和AMPA受体特异性结合的新颖化合物

摘要

本发明提供一种以下述式(I)所表示的化合物、其医药上可容许的盐、或其溶剂合物。(式中，A及Z分别独立，为CO、SO或SO

说明书

技术领域

本发明是关于一种和AMPA(α-胺基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑-丙酸)受体特异性结合的新颖化合物、其医药上可容许的盐、及其溶剂合物、以及包含该等化合物的组合物、该等化合物的制造方法、及用以制造该等化合物的中间物。

背景技术

关于AMPA受体，已知：广泛分布在中神经系统，且会参和学习、记忆、神经退化、及细胞死亡等。近年来，正在推进以AMPA受体为目标的关于精神、神经疾病的治疗的研究(专利文献1～3)。为了调查AMPA受体和该等疾病的关系，可寻求对脑内的AMPA受体的显现量及分布进行评价。然而，为了调查该等AMPA受体的显现量等，存在目前必须使用死后脑、及无法和健康人进行比较等各种问题。

关于分子成像法，例如正电子发射断层摄影法(PET)，是能够使活体内的分子的行为在体内可见化的方法。为了使活体内的AMPA受体的行为在体内可见化，以往是使几个分子探针合成(非专利文献1～3)。然而，以往的分子探针由于对AMPA受体的特异性结合不充分、或探针的脑移行性较低的原因，难以将该等使用于AMPA受体的体内成像。因此，寻求和AMPA受体特异性结合并表现出较高的脑内集积的新化合物的开发。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本专利特开2012-207021号公报

专利文献2：日本专利特开2010-202525号公报

专利文献3：日本专利特表2006-525292号公报

非专利文献1：Gao M et al.,Synthesis of carbon-11 and fluorine-18labeled N-acetyl-1-aryl-6,7-dimethoxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinolinederivatives as new potential PET AMPA receptor ligands.,Bioorg.Med.Chem.Lett.2006Apr 15；16(8):2229-33.

非专利文献2：Langstrom B et al.,Endogenous compounds labeled withradionuclides of short half-life-some perspectives.,J.LabelledComp.Radiopharm.2013Mar-Apr；56(3-4):251-62.

非专利文献3：Arstad E.et al.,Closing in on the AMPA receptor:synthesisand evaluation of 2-acetyl-1-(4'-chlorophenyl)-6-methoxy-7-[11C]methoxy-1,2,3,4-tetrahydro-isoquinoline as a potential PET tracer.,Bioorg.Med.Chem.2006Jul 15；14(14):4712-7.

发明内容

[发明要解决的问题]

本发明的目的在于提供一种和AMPA受体特异性结合且脑移行性较高的新颖化合物。本发明的目的特别在于提供一种用以使AMPA受体在体内成像的新颖化合物。

[解决问题的技术手段]

本发明者等人进行了锐意研究，结果在合成能够和AMPA受体特异性结合的较高的新颖化合物方面获得了成功。此外，本发明者等人以通过结晶结构分析而得的关于2-[2,6-二氟-4-({2-[(苯磺酰基)胺基]乙基}硫)苯氧基]乙酰胺和AMPA受体的相互作用部位的见解(Biochemistry 2010年，第49卷，第2843-2850页)为基础，发现：在化合物的两末端具备磺酰胺部位(-SO₂N-)及酰胺基(-CON-)，能够在无损于AMPA受体中的结合活性的情况下对磺酰胺基的氮原子加成取代基，由此使化合物的脑集积性提升。因此，通过本发明而提供的是以下述式(I)所表示的化合物、或其医药上可容许的盐或者溶剂合物。

[化1]

(式中，

A及Z分别独立，为CO、SO或SO₂；

X及Y分别独立，为S或O；

R¹～R⁴分别独立，为氢、烷基、烯基、炔基或卤素；

R⁵每次出现时分别独立，为烷基、烯基、炔基或卤素；

n为0～4的整数)。

在一实施形态中，式(I)的化合物中，1个或1个以上原子为该原子的放射性同位素。

[发明的效果]

本发明的化合物能够和AMPA受体特异性结合，且脑移行性极高。特别是本发明的化合物能够用作分子探针例如PET探针，能够使活体内的AMPA受体在体内进行成像。另外，本发明的化合物容易合成，且能够以高产率获得。

附图说明

图1是表示各种化合物在海马(hippocampus)组织中的集积率的图表。

图2是表示投予PEPA或K-2后的相对于AMPA电流的基准值的比的图表。

图3是表示将K-2或媒剂进行活体投予时的AMPA受体量的变化的图表。左图：呈现在细胞膜表面的AMPA受体的量；右图：AMPA受体的总量。

图4是使用了放射性标记化K-2的大鼠的体内PET图像。左图：投予了媒剂的大鼠；右图：利用0.5mg/kg的非放射性标记化K-2进行阻断的大鼠。

图5是表示大鼠的海马及脑干中的K-2的时间放射能曲线(TAC)。(a)媒剂投予后的海马、(b)阻断后的海马、(c)媒剂投予后的脑干、及(d)阻断后的脑干。图表中，(c)的线和(d)的线重复。

