一种用于诊断评估乳腺癌的试剂盒、甲基化HOXA4/DPP6基因的检测及其应用

摘要

本发明涉及一种用于诊断评估乳腺癌的试剂盒、甲基化HOXA4/DPP6基因的检测及其应用，更具体的涉及HOXA4/DPP6基因、HOXA4/DPP6基因的甲基化检测及其在制备乳腺癌诊断、检测和筛查药物中的应用以及用于上述用途的试剂盒。本发明研究发现HOXA4/DPP6基因在乳腺癌患者肿瘤组织中甲基化程度明显高于肿瘤组织旁边的正常组织，而且甲基化水平同肿瘤进展密切相关，本发明提供了一种新的乳腺癌诊治靶点，并给出了针对其的试剂盒，其是检测乳腺癌进展以及在人群筛查和乳腺癌诊断的一种新方法，具有重要的临床应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及甲基化HOXA4/DPP6基因及其应用，更具体的涉及一种用于诊断评估乳腺癌的试剂盒、HOXA4/ DPP6基因、HOXA4/DPP6基因的甲基化检测及其在乳腺癌中的应用。

背景技术

全球肿瘤流行病统计数据(GLOBOCAN)认为乳腺癌是中国女性最常见的癌症，年龄标化率(ASR)为每10万人21.6例。据赫捷院士发表的《Cancer Statistics in China,2015》数据，在我国乳腺癌居女性肿瘤发病率第一位，2015年新增病例为27.2万，城市新发女性乳腺癌占 19.0万。根据中国国家肿瘤登记中心的数据，城市地区的ASR(34.3例 /10万女性)是农村地区的2倍(17.0例/10万女性)。社会经济发达的沿海城市发病率最高，广州乳腺癌ASR为46.6例/10万女性。在中国，诊断为乳腺癌的平均年龄为45-55岁，比西方女性更加年轻。全球乳腺癌年平均增幅达3.1％，我国各地区1988-2007年间乳腺癌发病率增长 1.2-2.8倍，随着我国人口老龄化进程的加快，女性寿命明显高于男性的普遍规律，今后我国老年女性人口的数量将持续增长；加上我国独特生育模式的影响，预计未来我国乳腺癌发病率和死亡率快速上升的趋势仍将长期持续，严重威胁我国女性健康。随着不断攀升的发病率和死亡率，乳腺癌的早防早治已成为当今医学界所面临的重大难题。

目前我国尚无一套成熟的女性乳腺癌筛查方案，《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2013版)》的推荐方案仍参照ACS指南。但由于我国女性乳腺癌发病年龄高峰早于美国，我国建议乳房钼靶X线摄影术 (MAM)筛查起始年龄早于美国5年，且由于亚洲女性乳腺质地、体积和经济情况的差异，无放射性的乳腺超声成为我国乳腺癌的重要筛查方法。目前临床上的快速辅助诊断手段是钼靶X光片检测，微钙化点群是重要的早期影像学征兆。然而微钙化点非常微小，混杂于大量图像背景中，导致肉眼识别困难，对医生的经验要求很高。因而近年来人们逐渐重视钼钯影像的计算机辅助诊断技术。但由于高分辨率图像巨大，个体差异较大，因而尽管近年来的图像和人工智能算法不断发展，计算缓慢、准确率较低、易发生经验主义错误等问题仍然制约着基于影像学的乳腺癌早期诊断。因此，分子诊断就成为非常必要的检测手段。目前，乳腺癌的诊断及分子分型主要依靠有创的手段获取组织标本，如穿刺活检、手术切除病灶、术中冰冻会诊样本等，存在需要借助影像学辅助等不足，检测成本相对较高、存在风险且无法做到对病情的实施跟踪和监控。因此，寻找一种快速有效的乳腺癌检测分子诊断方法具有重要的临床意义。

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。在现有技术中，相关的研究还十分匮乏，亟待更多的研究揭示与乳腺癌相关的甲基化基因，并阐明所述甲基化位点与乳腺癌的关系。

本发明通过长期对众多乳腺癌患者的肿瘤组织以及肿瘤组织旁边的正常组织进行高通量甲基化测序分析，筛选出几个在病例组中呈高甲基化的候选基因及其甲基化位点。并通过多例试验进行验证，获得了本申请的技术。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供一种用于诊断评估乳腺癌的试剂盒、甲基化HOXA4/DPP6基因的检测及其应用，以解决现有技术中提到的不足。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：

