用于细胞分选和流式细胞计数法的系统、设备和方法

摘要

一种系统，包括分选室和与分选室流体连通的流体通道。蠕动泵与流体通道流体连通以将流体以流体流动速率泵送通过流体通道至分选室。流体减震器与样品流体通道流体连通。流体减震器包括气体并且通过以下方式减小流体流动速率的变化：响应于流体通道中的流体流动而压缩或膨胀气体。

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年6月23日提交的题为“METHODS AND APPARATUS FOR CELLSORTING AND FLOW CYTOMETRY”的美国临时申请序列号62/183,640的优先权，其整个公开内容完全并入本申请以作参考。

政府支持

本发明以美国国立卫生研究院授予的批准号R44GM112442得到政府支持。政府享有本发明的某些权益。

背景技术

荧光激活细胞分选(FACS)和流式细胞计数仪器通常利用泵来使悬浮在溶液中的生物样品或颗粒流动通过仪器。第二股鞘液(通常为磷酸盐缓冲液)流通常用于将样品流水力聚焦。由于细胞分选可能对时机敏感，且细胞通过时间取决于流动速率，因此期望这些流体系统的流动速率稳定以获得令人满意的分选性能。

传统FACS仪器依赖于昂贵和复杂的高压驱动泵系统以迫使样品流体和鞘液通过试管或喷嘴。这些压力驱动泵通常非常敏感、庞大、昂贵，且不提供计算分析的细胞的浓度的能力。在FACS系统中使用传统压力驱动泵的另一问题是，流体组分会过于昂贵，因此无法对每次实验都进行替换，且需要大量的清洁。这造成污染风险和/或在试验之间清洁和冲洗仪器而浪费时间。

类似的问题使得难以在FACS仪器中使用其它泵系统。例如，具有流动速率反馈的复杂的压力驱动泵系统无法用于实例FACS系统，因为样品将会接触和污染流动速率传感器，这样的传感器通常是昂贵且不是一次性的。注射泵可能是一种备选，因为注射泵中的所有组分都可容易处理掉。但是，使用注射泵的问题是用法通常复杂且要求用户进行大量操作，因为用户可能需要将Luer接头固定到注射器上，将注射器固定到泵上，调整泵柱塞，和/或类似操作。

发明内容

在一些实施方式中，系统包括分选室和与分选室流体连通的流体通道。系统也包括与流体通道流体连通的蠕动泵。蠕动泵配置为将流体以流体流动速率泵送通过流体通道到达分选室。流体减震器与样品流体通道流体连通。流体减震器包括气体并且配置为通过以下方式减小流体流动速率的变化：响应于流体通道中的流体流动而将气体压缩或膨胀。

在一些实施方式中，用于细胞分选系统的一次性料筒盒包括基板。一次性料筒盒也包括在基板上建造的分选室。流体通道在基板上建造并且与分选室流体连通以将流体从流体入口运送到分选室。一次性料筒盒进一步包括在基板上建造的并且与流体通道流体连通的流体泡沫减震器以减小流体经流体通道从流体入口到分选室过程中流动速率的变化。

在一些实施方式中，公开了填装(priming)微流控芯片的方法。微流控芯片包括经微流体通道与分选室流体连通的入口。所述方法包括：将脱气液体经入口和微流体通道引入到分选室。脱气液体吸收残存在分选室中的气体。

应该知晓，认为前述概念和以下更详细讨论的另外的概念的所有组合(条件是这样的概念不会互相矛盾)都作为本申请公开的本发明主题内容的一部分。特别是，认为本申请请求保护的主题内容的所有组合都作为本申请公开的本发明主题内容的一部分。也应该知晓，本申请明确使用的术语也可能出现在作为参考并入的任何公开物中，它们应该符合与本申请公开的特定概念最一致的意思。

附图说明

本领域技术人员将会理解，附图主要针对说明的目的，不意在限制本申请所述的本发明主题内容的范围。附图并不一定缩放；在一些情况中，本申请公开的本发明主题内容的各个方面可以在附图中放大或扩大，从而有助于理解不同的特征。在附图中，同样的附图标记通常指代同样的特征(例如，功能类似和/或结构类似的要素)。

