一种山萮菜药材的HPLC‑DAD指纹图谱质量测定方法

摘要

本发明公开了一种山萮菜药材的HPLC‑DAD指纹图谱质量测定方法，其步骤包括，分别制备供试品溶液和3‑丁烯基异硫氰酸酯对照品、5‑甲硫戊基‑异硫氰酸酯对照品、6‑甲硫己基‑异硫氰酸酯对照品制备得到的对照品溶液后，注入高效液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，得到山萮菜药材的指纹图谱。本发明方法采用山嵛菜药材以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，通过构建嵛菜药材的指纹图谱，真实反映出山嵛菜药材所含特征物质，分析测定山嵛菜药材中异硫氰酸酯类化合物，同时可作为山嵛菜药材的质量控制方法，具有分离效果好、灵敏度高的特点。

说明书

技术领域

本发明是一种山萮菜药材的HPLC-DAD指纹图谱质量测定方法，具体涉及对山萮菜药材进行的HPLC-DAD指纹图谱质量评价方法，属于中药质量控制领域。

背景技术

山嵛菜( Eutrema> Maxim)，又称山葵，是十字花科山嵛菜属多年生宿根草本植物。山嵛菜含有丰富的芥子油，以具独特的香、辛、甘粘的特性而居各种香辛调味之首，此外，还具有助消化、消除 毒、抗活性氧自由基及拮抗多种人体疾病病菌的作用，具有较高的食用保健价值。其中的主要辛辣成分异硫氰酸酯( Isothiocyanate) 更具有抗菌、抗癌、抗氧化等多种药理作用。山嵛菜中的辛辣成分异硫氰酸酯是植物细胞遭破坏时在一定的外界条件下由内源酶催化母体硫葡糖苷而产生，它的结构决定了它的化学活泼性及易挥发性，在保存过程中易降解。

在已有的文献报道中，人们对其提取工艺、种植技术、芥末酱研制、营养成分等的研究较多，例如，李建颖、卜路霞等人发表的“自菜粕中提取芥子油甙的最佳工艺研究”（《食品研究与开发》2010年11月第31卷第11期）中提到，菜籽粕的提取芥子油甙的最佳溶剂选择为甲醇，特别是用40%甲醇提取所测得的芥子油甙含量最高，其次，正交试验对最佳工艺条件进行了验证，其结果表明，影响芥子油甙提取的主要因素依次是甲醇浓度、温度、料液比和时间。除上述研究外，现有文献报道中鲜有关于山嵛菜药材的质量控制方面的研究，

我们知道，中药质量控制是现代中药发展的瓶颈之一，目前我国在现有标准中，中药材、中成药的质量标准大量限于鉴别外观、性状检查，很少对其中有效成分进行检查，即使在建立成分测定的标准中，所测成分大部分仅为1～2 个指标成分，而不是直接与疗效相关的有效成分。对于山萮菜药材而言，整个药材市场缺乏对药材准确的，科学的质量评价。现有技术中，色谱指纹图谱分析是一种十分可行的质量控制模式，它可为中药材和中成药提供综合的、宏观的和可量化的质量评价。为此，本发明提出了一种山萮菜药材的HPLC-DAD指纹图谱质量测定方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山萮菜药材的HPLC-DAD指纹图谱质量测定方法，该测定方法采用山嵛菜药材以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，通过构建嵛菜药材的指纹图谱，真实反映出山嵛菜药材所含特征物质，分析测定山嵛菜药材中异硫氰酸酯类化合物，同时可作为山嵛菜药材的质量控制方法，具有分离效果好、灵敏度高的特点。

本发明通过下述技术方案实现：一种山萮菜药材的HPLC-DAD指纹图谱质量测定方法，包括以下步骤：

（A）供试品溶液的制备：取山嵛菜药材溶置于甲醇中，经超声处理后，再放冷过滤，取续滤液作为供试品溶液，待用；

（B）对照品溶液的制备：取3-丁烯基异硫氰酸酯对照品，5-甲硫戊基-异硫氰酸酯对照品，6-甲硫己基-异硫氰酸酯对照品，溶解于甲醇中，配制成对照品溶液，待用；

（C）测定：分别吸取供试品溶液与对照品溶液注入高效液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，得到山萮菜药材的指纹图谱。

