康肤酊标准特征图谱的构建及其质量检测方法

摘要

本发明涉及中成药的质量控制技术，具体涉及一种康肤酊的标准特征图谱的构建及其质量检测方法，其步骤如下：按照标样溶液和参照物溶液的方法制备并测定得到待测康肤酊的色谱图和对照品芦丁的色谱图，将待测康肤酊的色谱图与构建的标准特征图谱比对，若待测康肤酊的色谱图中出现标准特征图谱中相同的20个特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，各特征峰的相对保留时间与标准特征图谱中各特征峰的相对保留时间的相对标准偏低在±5％以内，则该康肤酊的质量合格，反之则不合格，如此可以实现快速检测判断康肤酊的质量。

说明书

技术领域

本发明涉及中成药的质量控制技术领域，具体涉及一种康肤酊的标准特征图谱的构建及其质量检测方法。

背景技术

康肤酊是一种上市多年的中成药，现行执行标准为国家药品标准WS3-B-2785-97-2016。康肤酊是由百部、辣蓼和薄荷脑三味原料组成，具有润肤止痒，杀虫除臭之功效，可用于皮肤瘙痒、湿疹、神经性皮炎等皮肤瘙痒症。

康肤酊作为中成药，其药效是由黄酮类、生物碱和酚酸类等多种活性成分共同作用的结果。现有技术中涉及康肤酊的质量控制方法的研究如下：(1)中国发明专利申请公开号CN102279240A公开了一种辣蓼药材的HPLC特征指纹图谱研究技术，并具体公开了辣蓼药材在两种检测波长下HPLC特征图谱的检测方法，共有峰15个，主要为黄酮类与酚酸类成分。(2)题目为“百部配方颗粒的高效液相色谱指纹图谱研究”的文章中建立了百部配方颗粒的指纹图谱检测方法，共有峰19个。(3)题目为“黔产辣蓼及其混淆品高效液相指纹图谱研究”的文章中建立了辣蓼药材黄酮苷元的指纹图谱检测方法，共有峰12个。(4)题目为“直立百部质量标准研究”的文章中建立了百部药材生物碱含量的检测方法。由上可知，目前有关康肤酊质量控制方法的研究仅仅涉及单味原料药材成分的检测，虽然康肤酊的制备原料是百部、辣蓼和薄荷脑，但康肤酊的获得却是上述三种原料药材的活性成分之间共同作用的结果，因此康肤酊的成分以及含量与其原料的成分以及含量之间存在较大差异，使用检测单味原料药材成分的方法难以全面、准确反映康肤酊的质量状况。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种操作方便、重现性好、精密度高的康肤酊的标准特征图谱的构建方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种康肤酊标准特征图谱的构建方法，步骤如下：

a)标样溶液、参照物溶液的准备：将至少15批次合格的康肤酊分别水浴蒸干，残渣加50％甲醇使溶解，滤过得到各标样溶液，将芦丁对照品加甲醇制成参照物溶液；

b)高效液相色谱分析：精密吸取等量的各标样溶液、参照物溶液，分别注入液相色谱仪进行测定，即得各标样溶液和参照物溶液的色谱图；

c)标准特征图谱的构建：将得到的各标样溶液的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，制定得到康肤酊的标准特征图谱，该标准特征图谱中有20个特征峰，按出现的时间顺序将所述的20个特征峰依次编号1～19、S，以参照物溶液的色谱峰的相对保留时间为1，计算得知1～19号特征峰的平均相对保留时间分别为0.121、0.141、0.188、0.241、0.284、0.302、0.333、0.396、0.428、0.448、0.466、0.495、0.558、0.568、0.583、0.613、0.667、0.790、0.868；所述的S号色谱峰是芦丁的特征峰，其平均相对保留时间为1。

本发明公开的康肤酊的标准特征图谱的构建方法是申请人经多年的试验研究获得，不仅能反映康肤酊的内在质量，而且操作简便快捷。采用本发明公开的上述方法构建的标准特征图谱中的20个特征峰的分离度高，从而为后续康肤酊产品的质量检测有效地提供了数据基础，进而为康肤酊今后的标准化生产提供一种可行的质量控制模式。具体说来，本发明是将合格的各康肤酊制得的标样溶液与对芦丁照品制得的参照物溶液在规定的实验条件下测定分析得到色谱图，这样将芦丁对照品的色谱图与合格的各康肤酊的色谱图进行比对，从而可以确定两者之间的共有特征峰，亦即找出各康肤酊测得的色谱图上的芦丁的特征峰，从而以芦丁特征峰的相对保留时间为1，计算出各康肤酊的色谱图上其他特征峰的相对保留时间，进而为后续的待测康肤酊产品的质量检测提供数据基础。