一种用于诊断评估乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒是以甲基化的 HOXA4基因和/或甲基化的DPP6基因作为生物标记物的试剂盒。

进一步地，所述试剂盒包括针对所述生物标记物所设计的特异性的引物。

进一步地，所述试剂盒还包括TRIzol试剂、柠檬酸钠、CT转化剂、 M-结合缓冲液、M-洗涤液、M-脱磺化缓冲液、亚硫酸氢盐、Zymo Taq 预混液。

进一步地，所述柠檬酸钠为含10％乙醇的0.1M柠檬酸钠。

进一步地，所述试剂盒中的所述引物是包括扩增甲基化的HOXA4 基因和/或甲基化的的DPP6基因的5’UTR的CpG或外显子1区域的CpG 的引物以及扩增非甲基化的HOXA4基因和/或非甲基化的的DPP6基因的5’UTR的CpG或外显子1区域的CpG的引物。

进一步地，所述引物包括甲基化HOXA4基因的引物和/或甲基化 DPP6基因的引物；

所述甲基化HOXA4基因的引物包括甲基化HOXA4特异性上游引物和甲基化HOXA4特异性下游引物，该甲基化HOXA4特异性上游引物的序列为：5’-TTATATTGGAGGAGAGTTTAAACGG；该甲基化 HOXA4特异性下游引物的序列为： 5’-TCTAAAACCAAATCTTCACCTAACG；

所述甲基化DPP6基因的引物包括甲基化DPP6特异性上游引物和甲基化DPP6特异性下游引物，该甲基化DPP6特异性上游引物的序列为：5’-ATTTGGTTTTGAAAGGTAAGGTTAC；该甲基化DPP6特异性下游引物的序列为：5’-ATTTACTCGTCGATATCGACGTT。

进一步地，所述引物还包括非甲基化HOXA4基因的引物和/或非甲基化DPP6基因的引物；

所述非甲基化HOXA4基因的引物包括非甲基化HOXA4特异性上游引物和非甲基化HOXA4特异性下游引物，该非甲基化HOXA4特异性上游引物的序列为：5’-TTATATTGGAGGAGAGTTTAAATGG；该非甲基化HOXA4特异性下游引物的序列为： 5’-TAAAACCAAATCTTCACCTAACATT；

所述非甲基化DPP6基因的引物包括非甲基化DPP6特异性上游引物和非甲基化DPP6特异性下游引物，该非甲基化DPP6特异性上游引物的序列为：5’-TTTGGTTTTGAAAGGTAAGGTTATG；该非甲基化 DPP6特异性下游引物的序列为： 5’-CAATTTACTCATCAATATCAACATT。

进一步地，所述引物包括甲基化HOXA4基因的引物、甲基化DPP6 基因的引物、非甲基化HOXA4基因的引物和非甲基化DPP6基因的引物。

一种甲基化HOXA4/DPP6基因的检测，所述检测方法是以甲基化 HOXA4/DPP6基因为靶点，采用甲基化芯片技术方法对HOXA4/DPP6 基因甲基化程度进行检测。

一种甲基化HOXA4/DPP6基因的应用，所述甲基化HOXA4基因和/或甲基化DPP6基因在乳腺癌评估、诊断、检测或筛查药物中的应用。

本发明至少具有以下有益效果：

本申请中的甲基化HOXA4/DPP6基因在肿瘤组织中的表达量大大提高，根据目前本申请人对大量的案例研究显示，所有肿瘤患者的肿瘤组织HOXA4/DPP6基因的甲基化率均显著高于正常组织，且甲基化率均在55％以上，肿瘤旁边的正常组织的甲基化率极低，约90％以上患者的肿瘤旁边的正常组织的甲基化率为阴性，阳性率极低，且阳性患者中的甲基化率大多均在10％左右，该值远远低于肿瘤组织的甲基化率，故甲基化HOXA4/DPP6基因可有效应用于乳腺癌中，并应用于评估、诊断、检测或筛查药物中。而且本申请给出了用于评估、诊断或检测乳腺癌的试剂盒，该试剂盒以甲基化HOXA4/DPP6基因作为生物标记物，并专门开发了几条特异性的引物用于检测甲基化HOXA4/DPP6基因，其特异性好，准确率高，经过上百次的试验、对比等显示，该引物最终的精确率极高，能够达到99％以上；通过该试剂盒能够高效检测肿瘤组织和正常组织中的甲基化HOXA4/DPP6基因。总之，本申请提供了一种新的乳腺癌诊治靶点，具有重要的临床应用价值，在乳腺癌等癌症领域中具有极其重要的意义。