所述步骤（A）中，取山嵛菜药材粉末0.5～2.0g，置于20～80ml甲醇中，经超声处理0.5～1h后，放冷至10～30℃后摇匀，再用0.22um的微孔滤膜过滤后，取续滤液作为供试品溶液。

所述步骤（B）中，控制每1ml对照品溶液中含有80μg3-丁烯基异硫氰酸酯、80μg5-甲硫戊基-异硫氰酸酯和80μg6-甲硫己基-异硫氰酸酯。

所述步骤（C）中，高效液相色谱仪的测定条件满足：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶，

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度脱洗，

色谱柱温度：20～40℃，

流速：0.5～1.5ml/min，

检测波长：205～400nm。

所述梯度脱洗如下：

0～10min： 5～15%流动相A、95～85%流动相B，

10～25min：15～35%流动相A、85～65%流动相B，

25～45min：35～70%流动相A、65～30%流动相B，

45～60min：70～90%流动相A、30～10%流动相B。

根据山萮菜药材的指纹图谱，山嵛菜药材共有9个共有指纹峰，参照物峰S为3-丁烯基异硫氰酸酯色谱峰，9个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.372±0.037、2号峰0.511±0.051、3号峰0.553±0.055、4号峰0.567±0.057、5号峰0.730±0.073、6号峰0.886±0.089、7号峰（S峰）1.000±0.000、8号峰1.253±0.125、9号峰1.391±0.139；各色谱峰的相对保留时间应在规定值的±10%之内。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

（1）本发明方法采用山嵛菜药材以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，具有操作简单、分离度好、精密度高、重复性好、检测时间合理等优点，填补了山萮菜药材质量评价的空白，可用于山萮菜药材生产过程的质量控制。

（2）本发明方法提供了一种通过整体指纹图谱信息对山嵛菜药材质量进行评价的方法，避免了在药材质量控制判断的片面性、主观性，使得山嵛菜药材质量控制更加准确、科学、合理。

（3）本发明方法采用甲醇、超声的方法对山萮菜药材进行提取，可较全面的检测山嵛菜中的多种主要有效成分，从而构建山萮菜药材的HPLC-DAD指纹图谱，为山嵛菜药材的整体质量评价提供有效方法。

附图说明

图1为10批山嵛菜药材得到的高效液相相似度分析图谱。

图2为山嵛菜药材3D色谱图。

图3为山嵛菜药材的指纹图谱。

图3中，峰1—特征峰1，峰2—特征峰2，峰3—5-甲硫戊基-异硫氰酸酯，峰4—特征峰4，峰5—特征峰5，峰6—特征峰6，峰7—3-丁烯基异硫氰酸酯（S峰），峰8—6-甲硫己基-异硫氰酸酯，峰9—特征峰9。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

按仪器使用Agilent 1260高效液相色谱仪；二极管阵列（DAD）检测器：G4212B；自动进样器：G1329B；四元梯度洗脱泵：G1311C；柱温箱：G1316A；色谱工作站：AgilentChemstation（美国安捷伦科技有限公司）。CPA225D型电子天平（十万分之一，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司）；JE2002电子天平（百分之一，上海浦春计量仪器有限公司）；BK-900B超声波清洗机（济南巴克超声波科技有限公司）；Welch Ulimate®XB-C18色谱柱（4.6 mm× 250 mm × 5 μm，月旭材料科技（上海）有限公司），岛津Inertsil® ODS-3色谱柱（4.6mm × 250 mm × 5 μm），资生堂 SPOLAR-C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm × 5 μm）。

试剂使用乙腈为色谱纯（Fisher），水为超纯水（美国Millipore公司）；其他试剂为分析纯（成都市科龙化工试剂厂）。

山萮菜药材均采自高海拔地区，如下表1所示。

表1 10批山嵛菜药材样品来源

分别进行以下检测：

实施例1：

本实施例提出了一种山萮菜药材的HPLC-DAD指纹图谱质量测定方法，步骤如下：

（A）供试品溶液的制备：取山嵛菜药材0.5g，置于20ml的甲醇中，经超声处理（功率250W，频率45KHz）0.5h后，放冷至10℃后摇匀，用0.22um的微孔滤膜过滤后，取续滤液作为供试品溶液，待用；