图1说明使用蠕动泵以泵送样品流体和鞘液的细胞分选系统的示意图。

图2说明根据实施方式的包括减震器的细胞分选系统的示意图。

图3A说明根据实施方式的可以用于图2中所示细胞分选系统的空气减震器的示意图。

图3B说明根据实施方式的使用图3A中所示空气减震器的系统的流动速率。

图4A说明根据实施方式的细胞分选系统的连接于流体通道的外部气体减震器的示意图。

图4B说明根据实施方式的使用外部空气减震器的实例系统。

图5说明根据实施方式的蠕动泵的一体式气体减震器，所述蠕动泵将样品流体和鞘液泵送到微流体细胞分选系统。

图6A说明根据实施方式的包括用于蠕动泵的气体减震器的细胞分选料筒盒。

图6B说明根据实施方式的包括用于蠕动泵的气体减震器的细胞分选料筒盒。

图7说明根据实施方式的带有用于样品流体通道和鞘液通道两者的料筒盒上泡沫减震器的细胞分选料筒盒。

图8A说明根据实施方式的可以使用蠕动泵和气体减震器的细胞分选器和闭合回路微流体细胞分选器芯片。

图8B说明根据实施方式的可以使用蠕动泵和气体减震器的包括检测芯片和分选细品的系统。

图9是显示根据实施方式的在使用和不使用气体减震器情况下流动速率相对于时间的关系图。

图10A和10B是根据实施方式的分别对于样品流体和鞘液使用外部气体减震器的情况下流动速率相对于时间的关系图。

图11A–11B是根据实施方式的对于鞘液使用和不使用料筒盒上减震器的情况下流动速率相对于时间的关系图。

图12A–12B是根据实施方式的对于样品流体使用和不使用料筒盒上减震器的情况下流动速率相对于时间的关系图。

图13A说明根据实施方式的微流体细胞检测器和分选器。

图13B是说明根据实施方式的使用带有料筒盒上泡沫减震器的蠕动泵进行分选的图。

图14说明根据实施方式的实例细胞分选器芯片。

图15A-15B说明根据实施方式的用常规缓冲器填装图14的细胞分选器芯片。

图15C-15D说明根据实施方式的用脱气缓冲器填装图14的细胞分选器芯片。

图16是说明根据实施方式的自动分选校准方法的流程图。

图17A-17B说明根据实施方式的颗粒分选定位和定时的最优化。

具体实施方式

本申请公开的实施方式总地涉及流式细胞计数法和荧光激活细胞分选的系统、设备和方法，以及在一些实施方式中涉及包括任选与本申请公开的一个或多个子组件组合的基于微流体的流式细胞计数法和荧光激活细胞分选(FACS)的系统、设备和方法。

传统细胞分选器如FACS Aria(BD)使用具有复杂的本来对于每次实验并非一次性的流体线的压力泵。传统细胞分选器的用户通常在实验之间进行严格的洗涤步骤以避免交叉污染。基于微流体的细胞分选器如Tyto Cell Sorter(Miltenyi Biotec)或On-chipSort(On-chip Biotechnologies)使用压力泵或注射泵，从而使分选具有恒定的流动速率；但是，这些泵较为昂贵。

在一些实施方式中，如本申请公开的使用蠕动泵用于将流体泵送到一次性微流体流动单元以及应用流体学(fluidics)可以简化清洁并降低交叉污染的可能性。蠕动泵是价格可承受的并且使得容易替换与样品流体相互作用的任何流体线。此外，相比于现有压力泵，蠕动泵可能相对较为简化，使得它们适用于大多数实验室预算内的相对便宜的仪器。

图1说明根据实施方式的细胞分选系统100。系统100包括与样品流体通道120和鞘液通道130流体连通的分选室110(有时也称为分选芯片或料筒盒)。系统100也包括蠕动泵125，蠕动泵125配置为将样品流体经样品流体通道120从样品流体源126泵送至分选室110。系统也包括蠕动泵135，蠕动泵135配置为将鞘液从鞘液源136经鞘液通道130泵送至分选室110。

蠕动泵可能有时产生大的流量脉动(有时也称为流动速率的变化)，这可能影响流式细胞仪和FACS系统中的分析和分选性能。台式流式细胞仪(但不是分选器)例如得自BDBiosciences的BD Accuri^TM>

本申请公开的一些实施方式涉及用于细胞分选和/或基于微流体的荧光激活细胞分选(FACS)的具有一次性流体部件的蠕动泵。本申请公开的一些实施方式涉及使用蠕动泵驱动鞘液和/或样品流体的流体系统。在这样的系统中，将样品流体和鞘液以恒定的流动速率运送进微流体细胞分选料筒盒，以实现高的颗粒分选和/或分析性能。恒定的流动速率使用流体减震器实现，流体减震器或可以连接于运送鞘液和样品流体的流体通道(也称为外部减震器)、或者可以一体化到分选料筒盒中(也称为一体式减震器或料筒盒上减震器)。在一些实施方式中，流体减震器可以填充有气体例如空气、惰性气体、或适宜的任何其它气体。在一些实施方式中，流体减震器可以填充有不能混溶的可压缩流体例如水煤气，其通常由合成气制备并且由一氧化碳和氢气构成。

图2显示根据实施方式的包括一个或多个减震器以减小蠕动泵的流动速率变化的细胞分选系统200的示意图。系统200包括分选室210，分选室210配置为接收来自第一流体通道220(有时也称为“样品流体通道”)的第一流体和接收来自第二流体通道230(有时也称为“鞘液通道”)的第二流体(例如，鞘液)。蠕动泵225将第一流体从第一流体源226经第一流体通道220泵送到分选室。第一减震器228连接于第一流体通道220以减小第一通道220中流动速率的变化，由此运送恒定的流到分选室210。类似地，另一个蠕动泵235配置为将第二流体从第二流体源236经第二流体通道230泵送到分选室，且第二减震器238连接于第二流体通道230以减小第二通道230中流动速率的变化。

操作中，分别在第一流体通道220和第二流体通道中的减震器228和238可以填充有气体。在一些实施方式中，在细胞分选之前，整个系统200可以用气体冲刷。然后可以将流体泵送通过系统200以将一些气体残存在减震器228和238内并推出多余气体。当第一流体在第一通道220中流动时，第一流体可以进入第一减震器228并压缩第一减震器228中的气体。换言之，第一减震器228中的气体的一部分可以残存在形成死胡同的减震器228中。以这种方式，第一减震器228可以减慢第一流体在第一流体通道220中的流动。由于离开蠕动泵225的流体的体积流动速率可能周期性波动，第一减震器228中的流体体积可能随着由于液体压力变化而使气体被压缩或膨胀成比例地波动，这抑制了流动速率的扰动。第二减震器238可按照与如上所述第一减震器228类似的方式起作用。

减震器228和238可以按这种方式用作机械低通滤波器，其可以减小流动速率的动态范围(或流动速率的扰动范围，或流动速率的变化，和/或类似物)。这种流动速率范围的减小可以使细胞/粒子速度的分布变窄，因为细胞/粒子通常以与样品流体相同的速率流动。因此，细胞检测和细胞分选之间的时间延迟可以较可靠地推断，从此改善分选性能。在一些实施方式中，减小的脉动可以得到较狭窄的样品流体流的水力聚焦，着由此可以得到较高的检测系统中荧光信号的变异系数(CV)值。

可以将各种类型的气体填充在减震器228和238中。在一个实例中，减震器228和238可以填充有大气。在另一个实例中，减震器228和238可以填充有不容易与样品流体和/或鞘液反应的一种或多种气体，例如，惰性气体(例如，氦气，氖气，氩气，氙气，和/或其组合)。减震器228和238中气体的初始压力可以为，例如，约0.1个大气压，0.2个大气压，0.5个大气压，0.8个大气压，1个大气压，1.2个大气压，1.5个大气压，或者适宜的任何其它压力，包括其间的任何数值和子范围。

