一种肤色相关的SNP标记在乌骨鸡基因分型中的应用

摘要

本发明提供一种肤色相关的SNP标记在乌骨鸡基因分型中的应用，所述SNP标记位于TYR基因启动子区的转录起始位点上游2228bp处，具有多态性碱基为腺嘌呤A或胸腺嘧啶T。该SNP基因型检测引物具有很强的特异性，检测条带单一，分型结果准确。结合提供的检测方法使得整个操作过程更加简便、高效、成本更低，实现快速准确的个体筛选，为乌骨鸡品种选育的开展及品种保护提供依据。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种肤色相关的SNP标记在乌骨鸡基因分型中的应用。

背景技术

鸡的皮肤颜色作为质量性状是一种非常重要的品种特征。由于不同的市场消费需求，鸡的皮肤颜色具有重要的经济用途。家禽的皮肤颜色主要分为白、黄、黑三种，其中黑色皮肤以乌骨鸡为代表。

乌骨鸡具有特效的滋补和药用价值，其最显著的特征是体内含有大量黑色素。乌骨鸡黑色素作为一种重要的活性物质，其具有清除自由基、抗氧化、延缓衰老和提高机体免疫力等功效。研究表明乌骨鸡黑色素能够富集Cu、Mn、Fe、Co和Ni等微量元素，上述元素可以直接参与机体的细胞免疫，而且参与三大物质代谢途径，同时抑制由诱变剂所导致的基因突变。徐幸莲等通过实验得出乌骨鸡黑色素可有效清除超氧阴离子自由基，具有超氧歧化酶的作用。同时证明乌骨鸡黑色素能延长果蝇的平均寿命，提高果蝇的性活力，显著降低果蝇的脂褐素含量（P<0.05），得出乌骨鸡黑色素具有延缓衰老的作用。综述所述，乌骨鸡体内黑素是其发挥药用滋补功效的物质基础，乌骨鸡体内黑素沉积量的增加可有效提高其药用价值。另外，在乌骨鸡长期的自繁过程中出现了部分个体肤色变浅的现象，而白色个体出售价格远低于黑色个体，严重影响了乌骨黑鸡的养殖收益。因此，开展乌骨鸡黑色性状的选育，提高乌骨鸡体内黑色素含量，对当前乌骨鸡养殖生产具有重要的意义。

酪氨酸酶（tyrosinae, TYR）是黑色素合成过程中重要的限速酶，它能催化酪氨酸氧化产生多巴和多巴醌。酪氨酸酶正常功能的缺失将导致黑色素合成通路阻断，使动物表现出白化性状表型。TYR基因位于鸡的1号染色体上，由5个外显子和4个内含子组成，相关研究表明TYR基因的遗传变异与鸡的羽色和肤色相关。Zhang等研究指出TYR基因两个遗传变异位点与鸡肌肉肉色具有显著相关性（zhang et>, 2010）。陆晓屏等研究了他留乌骨鸡TYR基因多态性，共检测到20个SNP位点，关联分析表明TYR的基因变异与羽色性状显著（陆晓屏等，2015）。Zhang等通过RNA-seq技术获得了649个与乌骨鸡肤色相关的基因，其中TYR基因在黑色和白色皮肤组织中差异表达，TYR为上调基因（zhang et al, 2015）。上述研究表明，TYR基因可以作为研究乌骨鸡肤色的候选基因。

SNP是继RFLP、微卫星标记之后的第三代分子标记，在动植物遗传学研究中非常广泛，遗传稳定性高。目前，SNP检测已广泛在动植物性状关联中应用，进行目标性状分子遗传标记开发。基因组SNP的研究为物种遗传分析、疾病诊断与治疗等领域提供了重要线索。传统的SNP检测方法包括单链构象多态性（SSCP）、直接测序法、TaqMan探针分型法、限制性片段长度多态性（RFLP）等。但这些方法存在一定缺点，其中SSCP操作复杂、耗时长，不适合大量样品检测。测序法和TaqMan探针基因分型法检测成本太高，而RFLP不适合大量样品检测。SNP位于基因编码区可能直接影响蛋白质的结构和功能，进而影响蛋白间互作，导致相应性状表型的变化。而启动子区的功能性遗传变异可能控制基因的mRNA表达的开启和关闭，筛选某一性状主效基因的启动子区SNP可以用于研究同一性状的不同差异表型，阐述造成个体间表型差异的遗传基础。因此，研究TYR基因启动子区的多态性，分析其与乌骨鸡肤色的相关性，筛选出能用于乌骨鸡肤色选育的分子标记，将极大加快乌骨鸡品种选育，提高乌骨鸡个体品质，增加养殖收益。