需要说明的是，所述的合格的康肤酊也可以理解为是标准康肤酊，其是质量完全符合国家相关标准的康肤酊。

本发明的另一个目的是基于以上方法构建的康肤酊的标准特征图谱，提供一种康肤酊的质量检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种康肤酊的质量检测方法，步骤如下：按照标样溶液和参照物溶液的方法制备并测定得到待测康肤酊的色谱图和芦丁对照品的色谱图，将待测康肤酊的色谱图与构建的标准特征图谱比对，若待测康肤酊的色谱图中出现标准特征图谱中相同的20个特征峰，与参照物峰相应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，各特征峰的相对保留时间与标准特征图谱中各特征峰的相对保留时间的相对标准偏低在±5％以内，则该康肤酊的质量合格，反之则不合格，如此可以实现快速检测判断康肤酊的质量。

附图说明

图1-10为实施例1测得的色谱图；

图11实施例2测得的芦丁的色谱图；

图12为实施例2测得的标准康肤酊的色谱图；

图13为实施例2测得的15批标准康肤酊的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统中进行分析导出的截图；

图14为实施例2制定得到的康肤酊的标准特征图谱；

图15为实施例3测得的康肤酊的特征图谱；

图16为实施例4测得的康肤酊的特征图谱。

具体实施方式

以下结合实施例1-4对本发明公开的技术方案作进一步的说明：

实施例1：不同条件下康肤酊供试液的HPLC测定

1、仪器与药品

仪器：Waters高效液相色谱仪，2489检测器。

试药：磷酸、醋酸(分析纯)；甲醇(色谱级，SIGAMA)；康肤酊(安科余良卿药业有限公司，批号为20161001)；芦丁对照品(纯度99.9％)，批号为100080-200306。

2、方法与结果

2.1供试液制备

(1)取康肤酊10ml，水浴上挥去乙醇，加氨水4ml，加乙醚振摇提取3次，每次30ml，合并乙醚液，蒸干，残渣加甲醇稀释并定容至25ml，滤过，取续滤液作为供试品溶液A。

(2)取康肤酊10ml，水浴蒸干，残渣加50％甲醇使溶解并转移至25ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，滤过(0.45μm膜)，取续滤液作为供试品溶液B。

(3)取康肤酊10ml，水浴蒸干，残渣加甲醇-25％盐酸(4:1)混合溶液溶解并转移至25ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，使用孔径为0.45μm的膜过滤，取续滤液作为供试品溶液C。

2.2检测方法

(1)依据“直立百部质量标准研究”中含量测定的色谱条件：采用C18柱(尺寸250mm×4.6mm，粒径5μm)；以乙腈-0.1％三乙胺(34：66)为流动相；检测波长为306nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；供试品溶液A进样量为10μl。色谱结果如图1所示，在波长为306nm时，色谱峰较少，说明采用该检测方法完全不能反映样品的特征信息。

(2)依据“百部配方颗粒的高效液相色谱指纹图谱研究”中的色谱条件：以乙腈为流动相A，0.1％磷酸的水溶液为流动相B，按表1程序进行梯度洗脱。检测波长为270nm；柱温为25℃；流速为0.8ml/min；供试品溶液B进样量为10μl。色谱结果如图2所示，在波长为270nm时，色谱峰较少，说明采用该检测方法完全不能反映样品的特征信息。

表1 流动相梯度洗脱条件

时间(分钟)流动相A(％)流动相B(％)0～73→597→957～275→2095→8027～3720→2680→74

(3)依据“黔产辣蓼及其混淆品高效液相指纹图谱研究”中的色谱条件：以乙腈为流动相A，0.2％磷酸水溶液为流动相B，按表2程序进行梯度洗脱。检测波长为260nm；柱温为25℃；流速为1.0ml/min；供试品溶液C进样量为10μl。色谱结果如图3所示，在波长为260nm时，色谱峰数目较多，丰度高，但分离度很低。此外，由于该法检测的是水解后的黄酮苷元，并非是水解前的黄酮苷，因此该法无法真实反映样品中活性成分的组成。