在一些实施方式中，减震器228和238中的至少一个可以向各自的流体通道(220或230)开放，使得样品流体和鞘液可以自由地进入减震器228和238。在一些实施方式中，减震器228和238的至少一个可以通过分离器与对应的通道220或230分离。分离器可以包括挠性或柔韧的隔膜，其使得容易将减震器228和238内的体积膨胀和收缩，而不会使减震器228和238内的任何气体泄露。

在一些实施方式中，减震器228和238中的一个或多个可以由一次性材料制成。在一些实施方式中，减震器228和238可以包括硅氧烷和/或纤维-玻璃增强的硅氧烷。在一些实施方式中，减震器228和238可以由丙烯酰基(也称为丙烯酰基，丙-2-烯酰基，或丙烯酰基)制成。在一些实施方式中，减震器228和238可以包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)。再在另一种实例中，减震器228和238可以包括聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)。PMMA通常对可见光透明并且具有低荧光，从而促进细胞的光学检测和分选、以及细胞的显微成像。在一些实施方式中，第一通道220和第一通道230中的管道可以由一次性材料制成。

图3A显示实例减震器(共同由附图标记300表示)的示意图，减震器可以用于利用本申请所述的蠕动泵减小流式细胞仪中的流动速率变化。减震器300包括8个实例非限制性构造，编号#1-#8。第一构造#1包括流体通道310a(例如，类似于样品流体通道或鞘液通道)和连接于流体通道310a以用作减震器的气体室320a。气体室320a具有基本上正方形的形状。在一种实例实施方式中，气体室320a的体积可以为约92mm³。第二构造#2包括流体室310b和连接于流体通道310b的气体室320b。气体室320b具有矩形形状。在一种实例实施方式中，气体室320b的体积为约369mm³。第三构造#3包括流体通道310c和连接于流体通道310c的具有正方形形状的气体室320c。在一种实例实施方式中，气体室320s的体积为约184mm³。对于这三种构造#1至#3，气体室320a至320c分别几乎直接连接于流体通道310a至310c。换言之，气体室320a至320c和对应流体通道310a至310c之间的连接器的尺寸和/或体积可以忽略不计。

图3A中所示的第四至第六构造#4至#6包括具有不同形状的气体室。第四构造#4包括流体通道310d和连接于流体通道310d的气体室320d。气体室320d的主要部分具有正方形形状，但是气体室320d也包括将气体室320d的主要部分与流体通道310d相连接的颈部部分325d。在一种实例实施方式中，气体室320d的体积为92mm³，其可以与气体室310a的体积相同，但是颈部部分325d具有不可忽略的体积。类似地，第五构造#5包括流体通道310e和连接于流体通道310e的气体室320e。气体室320e包括颈部部分325e以将气体室320e的主要部分与流体通道310e相连接。在一种实例实施方式中，气体室320e的体积为约369mm³。第六构造#6包括流体通道310f和连接于流体通道310f的气体室320f。气体室320f包括颈部部分325f以将气体室320f的主要部分与流体通道310f相连接。在一种实例实施方式中，气体室320f的体积为约184mm³。

第七构造#7包括一个流体通道310g和串联连接于流体通道310g的两个气体室320g。在一种实例实施方式中，两个气体室320g的总体积为约368mm³。在一种实施方式中，两个气体室320g的各气体室用作减震器。在另一种实施方式中，两个气体室320g共同用作减震器。第八构造#8包括流体通道310h和串联连接于流体通道310h的三个气体室320h。三个气体室320h的总体积为约552mm³。针对说明的目的，气体室320g和320h设置在对应的流体通道310g和310h的同一侧上。实践中，气体室可以对称或不对称地设置在流体通道两侧上。而且，气体室的数目也可以大于三(例如，5个气体室，8个气体室，10个气体室，或更多个)。

实践中，气体室320a至320h的体积可以不同于图3A中所示的体积。例如，气体室320a至320h的体积可以为约60mm³至约600mm³(例如，约60mm³，约80mm³，约100mm³，约120mm³，约150mm³，约180mm³，约200mm³，约240mm³，约280mm³，约300mm³，约350mm³，约400mm³，约450mm³，约500mm³，约550mm³，和约600mm³，包括其间的任何数值和子范围)。

为了进行解说，图3A中所示的气体室320a至320h的二维(2D)横截面具有矩形(或正方形)形状。可以使用任何适宜形状的减震器320a-320h，这取决于，例如，所得流式细胞仪中的空间和/或分选料筒盒的所需形式因素的约束条件。例如，气体室320a至320h的2D横截面可以是椭圆形的，圆形的，多边形的，或本领域已知的任何其它形状。在三维(3D)空间中，气体室320a至320h可以是，例如，圆柱体，长方体，球体，或本领域已知的任何其它适宜形状。

如本申请使用，气体室320a至320h可以减小流体在对应流体通道310a至310h中扩散的流体速率变化。在一些实施方式中，气体室320a至320h的性能的特征可以在于在使用气体室320a至320h之后的流动速率变化。例如，流动速率的变化可以小于平均流动速率的10％(例如，约10％，约8％，约5％，约3％，约2％，约1％，或小于1％，包括其间的任何数值和子范围)。可以在系统300中实施的平均流动速率可以为，例如，约1μl/min至约10ml/min(例如，1μl/min，5μl/min，10μl/min，20μl/min，30μl/min，50μl/min，75μl/min，100μl/min，150μl/min，200μl/min，250μl/min，300μl/min，400μl/min，500μl/min，600μl/min，700μl/min，800μl/min，900μl/min，1ml/min，2ml/min，3ml/min，5ml/min，7.5ml/min，或10ml/min，包括其间的任何数值和子范围)。