附图说明

通过以下参照附图对本发明实施例的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优点将更为清楚，在附图中：

图1为本发明实施例中所述的肿瘤组织和正常组织中HOXA4/ DPP6基因的甲基化程度的结构示意图；

图2为本发明实施例中所述的肿瘤组织和正常组织中HOXA4/ DPP6基因的表达量的结构示意图。

具体实施方式

以下基于实施例对本发明进行描述，但是本发明并不仅仅限于这些实施例。

实施例1

一种甲基化HOXA4/DPP6基因的应用，所述HOXA4基因和DPP6 基因的在DNA序列数据库中的登录号如表1所示；HOXA4/DPP6基因的甲基化是CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。经过本发明人的研究发现，在乳腺癌肿瘤中的甲基化HOXA4/DPP6基因大大提高，其中肿瘤组织中HOXA4基因甲基化率达到80.58％，DPP6基因甲基化46.9％，比正常组织中的甲基化HOXA4/DPP6基因明显提高。因此，甲基化HOXA4/DPP6基因能够应用于乳腺癌中的评估、诊断、检测或筛查药物中。

表1：HOXA4/DPP6基因的的登录号

基因符号Genbank登录号HOXA4NM_001039350DPP6NM_001039350

实施例2

一种用于诊断评估乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒是以甲基化的HOXA4基因和/或甲基化的DPP6基因作为生物标记物的试剂盒，优选同时将甲基化HOXA4/DPP6基因作为生物标记物。

试剂盒包括针对所述生物标记物所设计的特异性的引物，还包括 TRIzol试剂(购买厂家：Life Tech Inc,USA)、含10％乙醇的0.1M柠檬酸钠、CT转化剂(来自EZ DNAMethylation^TMKit(ZYMO>

上述引物是扩增包括甲基化的HOXA4/DPP6基因5’UTR的CpG或外显子1区域的CpG以检测CpG甲基化的片段，优选同时包括扩增非甲基化的HOXA4/DPP6基因的5’UTR的CpG或外显子1区域的CpG 的引物。

具体地，所述引物包括甲基化HOXA4基因的引物和甲基化DPP6 基因的引物。所述甲基化HOXA4基因的引物包括甲基化HOXA4特异性上游引物和甲基化HOXA4特异性下游引物，该甲基化HOXA4特异性上游引物的序列为：5’-TTATATTGGAGGAGAGTTTAAACGG；该甲基化HOXA4特异性下游引物的序列为： 5’-TCTAAAACCAAATCTTCACCTAACG。所述甲基化DPP6基因的引物包括甲基化DPP6特异性上游引物和甲基化DPP6特异性下游引物，该甲基化DPP6特异性上游引物的序列为： 5’-ATTTGGTTTTGAAAGGTAAGGTTAC；该甲基化DPP6特异性下游引物的序列为：5’-ATTTACTCGTCGATATCGACGTT。

所述引物还包括非甲基化HOXA4基因的引物和非甲基化DPP6基因的引物；所述非甲基化HOXA4基因的引物包括非甲基化HOXA4特异性上游引物和非甲基化HOXA4特异性下游引物，该非甲基化HOXA4 特异性上游引物的序列为：5’-TTATATTGGAGGAGAGTTTAAATGG；该非甲基化HOXA4特异性下游引物的序列为： 5’-TAAAACCAAATCTTCACCTAACATT。所述非甲基化DPP6基因的引物包括非甲基化DPP6特异性上游引物和非甲基化DPP6特异性下游引物，该非甲基化DPP6特异性上游引物的序列为：5’-TTTGGTTTTGAAAGGTAAGGTTATG；该非甲基化DPP6特异性下游引物的序列为：5’-CAATTTACTCATCAATATCAACATT。