表2 流动相梯度洗脱条件

时间(分钟)流动相A(％)流动相B(％)0～155→1595→8515～2515→2085→8025～4020→3080→7040～5030→570→95

(4)依据专利“辣蓼药材的HPLC特征指纹图谱研究技术”中的色谱条件，以乙腈为流动相A，0.4％磷酸缓冲盐水溶液为流动相B，按表3程序进行梯度洗脱。柱温为30℃；流速为0.9ml/min；供试品溶液B进样量为10μl；检测波长为0-25min和55-88min范围内，设为273nm，色谱结果如图4所示，检测波长为25-55min范围内，设为360nm；色谱结果如图5所示。在波长为273nm和360nm时，色谱峰较少，说明采用该检测方法完全不能反映样品的特征信息。

表3 流动相梯度洗脱条件

从上述实验(1)-(4)可以看出，按照以上现有文献或者专利检测方法测定所得的康肤酊供试液的HPLC色谱峰要么极少，要么分离度低，完全不能准确地反映康肤酊内在质量的特征信息。

需要说明的是，附图1-5主要是说明了采用现有的条件测定得到的图谱存在缺陷，这些图并不对本发明需要保护的技术内容产生影响，故此处不再对附图的具体数据做出说明。

(5)供试品溶液的制备方法 考虑到成品里有效成分的原型分布情况，采用供试品溶液B，以乙腈为流动相A，0.2％磷酸水溶液为流动相B，按表4程序进行梯度洗脱。柱温为30℃；流速为1.0ml/min；供试品溶液B进样量为10μl；检测波长为260nm；色谱结果如图6所示。在波长为260nm时，色谱峰数目为15个，虽然丰度高，但分离度较低。

表4 流动相梯度洗脱条件

时间(分钟)流动相A(％)流动相B(％)0～155→1595→8515～2515→2085→8025～4020→3080→7040～5030→570→95

(6)调整流动相比例 采用供试品溶液B，以乙腈为流动相A，0.2％磷酸水溶液为流动相B，按表5、6程序进行梯度洗脱。柱温为30℃；流速为1.0ml/min；供试品溶液B进样量为10μl；检测波长为260nm；色谱结果如图7-8所示。在波长为260nm时，色谱峰数目较多，但均未达到基线分离。

表5 流动相梯度洗脱条件

表6 流动相梯度洗脱条件

时间(分钟)流动相A(％)流动相B(％)0～45→898→924～158→2092→8015～2520→3080→7025～3030→570→95

(7)改变流动相 采用供试品溶液B，以甲醇为流动相A，1％醋酸水溶液为流动相B，按表7程序进行梯度洗脱。柱温为30℃；流速为1.0ml/min；供试品溶液B进样量为10μl；检测波长为260nm；色谱结果如图9所示，在波长为260nm时，色谱峰数目14个，虽然丰度较高，但分离度较低，尚需进一步调整流动相比例。

表7 流动相梯度洗脱条件

时间(分钟)流动相A(％)流动相B(％)0～45→895→924～158→2092→8015～2520→3080→7025～3030→570→95

需要说明的是，附图6-9主要是说明了采用与本发明相关的条件测定得到的图谱存在缺陷，这些图并不对本发明需要保护的技术内容产生影响，故此处不再对附图的具体数据做出说明。

(8)依据本发明公开的色谱条件：采用供试品溶液B，以甲醇为流动相A，1％醋酸水溶液为流动相B；按表8程序进行梯度洗脱。柱温为30℃；流速为1.0ml/min；供试品溶液B进样量为10μl；检测波长为260nm；色谱结果如图10所示。在波长为260nm时，色谱峰数目20个，丰度高，分离度高，且在1小时后色谱峰无明显变化，说明采用该色谱条件能够很好的反映样品的特征信息。

表8 流动相梯度洗脱条件

时间(分钟)流动相A(％)流动相B(％)0～36→794→933～67→993→916～129→1291→8812～2212→2588→7522～3025→2875→7230～4528→3572→6545～5535→4065→6055～6040→660→94

实施例2：康肤酊的标准特征图谱的构建

1、仪器与药品

仪器：Waters高效液相色谱仪，2489检测器。

试药：醋酸(分析纯)；甲醇(色谱级，SIGAMA)；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的15批标准康肤酊，批号分别为20170805、20170605、20170601、20170401、20170303、20170302、20161001、20160901、20160801、20160702、20160701、20160603、20160602、20160601、20160401，上述15批标准康肤酊依次编号为S1～S15；芦丁对照品(纯度99.9％)，批号为100080-200306。