也可以表征气体室320a至320h的性能的另一个参数是通过使用气体室320a至320h诱导的流动速率变化减小。气体室320a至320h可以配置为相比于没有任何气体室的流动速率的变化，将流动速率的变化减小多于80％(例如，多于80％，多于85％，多于90％，多于92.5％，多于95％，多于97.5％，多于98％，多于99％，或多于99.5％，包括其间的任何数值和子范围)。例如，在蠕动泵之后的流动速率可以为0和200μl/min之间的任何数目，即，流动速率的变化为约200μl/min。在使用气体室320a至320h之后，流动速率可以为约110μl/min至约115μl/min，即，流动速率的变化为约5μl/min，对应于97.5％的减少。

图3B说明图3A中所示的第五(“编号5”)和第八(“编号8”)构造中的测量的流动速率。为了对比，没有减震器的系统中的流动速率也包括在图3B中(“单机”)。可以看出，三个系统具有类似的平均流动速率约12μl/min，但是第五构造具有最稳定的性能(即，由误差条棒指示的最少量的流动变化)。在一些实施方式中，较大的减震器体积可以得到较好的性能，因为减震器体积指示部分确定可以压缩和膨胀用于脉动衰减的困住气体的量。第五构造也证实了在宽范围流动速率(例如1μl/min至1ml/min)下的强效性能。

图4A说明根据实施方式的使用外部减震器以调节在蠕动泵之后的流动速率的系统400。系统400包括目标芯片410，目标芯片410接收通过流体通道420运送的流体(例如，样品流体和/或鞘液)。目标芯片410可以是分选室，检测室，和/或以恒定流动速率接收流体的任何其它装置。蠕动泵425将流体经两个室428朝向目标芯片410泵送。流体通道420也可以包括任选的在线过滤器430用于将培养基灭菌或净化。

图4B说明图4A中示意性显示的实例系统。在该实例中，减震器428可以使用流体配件(例如，Nordson Medical，Fort Collins，CO)构造。更特别地，公鲁尔至母鲁尔螺纹式连接器(LC78-1)的公端可以连接于母鲁尔凸耳式三通(例如，FTLT-1)的垂直部段。同一公鲁尔至母鲁尔螺纹式连接器的母端可以封盖有公鲁尔整体式锁定环塞(例如，LP4-1)，由此产生可以困住气体的室。第二同等装配组件也可以构造成产生第二气体室。公鲁尔滑动式连接器(例如，MTLCS-1)可以用于将两个组件与都面朝上的封盖垂直部段连接。0.2μm的Acrodisc注射器式过滤器(例如，4612，PALL Life Sciences，Port Washington，NY)可以连接于组合的组件的一端。两个公鲁尔整体式锁定环至500系列倒钩(1/16")配件(MTLL004-1)可以连接于所得组件的两个自由端。不具有过滤器420的外部减震器428可以用于样品流体。入口硅氧烷管道可以连接于可以连接于空气减震器428的过滤器端上的倒钩，而出口硅氧烷管道可以连接于空气减震器428的出口端上的倒钩。

图5说明使用一个或多个料筒盒上减震器以调节通过蠕动泵运送的流体的流动速率的系统500。系统500包括料筒盒510，料筒盒510配置为接收来自样品通道520的样品流体和接收来自鞘液通道530的鞘液。样品通道520中的蠕动泵525将样品流体从样品流体源526朝向料筒盒510泵送，鞘液通道530中的另一个蠕动泵535将鞘液从鞘液源536朝向料筒盒510泵送。图5中所示的系统500与图1中所示的系统100的不同之处在于料筒盒510包括一体式减震器(参见，例如，图6A，图6B，或图7)以调节样品流体和鞘液的流动速率。

图6A说明系统600，并说明现有基板设计中的真空区可如何修改以构建/包括气体减震器。系统600包括基板601，其中建造真空区以构建与流体通道610流体连通的流体通道610和气体室620(“气窝”)。基板601可以由低成本和一次性材料制成的，例如硅氧烷，纤维-玻璃增强的硅氧烷，丙烯酰基，PDMS，PMMA，或本领域已知的任何其它材料。在一个实例中，气体室620可以在料筒盒610中沿流体通道610模塑。在另一个实例中，气体室620可以通过蚀刻基板601建造。气体室620的参数(例如，体积，流动速率变化的减小等)可以基本上类似于图3A中所示和如上所述的气体室320a至320h。

图6B是图6A中示意性显示的包括一体式减震器的实例细胞分选料筒盒的照片。使用一体式减震器(也称为料筒盒上减震器)可以通过以下方式减小减震器的尺寸和成本：利用芯片料筒盒中的真空区而不是建造另外的外部气体减震器。一体式料筒盒上气体减震器的工作原理可以与上述外部减震器相同：气体残存在流体通道之上的窝中并压缩以抑制流动速率脉动。

图7说明使用芯片上减震器以调节流体(例如，样品流体和鞘液)的流动速率的实例流式细胞仪700。细胞仪700包括其中建造分选室710的基板701。分选室710接收样品流体(包括来自样品通道720的待分选的细胞)，和接收来自鞘液通道730的鞘液。样品通道720包括与样品流体通道720流体连通的样品流体减震器728。鞘液通道730类似地包括与鞘液通道730流体连通的鞘液减震器738。两个减震器728和738(也称为泡沫减震器)包括由基板701限定的真空区，因此一体化到具有高度紧凑性的基板701中。在分选之后，将样品流体中不同类型的细胞引导到输出通道740中的三个不同输出端口742a、742b、和742c。实践中，输出端口的数目(以及可以通过分选系统700区分的不同类型细胞的数目)可以大于3或小于3。图7中所示的系统700建造在单个芯片中，因此可以高度紧凑。而且，基板701可以由低成本和一次性材料制成，从而避免不同试验之间的大量清洁。