（B）对照品溶液的制备：取3-丁烯基异硫氰酸酯对照品，5-甲硫戊基-异硫氰酸酯对照品，6-甲硫己基-异硫氰酸酯对照品，溶解于甲醇中，配制成每1ml含有80μg3-丁烯基异硫氰酸酯、80μg5-甲硫戊基-异硫氰酸酯和80μg6-甲硫己基-异硫氰酸酯的对照品溶液，待用；

（C）测定：分别吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，得到山萮菜药材的指纹图谱，

其中，高效液相色谱仪的测定条件满足：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶，

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度脱洗，

色谱柱温度：30℃，

流速：1.0ml/min，

检测波长：205nm，

理论塔板数按3-丁烯基异硫氰酸计算不低于5000，

采用线性梯度洗脱程序，如下表2所示：

表2 实施例1中山嵛菜分析检测梯度洗脱程序

根据本实施例得到的山萮菜药材的指纹图谱，分析得到，山嵛菜药材共有9个共有指纹峰，参照物峰S为3-丁烯基异硫氰酸酯色谱峰，9个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.373、2号峰0.51、3号峰0.55、4号峰0.568、5号峰0.729、6号峰0.886、7号峰（S峰）1.000、8号峰1.255、9号峰1.393；9个共有指纹峰的相对峰面积比值分别为：1号峰0.13、2号峰0.080、3号峰0.75、4号峰0.52、5号峰0.30、6号峰0.65、7号峰（S峰）1.000、8号峰0.53、9号峰0.38。

实施例2：

本实施例提出了一种山萮菜药材的HPLC-DAD指纹图谱质量测定方法，步骤如下：

（A）供试品溶液的制备：取山嵛菜药材1.0g，置于40ml的甲醇中，经超声处理（功率250W，频率45KHz）1h后，放冷至30℃后摇匀，用0.22um的微孔滤膜过滤后，取续滤液作为供试品溶液，待用；

（B）对照品溶液的制备：取3-丁烯基异硫氰酸酯对照品，5-甲硫戊基-异硫氰酸酯对照品，6-甲硫己基-异硫氰酸酯对照品，溶解于甲醇中，配制成每1ml含有80μg3-丁烯基异硫氰酸酯、80μg5-甲硫戊基-异硫氰酸酯和80μg6-甲硫己基-异硫氰酸酯的对照品溶液，待用；

（C）测定：分别吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，得到山萮菜药材的指纹图谱，

其中，高效液相色谱仪的测定条件满足：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶，

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度脱洗，

色谱柱温度：30℃，

流速：1.0ml/min，

检测波长：205nm，

理论塔板数按3-丁烯基异硫氰酸计算不低于5000，

采用线性梯度洗脱程序，如下表3所示：

表3 实施例2中山嵛菜分析检测梯度洗脱程序

根据本实施例得到的山萮菜药材的指纹图谱，分析得到，山嵛菜药材共有9个共有指纹峰，参照物峰S为3-丁烯基异硫氰酸酯色谱峰，9个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.375、2号峰0.511、3号峰0.549、4号峰0.557、5号峰0.730、6号峰0.885、7号峰（S峰）1.000、8号峰1.254、9号峰1.390；9个共有指纹峰的相对峰面积比值分别为：1号峰0.11、2号峰0.078、3号峰0.70、4号峰0.58、5号峰0.28、6号峰0.75、7号峰（S峰）1.000、8号峰0.53、9号峰0.37。

实施例3：

本实施例提出了一种山萮菜药材的HPLC-DAD指纹图谱质量测定方法，步骤如下：

（A）供试品溶液的制备：取山嵛菜药材2.0g，置于80ml的甲醇中，经超声处理（功率250W，频率45KHz）0.5h后，放冷至25℃后摇匀，用0.22um的微孔滤膜过滤后，取续滤液作为供试品溶液，待用；

