的LED台灯)下聚合1小时30分钟左右。

3.2样品处理：通过超滤离心将EPO的缓冲液盐溶液置换为超纯水，并将浓度调整为3～5mg/mL。

3.3电泳：电泳前将电泳槽与电极置一大盆子装的冰浴中冷却。

3.3.1预电泳：先在电泳槽底部加一薄层超纯水。分别用正极液与负极液分别润湿正极与负极，将凝胶玻璃板平行地置于电极上，凝胶玻璃板长轴与电极长轴平行。滑动关上电泳槽盖并置于冰浴中后即于200V下电泳10min。

3.3.2加样：停止电泳，从冰浴中取出电泳槽，取下凝胶玻璃板。将加样模具平行置于胶上，加样板长轴与凝胶长轴平行。同时注意，在与凝胶长轴垂直的方向上，两边应各留出1cm长的部分供电极接触。用0.1～2.5μL微量加样器加样，加样量2μl/孔，同时加蛋白等电点标准品。加完样后等待5～10min，使样品扩散到胶中。

3.3.3电泳：点样后，分别用正极液与负极液再次分别润湿正极与负极。将胶置于Model 111Mini IEF cell的电极上，胶长轴应与电极长轴平行。滑动关上电泳槽盖后置于大盆子装的冰浴中。启动开始按钮开始电泳。第一阶段50V，30min；第二阶段100V，60min；第三阶段200V，30min；第四阶段450V，90min；第五阶段590V，直到电流为0，电源鸣叫即关闭电源，停止电泳。电泳过程中冰会不断融化，产生过多的水会导致短路，电泳自动停止，所以需要不定时地除去电泳仪周围的水。

3.4固定、染色与脱色：电泳结束后，即将凝胶放入固定液中固定60min；取出放入染色液染色120min；用脱色液A脱色2～3次，用脱色液B脱色1次，直到背景无色。凝胶可晾干，也可以做成干胶永久保存。

实验例

样品为促红细胞生成素，商品名为Darbepoetin Afla，生产厂家为KyowaHakko Kirin Co.,Ltd，批号为16802E BPR1610005，生产日期为2016-08-01，有效期至2018-07-31。等电点标准品(Marker)PI范围为3.5-10.7，生产厂家为SERVA，货号为39212.01。电泳结果如图1与图2所示。

图1为按照BIO-RAD的111型水平电流仪说明书提供的等电聚焦的方法进行等电聚焦电泳分离EPO。其制胶配方为：水2.75mL、25％丙烯酰胺溶液1.0mL、25％甘油1.0mL、40％pH2～4两性电解质溶液0.183mL，40％pH3～10的两性电解质溶液0.075mL，催化剂溶液为0.1％FMN-Na 25μl、10％AP 7.5μl、TEMED 1.5μl。

图2为按照实施例方法进行等电聚焦电泳分离EPO。

比较图1与图2可知，图1中EPO泳道未见分离的条带，图2中EPO泳道可见5条分离的条带，各条带等电点均低于3.5，同时由于两性电解质酸性端的等电点为2，所以EPO条带等电点介于2～3.5之间，实验结果表明本发明改进后的等电聚焦电泳方法能成功分离EPO的不同等电点的条带。

根据上述说明书的揭示和指导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。