图8A显示实例流式细胞仪800，其中本申请所述气体减震器可以用于稳定例如样品流体和鞘液的流动速率。流式细胞仪800包括分选室810，其中包括有用细胞的样品流体801夹在两股鞘液流802a和802b之间。来自两股流鞘液820a和802b和样品流体801的压力比可以一致和稳定，用于沿主要通道适当分析和分选。可以影响该压力比的一个因素可以是样品流体和鞘液的流动速率。为此，蠕动泵与上述气体减震器的组合可以用于运送样品流体801和鞘液802a和802b，从而得到恒定的流动速率。一旦检测有用的细胞，分选室可以使用压电促动器802以使样品流体801偏向指定的输出通道830。利用压电分选的流式细胞仪的更多信息可见美国专利9,134,221，其整个公开内容完全并入本申请以作参考。

图8B说明可以利用一个或多个本申请所述的减震器的实例检测和分选芯片910。外部芯片901承载和/或通常可流体连接于检测和分选芯片910。在一些实施方式中，检测和分选芯片910可以从外部芯片901拆去。检测和分选芯片910包括分选接头913，其中不同的细胞由压电促动器912引导进不同的输出通道。在一些实施方式中，压电促动器912可以响应于施加在压电促动器912上的正电压向上弯曲、和响应于施加在压电促动器912上的负电压向下弯曲。通过朝不同方向弯曲，压电促动器912可以将芯片910的输入通道中的细胞引导到芯片910的不同输出通道。

外部芯片901包括将样品流体传送进系统900的样品输入端口920a和将鞘液传送进系统900的鞘液输入端口。外部芯片901进一步包括吹洗输出端口925，从而在例如吹洗流体清洁系统900之后移除吹洗流体。将三个输出端口930a-930c设置在外部芯片901的边缘，以接收来自分选接头913的细胞并运送接收的细胞。输出端口930包括分选A输出930a、未分选输出930c、和分选B输出930b。在一些实施方式中，当压电促动器912分别向上和向下弯曲时，分选A输出930a和分选B输出930b接收来自分选接头的细胞，当压电促动器912处于未施加电压的其中性状态时，未分选输出930c可以接收细胞。换句话说，外部芯片901可以具有在其中形成的流体通道(未显示)，该通道将输入端口920a-920b、吹洗输出端口925、和分选后输出端口930a-930c连接于检测和分选芯片910的各端口。使用可替换的检测和分选芯片910可以防止样品间污染。

图9说明在使用蠕动泵的系统中具有和不具有气体减震器时测得的流动速率。当将蠕动泵管道直接连接于不具有气体减震器的分选芯片时，用与流体线串联置于下游的流动速率传感器(例如，Fluigent，Paris)观察到剧烈的脉动(“无减震器”线)。该流动速率脉动为0到超过200μL/min。当气体减震器连接在泵和芯片之间时，流动速率脉动范围将至110到113μL/min(“外部减震器”线)，证明流动速率变化的显著减小。

图10A-10B是分别对于样品流体和鞘液，使用外部气体减震器时流动速率相对于时间的关系图。鞘液和样品流体两者流动速率的重复分析表明当使用气体减震器时脉动的一致减小。在这些实验中，鞘液的平均流动速率为约120μL/min，样品流体的平均流动速率为约20μL/min。在两种情况中，所得流动速率的变化小于5μL/min。这种流动速率变化的减小可以允许细胞分选系统使用蠕动泵而不会损害分选功能的性能。

图11A-11B是对于鞘液，在使用和布使用料筒盒上减震器的情况下流动速率相对于时间的关系图。不使用料筒盒上减震器时，鞘液在蠕动泵之后的流动速率以约40个循环每分钟的振荡频率在0和约145μL/min之间振荡。将料筒盒上减震器包括进系统中可使流动速率显著稳定在约115μL/min，其中变化小于5μL/min。

图12A–12B是对于样品流体，在使用和布使用料筒盒上减震器的情况下流动速率相对于时间的关系图。不使用料筒盒上减震器时，样品流体在蠕动泵之后的流动速率以约6个循环每分钟的振荡频率在0和约35μL/min之间振荡。而且，在每个循环内也存在一些高频率的流动速率振荡。将料筒盒上减震器包括进系统中可使流动速率显著稳定在约25μL/min，其中变化小于3μL/min。

图13A说明验证分选的方法，和说明微流体检测器/分选器1500(例如，结构上和/或功能上类似于系统100的方面)，其包括在粒子分选接头1511下游的一个或多个分支流体通道1510A-1510C中的传感机构(例如，附图标记1514A-1514C，以下更详细地描述)。在一些实施方式中，在微粒体传感器中在分选前位置使用光学传感和在分选后位置使用传感(例如，光学传感，基于阻抗的传感，和/或类似物)的组合可以用于提供对较有效的流式细胞仪测量的较好受控操作。在图示的实施方式中，分选后传感可以用于验证是否适当执行了粒子分选接头1511中促动器进行的所需粒子分选。在图示的实施方式中，分选后传感可以用作操作分选后值的输入。

在一些实施方式中，图13A的实施方式包括分支验证结构(例如，1514A)，该结构连接于分支流体通道之一(例如，通道1510A)，以接收来自一个分支流体通道的光和/或检测一个分支流体通道中的阻抗并产生可以验证目标粒子是否由促动器引导进一个分支流体通道的分支验证光学信号。两个或更多个这样的分支验证结构可以在一些实施方式中实施。在图13A的实施方式中，三个分支流体通道1510A-1510C全都具有这样的验证检测模块1514A-1514C。在其它实施方式中，一些分支可以具有这样的验证结构，而其它分支可以不具有。