（B）对照品溶液的制备：取3-丁烯基异硫氰酸酯对照品，5-甲硫戊基-异硫氰酸酯对照品，6-甲硫己基-异硫氰酸酯对照品，溶解于甲醇中，配制成每1ml含有80μg3-丁烯基异硫氰酸酯、80μg5-甲硫戊基-异硫氰酸酯和80μg6-甲硫己基-异硫氰酸酯的对照品溶液，待用；

（C）测定：分别吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，得到山萮菜药材的指纹图谱，

其中，高效液相色谱仪的测定条件满足：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶，

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度脱洗，

色谱柱温度：30℃，

流速：1.0ml/min，

检测波长：205nm，

理论塔板数按3-丁烯基异硫氰酸计算不低于5000，

采用线性梯度洗脱程序，如下表4所示：

表4 实施例3中山嵛菜分析检测梯度洗脱程序

根据本实施例得到的山萮菜药材的指纹图谱，分析得到，山嵛菜药材共有9个共有指纹峰，参照物峰S为3-丁烯基异硫氰酸酯色谱峰，9个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.373、2号峰0.510、3号峰0.547、4号峰0.559、5号峰0.729、6号峰0.887、7号峰（S峰）1.000、8号峰1.252、9号峰1.392；9个共有指纹峰的相对峰面积比值分别为：1号峰0.12，2号峰0.078，3号峰0.77，4号峰0.53，5号峰0.27，6号峰0.63，7号峰（S峰）1.000，8号峰0.61，9号峰0.42。

实施例4：

本实施例提出了一种山萮菜药材的HPLC-DAD指纹图谱质量测定方法，步骤如下：

（A）供试品溶液的制备：取山嵛菜药材0.8g，置于30ml的甲醇中，经超声处理（功率250W，频率45KHz）0.8h后，放冷至15℃后摇匀，用0.22um的微孔滤膜过滤后，取滤液作为供试品溶液，待用；

（B）对照品溶液的制备：取3-丁烯基异硫氰酸酯对照品，5-甲硫戊基-异硫氰酸酯对照品，6-甲硫己基-异硫氰酸酯对照品，溶解于甲醇中，配制成每1ml含有80μg3-丁烯基异硫氰酸酯、80μg5-甲硫戊基-异硫氰酸酯和80μg6-甲硫己基-异硫氰酸酯的对照品溶液，待用；

（C）测定：分别吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，得到山萮菜药材的指纹图谱，

其中，高效液相色谱仪的测定条件满足：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶，

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度脱洗，

色谱柱温度：20℃，

流速：0.5ml/min，

检测波长：205nm，

理论塔板数按3-丁烯基异硫氰酸计算不低于5000，

采用线性梯度洗脱程序，如下表5所示：

表5 实施例4中山嵛菜分析检测梯度洗脱程序

根据本实施例得到的山萮菜药材的指纹图谱，分析得到，山嵛菜药材共有9个共有指纹峰，参照物峰S为3-丁烯基异硫氰酸酯色谱峰，9个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.387、2号峰0.508、3号峰0.583、4号峰0.579、5号峰0.742、6号峰0.854、7号峰（S峰）1.000、8号峰1.301、9号峰1.286；9个共有指纹峰的相对峰面积比值分别为：1号峰0.12，2号峰0.085，3号峰0.72，4号峰0.56，5号峰0.30，6号峰0.75，7号峰（S峰）1.000，8号峰0.55，9号峰0.38。

实施例5：

本实施例提出了一种山萮菜药材的HPLC-DAD指纹图谱质量测定方法，步骤如下：

（A）供试品溶液的制备：取山嵛菜药材1.5g，置于70ml的甲醇中，经超声处理（功率250W，频率45KHz）1h后，放冷至10℃后摇匀，用0.22um的微孔滤膜过滤后，取续滤液作为供试品溶液，待用；