发明内容

本发明旨在提供不同于现有技术的与乌骨鸡肤色相关的突变位点，并将该位点应用于检测乌骨鸡肤色相关的SNP基因型，为乌骨鸡品种选育的开展及品种保护提供依据。

为解决上述技术问题，本发明通过以下技术方案实现：

一种肤色相关的SNP标记在乌骨鸡基因分型中的应用，所述SNP标记位于TYR基因启动子区的转录起始位点上游2228bp处，具有多态性碱基为腺嘌呤A或胸腺嘧啶T。

所述应用是基于SNP位点设计PCR扩增引物，采用所述扩增引物对待测样本DNA进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,并成像，最终根据扩增产物中目的条带的有无确定所述待测样本的SNP标记的基因型。根据试验结果分析表明TYR启动子区SNP（c.-2228A>T）与乌骨鸡肤色具有显著相关性，AA基因型乌骨鸡黑色个体数极显著高于TT型。该SNP可作为分子标记开展乌骨鸡个体选择及育种工作。

所述PCR扩增引物的反向扩增引物的设计方法如下：将SNP位点在反向引物的3＇端，将靠近SNP位点的第三碱基变为错配碱基C，其序列为

R1：5’-AACTCTAACAGAACCATCATTTCTT-3’

R2：5’-AACTCTAACAGAACCATCATTTCTA-3’

正向通用引物F：5-’CTGAAAGGAGGTTGTAGTGAGC-3’。

所述PCR扩增反应条件： 94℃预变性5min，循环扩增阶段：94℃ 30s变性，55℃30s退火，72℃ 30s延伸，循环30次，最后在72℃保温10min终末延伸。扩增反应结束后，PCR产物进行电泳检测，检测基因分型结果分别为AA、AT、TT。

所述琼脂糖凝胶电泳时，琼脂糖凝胶浓度为2.0%-2.5%，电压130V，电泳30分钟。

一种检测上述SNP标记的方法：选取相同个体的黑色皮肤乌骨鸡、白色皮肤乌骨鸡若干，提取基因组DNA，将等量每个个体DNA进行混池，设计引物P1、P2、P3进行PCR扩增，获得扩增片段，测序后通过DNA序列图谱分析在候选基因TYR启动子区进行SNP位点检测，其中所述引物序列如下：

P1：F：5-’GCTCAGGGGAGACCTTATTGC-3’

R：5-’GCTGGTTAACAGAGGAATCTCCT-3’

P2：F：5-’CATCAGTAGGTCAAAAAGGGTG-3’

R：5-’GAAATTACCCCTTGAAGGAGG-3’

P3：F：5-’CTGCAACAATGACAACTAAACTC-3’

R：5-’GACTCTGCTACTGTGAACCCTC-3’。

引物P1、P2、P3 PCR扩增反应程序为：在94℃预变性5min，循环扩增阶段：94℃ 30s变性，30s退火，72℃ 1min延伸，循环32次，最后在72℃保温10 min终末延伸，其中，其中P1引物的退火温度为60℃，其中P2引物的退火温度为56℃，其中P3引物的退火温度为58℃。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的SNP基因型检测引物具有很强的特异性，检测条带单一，分型结果准确。结合提供的检测方法使得整个操作过程更加简便、高效、成本更低, 根据现有试验操作程序，每个人一天可完成200-300个样品的检测。本发明提供的SNP标记可用于乌骨鸡肤色的分子标记辅助育种，实现快速准确的个体筛选，为乌骨鸡品种选育的开展及品种保护提供依据。

说明书附图

图1为本发明SNP位点检测PCR产物测序图；

图2为本发明SNP基因型分型电泳结果图；

图3为采用测序法进行基因分型得到的基因型为AA的结果图；

图4为采用测序法进行基因分型得到的基因型为AT的结果图；

图5为采用测序法进行基因分型得到的基因型为TT的结果图；

图6为引物P1、P2和P3扩增产物电泳图。

具体实施方式

材料与方法

实验动物与样品采集：

本实验共选择188只成年健康沐川乌骨黑鸡，实验对象均处于沐川县黑凤凰乌骨鸡业有限公司统一的饲养管理条件下。血液采集：采用一次性血液采集针通过翅静脉采集血液于含有枸橼酸钠抗凝剂的真空采血管中，并充分混匀。同时记录乌骨鸡个体肤色（黑色、浅黑、白色）。