实施例3

一种甲基化HOXA4/DPP6基因的检测，所述检测方法是以甲基化 HOXA4/DPP6基因为靶点，采用illumina甲基化芯片(货号： WG-314-1003)，并以实施例2所述的试剂盒对HOXA4/DPP6基因甲基化程度进行检测。具体的方法参见实施例4。

实施例4：样本的采集及测序

发明人于2015.05-2016.04时间在深圳市宝安区妇幼保健院收集了9 例乳腺癌患者以及其它地方零散采集的11例患者，分别取肿瘤组织以及肿瘤组织旁边的正常组织速存于液氮罐。样品采集后，通过对肿瘤组织以及肿瘤组织旁边的正常组织进行全基因组甲基化测序，并提供初步的分析结果。所有采集的案例的测序结果显示候选基因HOXA4/DPP6基因在患者肿瘤组织中甲基化程度明显高于正常组，其平均值的结果参见图1，该结果与本发明的结果一致。

实施例5：乳腺肿瘤组织以及对照肿瘤组织旁边的正常组织HOXA4/ DPP6基因表达情况

一、实验材料：

1、选取3例乳腺癌患者肿瘤组织以及肿瘤组织旁边的正常组织，病例组均符合乳腺癌诊断标准，分组编号；实验组为乳腺患者的肿瘤组织，对照组为肿瘤组织旁边的正常组织，取新鲜组织大小为5mm³，存放于>

2、核酸标记物初筛：对3例肿瘤组织和肿瘤组织旁边的正常组织进行转录组测序，对测序结果进一步生物信息学分析，结果表明HOXA4、 DPP6基因的表达量显著下调，结果参见图2所示，由图2中实验组和对照组的对比可知，对于HOXA4基因，正常组织中的表达量高于肿瘤组织10倍以上；对于DPP6基因，正常组织中的表达量高于肿瘤正常组织5倍以上。对该转录组结果进行实时荧光定量PCR进一步验证。

3、用Trizol试剂(购买厂家：Life Tech Inc,USA)分别提取实验组和对照组的组织里的RNA，并对其浓度和纯度测定。具体地：(1)每例样本0.5g组织加入1mL Trizol，剧烈震荡1min，室温保存10min；(2)加氯仿0.2ml，剧烈震荡1min，充分混匀，室温下放置3min-5min；(3)在4℃下，12000rpm高速离心15min后吸取上层水相的70％到另一新离心管中,注意不要吸到两层水相之间的蛋白物质。移入新管，加入等体积异丙醇，1-2ul糖原，充分颠倒混匀，于-20℃保存6小时以上，需要保持离心管竖直状态；(4)在4℃下，12000rpm高速离15min后小心弃掉上清液； (5)按与Trizol等体积比的量加入75％DEPC冷乙醇(DEPC，焦碳酸二乙酯))洗涤沉淀，充分混合均匀，静置10min；然后在4℃下，12000rpm 高速离心10min，弃掉上清液，重复一遍操作该步骤(5)的操作，的沉淀物；(6)室温下放置5min以充分晾干沉淀物，加入10ul DEPC水溶解沉淀；(7)用Nanodrop2000紫外分光光度计测定RNA纯度及浓度，冻存于 -80℃或直接进行下游实验。

4、逆转录成cDNA:按常规方法将上述mRNA逆转录获取cDNA,采用25ul反应体系，每个样品取1ug总RNA作为模板RNA。获得的cDNA 保存放-20℃冰箱备用。

5、实时定量荧光PCR(Real-time PCR)

设计HOXA4/DPP6基因引物，这两种mRNA的核酸引物序列表如表2所示。

表2 HOXA4基因和DPP6基因的mRNA引物序列

(1)按以下反应体系对HOXA4和DPP6分别进行荧光定量PCR：

(2)荧光定量PCR反应条件：

94℃：30s；94℃：5s，60℃：34s，读板40循环；溶解曲线分析：温度60℃-95℃。

(3)实验结果

实时荧光定量PCR扩增曲线拐点清楚，扩增曲线整体平行性好，表明各反应管的扩增效率相近，样本扩增产物溶解曲线都是单峰，说明扩增产物只有一条，为特异性扩增；根据实时荧光定量PCR的相对定量公式，HOXA4基因在乳腺癌组织中的表达水平为对照组的约0.07倍， DPP6基因在乳腺癌组织中的表达水平为对照组的约0.15倍，以上结果验证了高通量转录组表达数据的整合分析HOXA4和DPP6基因在乳腺癌患者组织中低表达的结果。