（B）对照品溶液的制备：取3-丁烯基异硫氰酸酯对照品，5-甲硫戊基-异硫氰酸酯对照品，6-甲硫己基-异硫氰酸酯对照品，溶解于甲醇中，配制成每1ml含有80μg3-丁烯基异硫氰酸酯、80μg5-甲硫戊基-异硫氰酸酯和80μg6-甲硫己基-异硫氰酸酯的对照品溶液，待用；

（C）测定：分别吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，得到山萮菜药材的指纹图谱，

其中，高效液相色谱仪的测定条件满足：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶，

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度脱洗，

色谱柱温度：40℃，

流速：1.5ml/min，

检测波长：205nm，

理论塔板数按3-丁烯基异硫氰酸计算不低于5000，

采用线性梯度洗脱程序，如下表6所示：

表6 实施例5中山嵛菜分析检测梯度洗脱程序

根据本实施例得到的山萮菜药材的指纹图谱，分析得到，山嵛菜药材共有9个共有指纹峰，参照物峰S为3-丁烯基异硫氰酸酯色谱峰，9个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.390、2号峰0.552、3号峰0.547、4号峰0.621、5号峰0.725、6号峰0.926、7号峰（S峰）1.000、8号峰1.286、9号峰1.355；9个共有指纹峰的相对峰面积比值分别为：1号峰0.15，2号峰0.082，3号峰0.70，4号峰0.57，5号峰0.32，6号峰0.77，7号峰（S峰）1.000，8号峰0.50，9号峰0.35。

实施例6：

本实施例提出了一种山萮菜药材的HPLC-DAD指纹图谱质量测定方法，步骤如下：

（A）供试品溶液的制备：取山嵛菜药材1.2g，置于65ml的甲醇中，经超声处理（功率250W，频率45KHz）1h后，放冷至15℃后摇匀，用0.22um的微孔滤膜过滤后，取滤液作为供试品溶液，待用；

（B）对照品溶液的制备：取3-丁烯基异硫氰酸酯对照品，5-甲硫戊基-异硫氰酸酯对照品，6-甲硫己基-异硫氰酸酯对照品，溶解于甲醇中，配制成每1ml含有80μg3-丁烯基异硫氰酸酯、80μg5-甲硫戊基-异硫氰酸酯和80μg6-甲硫己基-异硫氰酸酯的对照品溶液，待用；

（C）测定：分别吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，得到山萮菜药材的指纹图谱，

其中，高效液相色谱仪的测定条件满足：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶，

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度脱洗，

色谱柱温度：25℃，

流速：1.2ml/min，

检测波长：205nm，

理论塔板数按3-丁烯基异硫氰酸计算不低于5000，

采用线性梯度洗脱程序，如下表7所示：

表7 实施例6中山嵛菜分析检测梯度洗脱程序

根据本实施例得到的山萮菜药材的指纹图谱，分析得到，山嵛菜药材共有9个共有指纹峰，参照物峰S为3-丁烯基异硫氰酸酯色谱峰，9个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.372、2号峰0.545、3号峰0.526、4号峰0.582、5号峰0.730、6号峰0.889、7号峰（S峰）1.000、8号峰1.316、9号峰1.398；9个共有指纹峰的相对峰面积比值分别为：1号峰0.11，2号峰0.075，3号峰0.67，4号峰0.60，5号峰0.26，6号峰0.77，7号峰（S峰）1.000，8号峰0.52，9号峰0.39。

实施例7：

本实施例提出了一种山萮菜药材的HPLC-DAD指纹图谱质量测定方法，步骤如下：

（A）供试品溶液的制备：取山嵛菜药材1.8g，置于75ml的甲醇中，经超声处理（功率250W，频率45KHz）0.5h后，放冷至30℃后摇匀，用0.22um的微孔滤膜过滤后，取滤液作为供试品溶液，待用；

（B）对照品溶液的制备：取3-丁烯基异硫氰酸酯对照品，5-甲硫戊基-异硫氰酸酯对照品，6-甲硫己基-异硫氰酸酯对照品，溶解于甲醇中，配制成每1ml含有80μg3-丁烯基异硫氰酸酯、80μg5-甲硫戊基-异硫氰酸酯和80μg6-甲硫己基-异硫氰酸酯的对照品溶液，待用；