仪器设备：

低温高速离心机、超微量分光光度计、可调式微量移液器、凝胶成像系统、电子天平、高压消毒锅、恒温水浴锅、电泳仪、梯度PCR仪。

基因组DNA提取

1、取20ul抗凝全血放入一支1.5ml离心管中，加入500ul DNA提取液（0.1M Tris-Hcl、0.5M Nacl、0.05M EDTA-2Na、2% SDS、0.1%β-巯基乙醇、0.5%聚乙烯吡咯烷酮），充分混匀，65℃水浴30min，期间震荡涡旋数次。

2、以12000r/min离心10min，小心取出将上清转移至新的1.5ml离心管，在上清中加入1/10体积的3M NaAC（pH=5.2），4℃静置20min，再加入300ul氯仿-异戊醇（24:1），剧烈震荡，4℃静置20min，12000r/min离心10min。

3、转移上清至新的1.5ml离心管，加入等体积的异丙醇（-20℃预冷），轻轻颠倒混匀，室温放置30min，12000r/min离心5min，弃上清。

4、加入500ul 75%酒精洗涤沉淀，12000r/min离心5min，弃上清。

5、重复第4步，将离心管中多余的75%酒精吸出，待风干后加入100-200ul ddH2O溶解稀释，进浓度和纯度测定，A260/280和A260/230比值分别介于1.87~1.95，2.3~2.5，-20℃保存。

TYR基因启动子区SNP的筛查

选取乌骨鸡黑色和白色皮肤个体各8个，将每个个体等量DNA进行混池。通过设计引物P1、P2和P3完成候选基因TYR启动子区DNA序列的PCR扩增，扩增电泳图如图6所示，扩增产物进行测序技术分析，通过测序图普分析完成TYR基因启动子区SNP筛查。

引物设计依据Genbank数据库鸡TYR基因序列Chromosome 1， NC_006088.4（187920666..187970514）。引物由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成，引物信息见表1。

表1 引物信息表

采用sanger测序进行PCR产物测序，测序结果如图1所示，在启动子区起始密码子上游2228bp处鉴定了一个突变位点（SNP）。

SNP基因型分型引物设计：

基因分型特异引物设计采样Primer Premier 5软件(PREMIER Biosoft, USA)。将SNP位点置于反向引物的3＇端，将靠近SNP位点的第三碱基变为错配碱基C，并设计正向通用引物F，引物序列如下：

正向通用引物F：5-’CTGAAAGGAGGTTGTAGTGAGC-3’

R1：5’- AACTCTAACAGAACCATCATTTCTT-3’

R2：5’-AACTCTAACAGAACCATCATTTCTA-3’

扩增片段长度：349bp，最佳TM值55℃。

个体样本PCR扩增和电泳

每个样本需设计两组PCR反应体系（25ul），A组引物为将正向通用引物F和反向引物R1，B组为正向通用引物F和反向引物R2，其PCR反应体系按下表2配制：

表2： PCR反应体系（25ul）

PCR反应条件：将上述混合液涡旋混匀并离心，立即置于PCR仪，进行扩增。在94℃预变性5min，循环扩增阶段：94℃ 30s变性，55℃ 30s退火，72℃ 30s延伸，循环30次，最后在72℃保温10min终末延伸。扩增反应结束后，PCR产物放置于4℃待电泳检测。用1×TBE电泳缓冲液配置2.0%的琼脂糖凝胶，电压130V，电泳30分钟，凝胶成像系统检测基因分型。

本发明以8个样本电泳图为例，如图2所示，若A组有目标条带，B组无条带，则其SNP基因型为AA，若A组无目标条带，B组有目标条带，则其SNP基因型为TT，若A B组均有条带，则其SNP基因型为AT。

同时本发明将按照本发明方法的分型结果和通过测序结果对比，随机选取了电泳图上编号为1（AT型）、4（TT）型、7（AA型）样本各一个采用Sanger测序法测序，测序如图3、图4、图5所示，结果与本发明方法分型结果一致。

SNP c.-2228A>T与沐川乌骨黑鸡肤色性状相关性

本发明利用SNP c.-2228A>T特异基因分型引物，完成了188只乌骨鸡个体基因型分析，结合个体肤色性状记录结果，运用SPSS统计软件将基因分型结果与乌骨鸡肤色性状进行卡方独立性检验，统计结果如表3所示， SNP c.-2228A>T与沐川乌骨黑鸡肤色具有显著的相关性。乌骨鸡黑色皮肤个体中A占优势，白色个体T占优势。

表3 SNP c.-2228A>T与肤色组合频数及卡方检验

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