在图13A的实例实施方式中，定位光学检测器1520以接收至少包括来自粒子检测模块1512的一个或多个光信号和来自验证检测模块1514A-1514C的分支验证光学信号的光。在一些实施方式中，光学检测器产生携载接收的光中包含的信息的检测器信号。粒子分选器控制模块1524中的信号处理机构提取分支验证光学信号的信息以产生指示，该指示验证目标粒子是否通过促动器引导进一个分支流体通道中。在一些实施方式中，不管是使用基于光学的验证还是使用基于阻抗的验证，验证信号都可以自动反馈回到粒子分选器控制模块1524，该模块响应于分选中的故障验证可以中端系统操作(例如，通过促动器停止进入样品流和分选操作)。在一些实施方式中，警戒信号(例如，视觉信号如弹出警报和/或闪光灯，声频信号如警笛声，和/或类似物)可以通过粒子分选器控制模块1524产生以警示微流体检测器的操作员分选故障。

图13B是显示分选方法的各个步骤的示波器踪迹。首先，光学检测荧光信号中最左边的峰。负峰力矩表示分选促动器(例如，图8中所示的压电促动器)的启动。最右边的峰是作为成功分选结果的分选后验证阻抗信号。关于使用阻抗信号的分选后验证的更多信息可见PCT申请PCT/US2013/065111，其完全并入本申请以作参考。

如果流动速率脉动太高，可以观察到极少的正确分选事件。而且，粒子行进的速度可能较不一致。因此，分选延迟实践是粒子检测和离子分选促动之间的时间，由此也是较不一致的。这可以导致粒子加速或减速，由此降低分选效率，其可以定义为正确的分选事件数目与检测事件数目的比率。例如，如果100个细胞通过检测系统检测，且50个细胞被引导到正确的输出通道，则分选效率为50％。不使用减震器的情况下，分选效率可能较差，在约0和约70％之间极大地变化。当使用气体减震器时，分选性能可以由蠕动泵显著地改善。图13证明可以实现分选效率大于约90％，和至多约99％。

在大多数微流体系统中，可能期望完全或基本上完全移除气泡，因为气泡往往会使信号质量衰变，并且由于流体的压缩性使得难以控制流体。为实现最佳仪器性能的稳定和受控的流动状态，微流体芯片通常预先填充有液体(称为“填装”的方法)，由此移除微流体通道中的任何气泡。在运行粒子样品进行分析或细胞分选之前用液体填装芯片和移除气泡可以使用战略上设计的微流体通道和端口的组合完成。

图14显示微流体芯片的示意图以说明填装的方法。芯片1400包括基板1401(或底座)，在其上可以设置芯片1400中的其它部件。芯片1400包括两个流体入口：运送鞘液的鞘液入口1422和运送样品流体的样品流体入口1424。将鞘液和样品流体传送到分选接头1410，其中将样品流体中的不同细胞引导进不同的输出通道1440。分选通过压电(PZE)促动器在PZT室1430中进行，该室可以使样品流体偏向不同的输出通道1440。在一些实例中，PZT室1430的直径可以为约10mm至约30mm(例如，10mm，15mm，20mm，25mm，或30mm)，PZT室1430的深度可以为2–5mm(例如，2mm，2.5mm，3mm，3.5mm，4mm，4.5mm，和5mm)。该室1430的直径和体积可以比典型微粒体室大1-2个数量级，为数十至数百微米。由于微流体通道和室之间的尺寸不匹配及其结构，引入液体可能不足以通过置换气体填装微流体芯片1400。

因为不同于典型非流体，室1430具有中尺度尺寸，重力可能对流动和填充产生较大的影响。因此，垂直安装芯片和在PZT室1430的顶部上产生吹洗端口1450有助于完全充满室。PZT室1430和另一侧上的液体室可以经排放气体的流体通道连接，确保两个室都完全填充有液体。流体通道和吹洗端口1450的取向和定位允许重力辅助吹洗不需要的气体。

主要流通道和将主要流通道连接于分选室的颈部可能易于形成小气泡，主要是由于大多数塑料材料的差的可湿性，包括PDMS，PMMA，和环状烯烃共聚物COC/环状烯烃聚合物COPs。图15A-15B图示该问题。在将常规缓冲器填入芯片1400之后，在PZE室1430中仍可能存在一些气体。

图15C-15D说明使用脱气缓冲器填装微流体芯片1400的方法。为了在引入流体以填充室之后移除任何剩余的气泡，可以装载脱气缓冲器，泵可以将缓冲器导入芯片1400。或者，泵和芯片之间的线路可以具有“线路中”脱气机。在将仪器装载进仪器之前可以将填装液体脱气，或者使用置于泵和芯片之间的“线路中”真空将填装液体脱气。当将脱气液体引入微流体通道和分选PZT室之间的颈部的区域时，任何困住的气体溶解到流体中，且芯片完全填充有液体，如图15D所示。

传统粒子分选方法使用压电换能器以将流分成液滴。粒子(例如，细胞)当打破后可以包含在那些液滴的一些中。当形成液滴时，液滴可以带有正离子或负离子。液滴流然后穿过一对充电板(例如，在±5000V充电)，使得带电的液滴可以偏斜并收集进试管/孔中。

因此，流分选的一个方面是施加电荷于正确的液滴(即，包含所需粒子的那些)，而对其它部施加。为了这样做，应该精确调整称为“时间延迟”或“分选延迟”的参数。在传统细胞分选器中，时间延迟或分选延迟是粒子从分析点移动到包含粒子的液滴从流打碎的点所耗费的时间。时间延迟通过几个因素确定，其包括但不限于：分析点和分选点之间的距离，流动速度，液滴的产生速率，充电频率等。如果未适当调整时间延迟，可能不利地影响分选纯度和效率。而且，用户可能无法监测实时分选结果。相反，用户必须使用细胞仪收集和分析分选的样品以获得分选信息。这可能是为何传统细胞分选器通常仅由训练有素的技术人员在核心器件中操作的原因之一。