（C）测定：分别吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，得到山萮菜药材的指纹图谱，

其中，高效液相色谱仪的测定条件满足：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶，

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度脱洗，

色谱柱温度：35℃，

流速：0.8ml/min，

检测波长：205nm，

理论塔板数按3-丁烯基异硫氰酸计算不低于5000，

采用线性梯度洗脱程序，如下表8所示：

表8 实施例7中山嵛菜分析检测梯度洗脱程序

根据本实施例得到的山萮菜药材的指纹图谱，分析得到，山嵛菜药材共有9个共有指纹峰，参照物峰S为3-丁烯基异硫氰酸酯色谱峰，9个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.377、2号峰0.535、3号峰0.588、4号峰0.612、5号峰0.728、6号峰0.894、7号峰（S峰）1.000、8号峰1.316、9号峰1.358；9个共有指纹峰的相对峰面积比值分别为：1号峰0.13，2号峰0.077，3号峰0.69，4号峰0.54，5号峰0.25，6号峰0.80，7号峰（S峰）1.000，8号峰0.55，9号峰0.38。

实施例8：

本实施例提出了一种山萮菜药材的HPLC-DAD指纹图谱质量测定方法，步骤如下：

（A）供试品溶液的制备：取山嵛菜药材1.0g，置于40ml的甲醇中，经超声处理（功率250W，频率45KHz）0.8h后，放冷至20℃后摇匀，用0.22um的微孔滤膜过滤后，取滤液作为供试品溶液，待用；

（B）对照品溶液的制备：取3-丁烯基异硫氰酸酯对照品，5-甲硫戊基-异硫氰酸酯对照品，6-甲硫己基-异硫氰酸酯对照品，溶解于甲醇中，配制成每1ml含有80μg3-丁烯基异硫氰酸酯、80μg5-甲硫戊基-异硫氰酸酯和80μg6-甲硫己基-异硫氰酸酯的对照品溶液，待用；

（C）测定：分别吸取供试品溶液与对照品溶液各10μl注入高效液相色谱仪，以高效液相色谱法采用梯度脱洗进行测定，得到山萮菜药材的指纹图谱，

其中，高效液相色谱仪的测定条件满足：

填充剂：十八烷基硅烷键合硅胶，

流动相：流动相A为乙腈，流动相B为水，进行梯度脱洗，

色谱柱温度：30℃，

流速：1.0ml/min，

检测波长：205nm，

理论塔板数按3-丁烯基异硫氰酸计算不低于5000，

采用线性梯度洗脱程序，如下表9所示：

表9 实施例8中山嵛菜分析检测梯度洗脱程序

根据本实施例得到的山萮菜药材的指纹图谱，分析得到，山嵛菜药材共有9个共有指纹峰，参照物峰S为3-丁烯基异硫氰酸酯色谱峰，9个共有指纹峰的相对保留时间分别为：1号峰0.371、2号峰0.506、3号峰0.535、4号峰0.562、5号峰0.653、6号峰0.828、7号峰（S峰）1.000、8号峰1.251、9号峰1.395；9个共有指纹峰的相对峰面积比值分别为：1号峰0.12，2号峰0.08，3号峰0.72 ，4号峰0.60，5号峰0.25，6号峰0.77，7号峰（S峰）1.000，8号峰0.51，9号峰0.38。

以下是对上述实施例1-8所述测定方法的补充说明和验证。

一、检测波长的选择

取山嵛菜药材供试品溶液为测定对象，任意选取上述实施例1-8的色谱条件，采用二极管阵列检测器进行全波长扫描分析，结果如图1所示。结果表明，在260nm以上，大部分色谱峰都缺失，且各色谱峰的分离度都不是很理想，随着波长的减小，色谱峰个数也逐渐增多，在210nm，205nm波长下，各色谱峰的分离度良好，基线平稳，且检测的成分最多，可以尽可能多的反映样品化学成分信息。最终，根据色谱峰的峰型、拖尾因子、分离度等进行综合判断，选择205nm作为样品HPLC指纹图谱的检测波长。