实施例6：检测HOXA4/DPP6基因甲基化程度

1、DNA抽提

选取3例乳腺癌患者肿瘤组织以及肿瘤组织旁边的正常组织，病例组均符合乳腺癌诊断标准，以乳腺患者的肿瘤组织为实验组，以肿瘤组织旁边的正常组织为对照组，取新鲜组织大小为5mm³，存放于-80℃液氮中保存。

将组织从液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙将组织放入预先加入 TRIzol试剂的匀浆器中，匀浆数分钟；将匀浆后的液体转入无RNA酶的离心管中，加入氯仿后，4℃离心分层；取中层固相于一新鲜离心管中，加入0.3ml无水乙醇(按照1ml Trizol计算)，充分混匀后室温静置3 分钟，4℃2000g离心沉淀DNA；收集上清，用含10％乙醇的0.1M柠檬酸钠洗涤DNA沉淀，室温静置30min，4℃下2000g离心沉淀DNA；收集上清重复洗涤、离心一次，最后收集沉淀；用75％乙醇洗涤DNA沉淀，按照1ml Trizol加入2ml的75％乙醇，室温静置10-20min，4℃2000g 离心沉淀DNA；自然风干后，用30-50ul双蒸水充分溶解沉淀，琼脂糖电泳检测DNA的完整性，-20℃冻存备用。

2、亚硫酸氢盐修饰

重亚硫酸氢盐能使DNA中未甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，从而反映出单个胞嘧啶的甲基化状态。采用EZ>TMKit(ZYMO>

取130ul CT转化剂加到20ul基因组DNA溶液中，记为混合液，然后将混合液98℃孵育10min，64℃孵育2.5h，4℃孵育20h；将此150ul 的混合液及600ul M-结合缓冲液(来自EZDNA Methylation^TMKit)加到>TMIC柱(来自EZ>TMKit)中，全速离心30s，弃去滤出液体，加入100ul M-洗涤液(来自EZ>TMKit)至过滤柱中洗柱；洗柱后往过滤柱中加入200ul M-脱磺化缓冲液(来自EZ>TMKit)，室温放置15min，全速离心后，用M-洗涤液洗柱两次；最后用10ul>TMKit)溶解吸附柱上的DNA，离心收集修饰后的DNA。

3、HOXA4/DPP6基因5’UTR的CpG或外显子1区域的CpG以检测CpG超甲基化的检测。

具体引物序列如表3所示：

表3 HOXA4/DPP6基因的特异性引物

(1)用MSP方法检测，反应总体积为20ul：以1ul亚硫酸氢盐处理后的DNA为模板，上述8个上下游特异性引物各1ul，2xZymo Taq premixed 10ul,去离子水7ul。反应参数如下：95℃预变性5min；40个循环设置如下，95℃变性30s；62℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

(2)实验结果

非甲基化特异性引物的扩增产物存在，甲基化特异性引物的扩增产物不存在即为非甲基化；非甲基化特异性引物的扩增产物不存在，甲基化特异性引物的扩增产物存在即为甲基化。电泳结果显示：9例乳腺癌组织中，甲基化阳性的有5例HOXA4/DPP6基因的甲基化率55.56％， 9例对照乳腺癌组织旁边的正常组织中甲基化阳性的仅为1例，基因甲基化率为11.11％。

在本发明中，DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。DNA甲基化水平和模式的改变是肿瘤发生的一个重要因素。这些变化包括CpG岛局部的高甲基化和基因组DNA低甲基化状态。在正常细胞中，位于抑癌基因启动子区域的CpG岛处于低水平或未甲基化状态，此时抑癌基因处于正常的开放状态，抑癌基因不断表达抑制肿瘤的发生。而在肿瘤细胞中，该区域的CpG岛被高度甲基化，染色质构象发生改变，抑癌基因的表达被关闭，从而导致细胞进入细胞周期，凋亡丧失，DNA修复缺陷，血管生成以及细胞粘附功能缺失等，最终导致肿瘤发生。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域技术人员而言，本发明可以有各种改动和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。