但是，本申请公开的粒子分选器可以用于进行闭环粒子分选。在图14所示的系统中，时间/分选延迟是当光学检测到粒子时和当粒子到达分选接头(在这种情况下，被触发以使粒子偏斜进入三个分选通道之一的促动器)时之间的时间。可以使用散射的光和/或发射的荧光(通过一个或多个光检测器检测)作为触发分选启动的信号。芯片上压电(PZT)促动器通过在芯片分选接头瞬时改变流运动来分选粒子。粒子分选器使用电学方法(例如，阻抗测量)和/或光学方法，获得验证信号以确认分选状态。而且，处理器(电子硬件)执行调整与光学检测信号、PZT触发信号和确认信号有关的定时以提高分选效率和监测实时分选状态的方法。

数字分选延迟可以用于补偿任何较小的Y-轴对准差异、较小的制造差异、或较小的流动速率差异。在Y-轴中对准可以实现适当的分选定时，因为PZT分选促动器应该在下述情况发生时的准确时间启动：当粒子在检测区域进行器上游检测之后位于微流体分选接头时。适当的分选延迟也可能根据芯片不同而变化，这是由于微流体芯片制造中的缺陷和PZT性能中的变化。通常，给定芯片的所需分选延迟对于给定的流动速率保持恒定。

为了解决制造缺陷和性能变化，分选系统可以根据距离和速度信息限定分选延迟的范围，而不是仅用一个固定的分选延迟值。然后，系统可以单步调试该范围的分选延迟值。例如，系统可以单步调试由少至1μs/步分离的一个或多个分选延迟值。在一些情况中，对于粗略校准，系统可以采取大步骤(例如，10μs)，对于较精确校准，可以采取较小步骤(例如，1μs)。

在各步骤，系统测量数十、数百或数千粒子或更多以获得分选效率，分选效率定义为分选确认信号相对于PZT触发事件总数的百分比。分选验证信号可以是在分选通道中的下游测量的电信号或光信号。一个实例是在微流体芯片中的流体通道下游使用金电极。电极用于提供电场。当粒子横穿该电场时，系统测量归因于流动通过通道的粒子的电信号(例如，阻抗信号)的调制。

一旦系统完成某一距离范围(例如100μm至250μm)的循环计算，则其通知用户达到的分选效率。如果该分选精确度高于可接受的阈值，则系统设置产生分选精确度的分选延迟，重置准备中的系统用于实际样品运行，并通知用户校准过程完成。否则，系统提示用户重复具有较宽分选延迟范围的校准过程。如果未达到所需的分选精确度(例如，在三次试验后)，系统通知用户替换芯片并重复该自动校准测试。

图16说明上述自动分选延迟校准的方法。方法1600起始于步骤1610以引发自动分选延迟校准，然后步骤1620，在该步骤在现有的研究范围内设置较低的分选延迟值。在步骤1630，操作检测和分选系统，记录分选精确度和触发精确度。记录的分选精确度和触发精确度可以用于找出产生最大分选精确度的分选延迟值，如在步骤1640中。在步骤1650，检查信号以确定其是否令人满意。响应于不令人满意的信号，方法1600行进至步骤1660，在该步骤重复自动分选延迟或替换分选芯片。另一方面，响应于在步骤1650的令人满意的信号，方法1600行进至步骤1670，在该步骤设置产生最大分选精确度的分选延迟。而且，也可以针对实际样品运行设置系统，从而完成校准。

图17A-17B说明粒子分选定位和定时的最优化。图17A是分选效率与在通道Y-轴上的位置的关系图。图17B显示分选接头1700的示意图，分选接头1700包括传送样品流体的流体通道1710和将样品流体中的细胞朝指定的输出通道1730引导的PZT促动器1720。流体通道1710包括区域1715，其称为Y-轴区域，在该区域将位置最优化以控制PZT触发的精确定时。基于图17A所示的图，可以选择产生最大分选效率的位置以建立微流体芯片。

尽管本申请已经描述和阐释了各种本发明实施方式，但是本领域技术人员将容易想到用于进行结果和/或本申请所述一个或多个优点的功能和/或获得结果和/或本申请所述一个或多个优点的多个其它装置和/或结构，认为这样的变化和/或修改各自在本申请所述的本发明实施方式的范围内。更通常地，本领域技术人员将容易知晓，本申请所述的所有参数、尺寸、材料、和构造意在为示例性的，并且实际参数、尺寸、材料、和/或构造将取决于具体应用或本发明教导所用于的应用。本领域技术人员仅使用常规实验就将认识到、或能够确定本申请所述的具体本发明实施方式的很多等同物。因此，应该理解前述实施方式仅作为实例展示，且可以在所附权利要求及其等同物范围内实践本发明实施方式，而无需具体描述或要求保护。本申请的本发明实施方式涉及本申请所述的各单独特征、系统、制品、材料、成套用品、和/或方法。而且，如果这样的特征、系统、制品、材料、成套用品、和/或方法没有相互矛盾，两种或更多种这样的特征、系统、制品、材料、成套用品、和/或方法的任何组合包括在本申请的本发明范围内。

上述实施方式可以按多种方式的任一种实施。例如，设计和制造本申请公开术语的实施方式可以使用硬件、软件或其组合实施。当在软件中实施时，软件代码可以在任何适宜的处理器或收集处理器上执行，不管是在单个计算机中提供还是在多个计算机中分布。

此外，应该知晓计算机可以按多种形式的任一种实施，例如安装在机架上的计算机，台式机，手提电脑，或平板电脑。另外，计算机可以在通常不认作是计算机但具有适宜的处理能力的装置中实施，包括掌上电脑(PDA)，智能手机或任何其它适宜的便携式或固定的电子装置。

同样，计算机可以具有一个或多个输入和输出装置。这些装置尤其可以用于呈现用户界面。可以用于提供用户界面的输出装置的实例包括用于视觉显示输出的打印机或显示屏、和用于听觉显示输出的扬声器或其它声音产生装置。可以用于用户界面的输入装置的实例包括键盘，和指向设备例如鼠标、触摸板、和数字面板。作为另一个实例，计算机可以通过语音识别或以其它声音格式接收输入信息。

