促红细胞生成素/促红细胞生成素受体对肝癌细胞增殖的影响

摘要

研究目的：
　　促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)是内源性的促进红细胞生成的重要因子，近年来，其在多种肿瘤中表现出的促瘤作用引起了人们的广泛关注。然而，EPO及其受体(Erythropoietin receptor,EPOR)在肝癌发展中扮演的角色仍不清楚。本研究着重探讨EPO/EPOR在肝癌细胞增殖中的作用，尤其是肿瘤的缺氧微环境对此过程的影响。
　　研究方法：
　　1.构建小鼠肝癌皮下移植瘤模型：小鼠分为对照组，模型组和给药组，每组8只。按照课题组已发表的皮下移植小鼠肝癌H22细胞法，建立肝癌移植瘤模型。对照组同时给予生理盐水皮下注射。给药组：按1μg/kg脂氧素(LipoxinA4,LXA4)(溶于10％乙醇)隔天腹腔注射给药。模型组：同时给予等量的10%乙醇(LXA4溶剂)。观察小鼠每天生长状况并测量肿瘤大小。14天后分别取肿瘤组织和正常肝组织进行检测。
　　2.免疫组织化学法检测人肝癌组织，癌旁组织，小鼠移植瘤肝癌组织及正常肝组织中EPO、EPOR、缺氧诱导因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)和Ki67的表达水平。
　　3.人肝癌细胞HepG2分别在常氧和缺氧条件下培养24、48、72h。PCR和Western Blot分别从mRNA和蛋白水平检测EPO与EPOR的表达及LXA4对它们表达的影响。
　　4.HepG2分别在常氧与缺氧条件下经重组人促红细胞生成素(Recombinant human erythropoientin,rHuEPO)、可溶性促红细胞生成素受体(soluble erythropoientin receptor,soluble-EPOR)、LXA4处理24、48、72h。MTT法及(CFDA-SE标记)-流式细胞仪检测((Carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester)-labeled/Flow cytometry-detected,CFSE-FCM)分别检测HepG2细胞在以上处理后细胞生长活力与增殖分裂能力变化；
　　5.Western Blot检测肝癌细胞HepG2中增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)的表达。
　　6.免疫荧光法检测HepG2细胞在常氧和缺氧下分别培养24、48、72h后 EPOR的表达分布情况。
　　研究结果：
　　1.模型动物皮下接种H22细胞后成瘤，且随培养时间的延长，瘤块逐渐变大。给药组与模型组相比，肿瘤生长明显较慢，在移植瘤接种的第14天，肿瘤体积明显较小。结果证实，小鼠肝癌皮下移植瘤模型复制成功。
　　2.免疫组化结果表明：人肝癌组织及小鼠皮下移植瘤组织中，EPO、EPOR、HIF-1α及Ki67均着色明显，呈阳性表达；而 LXA4处理的小鼠上述各指标的表达明显弱于模型组。
　　3.与常氧相比，缺氧培养下HepG2细胞中EPO、EPOR mRNA及蛋白均上调。
　　4.MTT法与CFSE-FCM检测结果均表明缺氧培养下HepG2增殖能力明显高于常氧培养。同时，Western blotting检测显示PCNA蛋白表达增高。
　　5.常氧条件下，rHuEPO对HepG2增殖无明显影响；但在缺氧培养下可显著促进HepG2增殖，其中10 IU/ml的rHuEPO促增殖作用最为明显；PCNA表达增高。同时，soluble-EPOR和LXA4均明显抑制缺氧诱导的HepG2细胞的生长活力和增殖分裂增加；并抑制了PCNA表达。
　　6.缺氧培养下，PCNA蛋白表达增高；rHuEPO刺激后，PCNA表达增高；soluble-EPOR处理后，PCNA表达下调。
　　7.常氧下，HepG2细胞内EPOR主要分布于胞核，少量在胞质；缺氧刺激下，胞质和胞膜中的分布明显增多。
　　8.在缺氧下，LXA4抑制HepG2细胞的增殖。
　　研究结论：在缺氧环境中，肝癌细胞高表达EPO/EPOR，后者促进HepG2细胞的增殖；LXA4通过抑制缺氧下EPO的高表达而抑制HepG2细胞的增殖。

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中英文缩略词

1 前言

2 内容与方法

2.1实验设备

2.2 主要试剂

2.3实验方法

3 结果与分析

3.1肝癌组织高表达EPO，EPOR，HIF-1α和Ki67

3.2 缺氧上调肝癌细胞HepG2中EPO、EPOR的表达

3.3 rHuEPO 促进HepG2的增殖

3.4 缺氧刺激肝癌细胞HepG2快速增殖

3.5缺氧通过EPO/EPOR通路刺激HepG2细胞的增殖

3.6 缺氧刺激下HepG2细胞膜上EPOR表达增高

3.7 LXA4通过抑制EPO的表达抑制HepG2细胞的增殖

4 讨论

5 小 结

参考文献

综述: 促红细胞生成素的多效性作用

致谢