2、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径5μm)；以甲醇为流动相A，以1％醋酸为流动相B，流动相按体积比为6～40：94～60的A相和B相梯度洗脱，梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～3min，A相6％→7％，B相94％→93％；3～6min，A相7％→9％，B相93％→91％；6～12min，A相9％→12％，B相91％→88％；12～22min，A相12％→25％，B相88％→75％；22～30min，A相25％→28％，B相75％→72％；30～45min，A相28％→35％，B相72％→65％；45～55min，A相35％→40％，B相65％→60％；55～60min，A相40％→6％，B相60％→94％。流速1.0ml/min；检测波长260nm；柱温30℃；进样液的进样量为10μl；按照芦丁峰计算，理论塔板数≥10000。

3、标准特征图谱的特征峰的测定

3.1标准特征图谱的构建

(1)标样溶液的制备：取15批上述合格的康肤酊各10ml，分别水浴蒸干，残渣加50％甲醇使溶解并转移至25ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，滤过(0.45μm膜)，取续滤液即为标样溶液。

(2)参照物溶液的制备：取芦丁对照品，加甲醇制成每1ml含8.86μg芦丁的溶液，滤过，取续滤液即为参照物溶液。

(3)高效液相色谱分析：精密吸取参照物溶液和标样溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中进行测定，记录60分钟的图谱，即得芦丁对照品的色谱图(见图11)和标准康肤酊的色谱图(见图12，为批号为20161001的康肤酊的色谱图)。

(4)标准特征图谱的构建

将检测得到的15批标准康肤酊的色谱图导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，相应操作后得到如图13所示的标准康肤酊的特征图谱，图13中的R号图谱为系统生成的对照图谱，导出即得如图14所示的标准康肤酊的标准特征图谱。

3.2标准特征图谱中特征峰的确定

经比较15批标准康肤酊色谱图和芦丁的色谱图，确定康肤酊的色谱图中有20个特征峰，按出现的时间顺序将这20个特征峰依次编号1～19、S，其中S号色谱峰为芦丁的特征峰，设定S号峰的相对保留时间为1，计算其他19个峰的相对保留时间，结果如表8所示。经计算，1～19号峰的平均相对保留时间分别为：0.121、0.141、0.188、0.241、0.284、0.302、0.333、0.396、0.428、0.448、0.466、0.495、0.558、0.568、0.583、0.613、0.667、0.790、0.868，相对标准低均不超过0.36％。

表8 15批标准康肤酊的色谱图中各特征峰的相对保留时间

3.3标准特征图谱的精密度试验

取康肤酊(批号为20161001)，按照3.1中步骤(1)公开的方法制备成标样溶液，连续进样6次，得到6个色谱图，均出现20个特征峰，设定芦丁的特征峰的相对保留时间为1，计算6个色谱图中其它19个特征峰的相对保留时间。经计算，6个色谱图中19个特征峰的相对保留时间的相对标准偏低RSD≤0.13％。

3.4标准特征图谱的重复性试验

取康肤酊(批号为20161001)6份，按照3.1中步骤(1)公开的方法分别制备成标样溶液，分别检测得到6个色谱图，均出现20个特征峰，设定芦丁的特征峰的相对保留时间为1，计算6个色谱图中19个特征峰的相对保留时间。经计算，6个色谱图中19个特征峰的相对保留时间的相对标准偏低RSD≤0.27％。

3.5标准特征图谱的稳定性试验

取康肤酊(批号为20161001)，按照3.1中步骤(1)公开的方法制备成标样溶液，精密吸取6份标样溶液，每份10μl，按上述色谱条件分别在0h、1h、2h、4h、8h和12h进样，检测得到6个色谱图，均出现20个特征峰，设定芦丁的特征峰的相对保留时间为1，计算6个色谱图中19个特征峰的相对保留时间。经计算，6个色谱图中19个特征峰的相对保留时间的相对标准偏低RSD≤0.36％。

以上试验结果表明，采用本发明公开的方法构建得到的康肤酊的标准特征图谱精密度高，重复性好，结果准确可靠，其能全面地反映康肤酊的化学信息，进而确保该产品的质量与疗效。

实施例3：康肤酊的质量检测

1、仪器与试药

仪器：Waters高效液相色谱仪，2489检测器。

药品：磷酸(分析纯)；甲醇(色谱级，SIGAMA)；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的康肤酊，批号为20170605；芦丁对照品(纯度99.9％)，批号为100080-200306。