这样的计算机可以通过一个或多个任何适宜形式的网络互连，包括局域网或广域网，例如企业网，和智能网(IN)或互联网。这样的网络可以基于任何适宜的技术，并且可以根据任何适宜的规程操作，并且可以包括无线网络、有线网络或光纤网络。

本申请概述的各种方法或过程(例如，用于设计和制备以上讨论的连接结构和衍射光学元件的方法或过程)可以作为软件编码，所述软件可在利用多种操作系统或平台的任一种的一个或多个处理器上执行。另外，这样的软件可以使用众多适宜的编程语言和/或编程或脚本工具的任一种写出，并且也可以编译为可在框架机或虚拟机上执行的可执行的机器语言代码或中间代码。

在这方面，各种本发明概念可以作为编码有一个或多个程序的计算机可读存储介质(或多个计算机可读存储介质)(例如，计算机内存，一个或多个软盘，光碟，光盘，磁带，闪存，现场可编程门阵列或其它半导体装置中的电路结构，或其它非暂时介质或有形计算机存储介质)，所述程序当在一个或多个计算机或其它处理器上执行时进行执行以上讨论的本发明各种实施方式的方法。计算机可读介质可以是便携式的，使得其上存储的一个或多个程序可以下载到一个或多个不同计算机或其它处理器上，以执行以上讨论的本发明的各个方面。

术语“程序”或“软件”在本申请按一般意义使用，是指可以用于将计算机或其它处理器编程以执行以上讨论的实施方式的各个方面的任何类型的计算机代码或任何组的计算机可执行指令。另外，应该知晓根据一个方面，一个或多个计算机程序当执行时可进行无需留在单个计算机或处理器上的本发明的方法，可以在模块化方式在多个不同计算机或处理器之中至分布以执行本发明的各个方面。

计算机可执行的指令可以为很多形式，例如通过一个或多个计算机或其它装置执行的程序模块。通常，程序模块包括进行特定任务或执行特定抽象数据类型的例程，程序，对象，组件，数据结构等。典型地，程序模块的功能可以在各种实施方式中按需组合或分布。

同样，数据结构可以按任何适宜的形式存储在计算机可读介质中。为了简单示意，数据结构可以显示为具有通过数据结构中的位置相关的字段。这样的关系可以同样如下获得：为字段的存储分配计算机可读介质中传达字段之间关系的位置的。但是，任何适宜的机构可以用于建立数据结构的字段中信息之间的关系，包括通过使用指针、标签、或建立数据要素之间关系的其它机构。

同样，各种本发明概念可以作为一种或多种方法实施，已经提供了所述方法的实例。作为方法的一部分进行的行为可以按任何适宜的方式排序。因此，可以构建其中行为按不同于图示的顺序进行的实施方式，这可以包括同时进行一些行为，即使在说明性实施方式中显示为顺序的行为。

本申请限定和使用的任何定义应该理解为优先于词典定义、并入本申请以作参考的文件中的定义、和/或限定术语的普通含义。

除非明确地相反指示，本申请使用的非定冠词“一个”和“一种”应该理解为表示“至少一个”。本申请与提及的数字指代物连用的术语“约”、“大约”和“基本上”表示提及的数字指代物±提及的数字指代物的至多10％。例如，语言“约50”单位或“大约50”单位表示45单位至55单位。这样的方差可以得自制造公差或其它实际考量(例如，与测量仪器有关的公差，可接受的人为误差等)。

本申请使用的短语“和/或”应该理解为表示这样结合的要素的“任一或两者都”，即，在一些情况中要素结合展示，在其它情况中分开展示。用“和/或”列出的多个要素应该按相同方式解释，即，这样结合的要素的“一个或多个”。其它要素可以任选存在，除了由“和/或”条款明确确定的要素，不管与明确确定的那些要素是否相关。因此，作为非限制性实例，当与开放式语言例如“包含”连用时而提及的“A和/或B”在一种实施方式中可以表示仅A(和任选包括不同于B的要素)；在另一种实施方式中表示仅B(和任选包括不同于A的要素)；再在另一种实施方式中表示A和B两者(和任选包括其它要素)；等。

如本申请使用，“或”应该理解为具有与以上限定的“和/或”相同的含义。例如，当在清单中分离条目时，“或”或“和/或”应该解释为包括多个或所列要素的至少一个、但是包括多于一个要素、和任选的另外未列出的条目。仅相反地明确提及术语时，例如“仅之一”或“精确之一”，或当用于权利要求时，“由…组成”将指代包括多个或所列要素的精确的一个要素。通常，当前面有排他性术语例如“任一”、“之一”、“仅之一”或“精确之一”时，本申请使用的术语“或”应该仅理解为表示排他性的替代物(即，“一个或另一个，但不是两个都”)。“基本上由…组成”当用于权利要求时应该具有专利法领域使用的其一般意义。

本申请关于列出的一个或多个要素使用的短语“至少一个”应该理解为表示选自所列要素中任何一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括所列要素内具体列出的每一个要素的至少一个，并不排除所列要素中要素的任何组合。短语“至少一个”表示，除了具体确定在所列要素内的要素，该定义也允许要素可以任选存在，不管与那些具体确定的那些要素是否有关。因此，作为非限制性实例，“A和B的至少一个”(或等同的“A或B的至少一个”、或等同的“A和/或B的至少一个”)在一种实施方式中可以表示至少一个、任选包括多于一个A，其中不存在B(和任选包括不同于B的要素)；在另一种实施方式中表示至少一个、任选包括多于一个B，其中不存在A(和任选包括不同于A的要素)；再在另一种实施方式中表示至少一个、任选包括多于一个A，和至少一个、任选包括多于一个B(和任选包括其它要素)；等。

所有过渡短语例如“包含”、“包括”、“携载”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”、“由…构成”等理解为开放式的，即，表示包括但不限于。仅过渡短语“由…组成”和“基本上由…组成”应该分别是封闭式或半封闭式的过渡短语，正如美国专利审查程序手册第2111.03部分所规定。