二、指纹图谱

根据10批山嵛菜药材HPLC分析检测结果，山嵛菜药材按本发明所述制备方法进行测定，如图2所示，所得的主要色谱峰在40min内出现，1小时的供试品溶液色谱图未出现明显的色谱峰。比较各批样品的色谱图发现9个峰是各批次共有的，由此建立标准指纹图谱。

三、共有峰的标定

根据上述10批山嵛菜供试品指纹图谱相关数据分析结果，如图3所示，共有峰平均相对保留时间依次为1号峰0.372，2号峰0.511，3号峰0.553，4号峰0.567，5号峰0.730，6号峰0.886，7号峰（S峰）1.000，8号峰1.253，9号峰1.391；各色谱峰的相对保留时间应在规定值的±10%之内。

四、共有指纹峰相对保留时间

10批山嵛菜药材供试品指纹图谱中，共有指纹峰的相对保留时间如下表10所示。

表10山嵛菜药材共有指纹峰相对保留时间（n=10）

10批供试品的相对保留时间的RSD均小于2.0%，显示各批次样品的一致性较好。

五、共有指纹峰相对峰面积

上述10批山嵛菜药材公式品指纹图谱中，共有指纹峰的相对峰面积见下表11所示。

表11 山嵛菜药材共有指纹峰相对峰面积（n=10）

参照《中国药典-中药质量标准研究制定技术要求》以及《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求（暂行）》的相关要求，各共有指纹峰的面积比值必须相对固定。供试品图谱中各共有峰面积的比值与指纹图谱中各共有峰面积的比值比较，保留时间小于或等于30分钟的共有峰：单峰面积占总峰面积大于或等于20％的共有峰，其差值不得大于±20％；单峰面积占总峰面积大于或等于10％，而小于20％的共有峰，其差值不得大于±25％；单峰面积占总峰面积大于或等于5％，而小于10％的共有峰，其差值不得大于±30％；单峰面积占总峰面积小于5％的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。保留时间超过30分钟的共有峰：单峰面积占总峰面积大于或等于10％的共有峰，按上述规定执行；单峰面积占总峰面积小于10％的共有峰，峰面积比值不作要求，但必须标定相对保留时间。未达基线分离的共有峰，应计算该组峰的总峰面积作为峰面积，同时标定该组各峰的相对保留时间。在山嵛菜药材中，各共有峰的保留是时间均在30min以内，供试品图谱中各共有峰面积比值与指纹图谱中各共有峰面积的比较，共有峰3、6、7、8单峰面积占总面积大于10%，其差值在±25％之内，共有峰4、5、9单峰面积占总峰小于10%而大于5%，其差值小于±30％；综上分析指纹峰指定符合技术要求规定。

六、山嵛菜药材指纹图谱的相似性评价

将10批山嵛菜药材，按本发明方法进行检测，得到10批药材的指纹图谱，运用中国药典委编制的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”软件进行相似度分析，结果见下表12。

表12 10批山嵛菜药材的相似度评价

七、方法学考察

精密度试验：取批次为1#的样品，按实施例7供试品制备步骤的要求进行制备，连续进样6次，计算得各共有指纹峰的相对保留时间RSD=0.3%，相对峰面积RSD=1.2%，结果表明仪器的精密度良好。

重复性试验：取批次为1#的样品6份，按实施例6供试品制备步骤的要求进行制备，进样分析检测，计算得各共有指纹峰相对保留时间RSD=0.8%,相对峰面积RSD=1.5%，结果表明方法的重复性良好。

稳定性试验：取批次为1#的样品，按实施例5供试品制备步骤的要求进行制备，分别于在0、2、4、8、12、24h进样分析检测，计算各共有指纹峰相对保留时间RSD=1.1%，相对峰面积RSD=1.8%，结果表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

耐用性试验：取批次为1#的样品，按实施例4供试品制备步骤的要求进行制备，使用3种不同品牌的色谱柱进行方法耐用性考察，计算各共有指纹峰相对保留时间RSD=0.8%，相对峰面积RSD=1.2%,结果表明该方法在不同的色谱柱耐用性良好。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化，均落入本发明的保护范围之内。

去获取专利，查看全文>