2、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm,粒径5μm)；以甲醇为流动相A，以1％醋酸为流动相B，流动相按体积比为6～40：94～60的A相和B相梯度洗脱，梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～3min，A相6％→7％，B相94％→93％；3～6min，A相7％→9％，B相93％→91％；6～12min，A相9％→12％，B相91％→88％；12～22min，A相12％→25％，B相88％→75％；22～30min，A相25％→28％，B相75％→72％；30～45min，A相28％→35％，B相72％→65％；45～55min，A相35％→40％，B相65％→60％；55～60min，A相40％→6％，B相60％→94％。流速1.0ml/min；检测波长260nm；柱温30℃；进样液的进样量为10μl；按照芦丁峰计算，理论塔板数≥10000。

3、特征图谱中的特征峰的测定

(1)待测溶液的制备：取待测康肤酊10ml，分别水浴蒸干，残渣加50％甲醇使溶解并转移至25ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，滤过(0.45μm膜)，取续滤液即得待测溶液。

(2)参照物溶液的制备：取芦丁对照品，加甲醇制成每1ml含8.86μg芦丁的溶液，滤过，取续滤液即为参照物溶液。

(3)高效液相色谱分析：精密吸取参照物溶液和待测溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中进行测定，记录60分钟的图谱，即得芦丁对照品的色谱图和待测康肤酊的色谱图15。待测康肤酊的色谱图中共有20个特征峰，以芦丁的特征峰的相对保留时间为1，其1-19号峰的相对保留时间分别为：0.121、0.141、0.188、0.241、0.284、0.302、0.333、0.396、0.428、0.448、0.466、0.495、0.557、0.568、0.582、0.613、0.667、0.790、0.868。经计算，待测康肤酊的色谱图中的1-19号峰的相对保留时间与标准特征图谱中相应特征峰的相对保留时间的相对标准偏低在±5％以内，即在规定范围内，说明该康肤酊(批号为20170605)的质量合格。

实施例4：康肤酊的质量检测

1、仪器与试药

仪器：Waters高效液相色谱仪，2489检测器。

药品：磷酸(分析纯)；甲醇(色谱级，SIGAMA)；由安徽安科余良卿药业有限公司提供的康肤酊，批号分别为20160601；芦丁对照品(纯度99.9％)，批号为100080-200306。

2、色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径5μm)；以甲醇为流动相A，以1％醋酸为流动相B，流动相按体积比为6～40：94～60的A相和B相梯度洗脱，梯度洗脱的时间及流动相比例为：0～3min，A相6％→7％，B相94％→93％；3～6min，A相7％→9％，B相93％→91％；6～12min，A相9％→12％，B相91％→88％；12～22min，A相12％→25％，B相88％→75％；22～30min，A相25％→28％，B相75％→72％；30～45min，A相28％→35％，B相72％→65％；45～55min，A相35％→40％，B相65％→60％；55～60min，A相40％→6％，B相60％→94％。流速1.0ml/min；检测波长260nm；柱温30℃；进样液的进样量为10μl；按照芦丁峰计算，理论塔板数≥10000。

3、特征图谱中的特征峰的测定

(1)待测溶液的制备：取待测康肤酊10ml，分别水浴蒸干，残渣加50％甲醇使溶解并转移至25ml量瓶中，稀释至刻度，摇匀，滤过(0.45μm膜)，取续滤液即得待测溶液。

(2)参照物溶液的制备：取芦丁对照品，加甲醇制成每1ml含8.86μg芦丁的溶液，滤过，取续滤液即为参照物溶液。

(3)高效液相色谱分析：精密吸取参照物溶液和待测溶液各10μl，分别注入液相色谱仪中进行测定，记录60分钟的图谱，即得芦丁对照品的色谱图和待测麝香镇痛膏的色谱图16。待测康肤酊的色谱图中共有20个特征峰，以芦丁的特征峰的相对保留时间为1，其1-19号峰的相对保留时间分别为：0.121、0.141、0.188、0.241、0.284、0.301、0.333、0.396、0.427、0.448、0.466、0.495、0.558、0.568、0.583、0.613、0.667、0.790、0.868。经计算，待测康肤酊的色谱图中的1-19号峰的相对保留时间与标准特征图谱中相应特征峰的相对保留时间的相对标准偏低在±5％以内，即在规定范围内，说明该康肤酊(批号为20160601)的质量合格。