图6是经低浓度(0.05mg/kg)的非放射性标记化K-2进行过阻断的大鼠的体内PET图像。

图7是表示以脑干作为对照的特异性结合的TAC。

图8是将放射性标记化K-2在体内的特异性进行定量化的图表。左：纹状体；右：海马。黑色：投予了媒剂的大鼠；灰色：进行过阻断的大鼠。

图9是表示各脑区域中的AMPA受体的显现总量的比较的图表。

图10是表示各脑区域中的AMPA受体的生物化学显现量和PET图像值(％SUV)的关联的图表。

图11是在两侧纹状体投予了shRNA的大鼠的体内PET图像。使同一个体的左纹状体中显现出相对于GluA1～3的shRNA(使AMPA受体的蛋白质无法显现的RNA)，使右纹状体中显现出零乱RNA(特别不具有效果的RNA)。

图12是在两侧纹状体投予了shRNA的大鼠中的shRNA侧及零乱侧的PET图像值的比较的图表。

具体实施方式

(1.定义)

所谓用语「烷基」，意指脂肪族饱和烃失去1个氢原子而产生的1价基。烷基例如具有1～15个(C₁-C₁₅)碳原子，典型而言，具有1～10个(C₁-C₁₀)、1～8个(C₁-C₈)、1～6个(C₁-C₆)、1～5个(C₁-C₅)、1～4个(C₁-C₄)、1～3个(C₁-C₃)、1～2个(C₁-C₂)、或2～6个(C₂-C₆)碳原子。烷基可为直链或支链状。若列举烷基的例子，则有：甲基、乙基、丙基、异丙基、2-甲基-1-丙基、2-甲基-2-丙基、2-甲基-1-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-3-丁基、2,2-二甲基-1-丙基、2-甲基-1-戊基、3-甲基-1-戊基、4-甲基-1-戊基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、2,2-二甲基-1-丁基、3,3-二甲基-1-丁基、2-乙基-1-丁基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、及己基等，但并无限定。烷基也可进一步利用适当的取代基取代。用语「烷基」可包含含有放射性同位素的烷基，例如[¹¹C]烷基。

所谓用语「烯基」，意指至少具有1个双键的脂肪族不饱和烃基。烯基例如具有2～15个(C₂-C₁₅)碳原子，典型而言，具有2～10个(C₂-C₁₀)、2～8个(C₂-C₈)、2～6个(C₂-C₆)、2～5个(C₂-C₅)、2～4个(C₂-C₄)、2～3个(C₂-C₃)、3～6个(C₃-C₆)、3～8个(C₃-C₈)、4～6个(C₄-C₆)、4～7个(C₄-C₇)、或4～8个(C₄-C₈)碳原子。烯基可为直链或支链状。若列举烯基的例子，则具体而言有：乙烯基(-CH＝CH₂)、烯丙基(-CH₂CH＝CH₂)、-CH＝CH(CH₃)、-CH＝C(CH₃)₂、-C(CH₃)＝CH₂、-C(CH₃)＝CH(CH₃)、-C(CH₂CH₃)＝CH₂、1,3-丁二烯基(-CH＝CH-CH＝CH₂)、及庚-1,6-二烯-4-基(-CH₂-(CH₂CH＝CH₂)₂)等，但并无限定。烯基也可进一步利用适当的取代基取代。用语「烯基」可包含含有放射性同位素的烯基，例如[¹¹C]烯基。

所谓用语「炔基」，意指至少具有1个三键的脂肪族不饱和烃基。炔基例如具有2～15个(C₂-C₁₅)碳原子，典型而言，具有2～10个(C₂-C₁₀)、2～8个(C₂-C₈)、2～6个(C₂-C₆)、2～5个(C₂-C₅)、2～4个(C₂-C₄)、2～3个(C₂-C₃)、3～6个(C₃-C₆)、3～8个(C₃-C₈)、4～6个(C₄-C₆)、4～7个(C₄-C₇)、或4～8个(C₄-C₈)碳原子。炔基可为直链或支链状。若列举炔基的例子，则有：乙炔基(-C≡CH)、-C≡CH(CH₃)、-C≡C(CH₂CH₃)、-CH₂C≡CH、-CH₂C≡C(CH₃)、及-CH₂C≡C(CH₂CH₃)等，但并无限定。炔基也可进一步利用适当的取代基取代。用语「炔基」可包含含有放射性同位素的炔基，例如[¹¹C]炔基。

所谓用语「[¹¹C]烷基」，意指构成烷基的碳中的1个以上为¹¹C的烷基。同样，用语「[¹¹C]烯基」及用语「[¹¹C]炔基」分别意指构成烯基的碳中的1个以上为¹¹C的烯基、及构成炔基的碳中的1个以上为¹¹C的炔基。

用语「卤素(halogen)」或「卤素(halo)」意指氟(-F)、氯(-Cl)、溴(-Br)、及碘(-I)。

所谓用语「医药上可容许的盐」，是指对哺乳动物特别是人类并非有害的盐。医药上可容许的盐可使用包含无机酸或无机碱、或者有机酸或有机碱的无毒性酸或碱而形成。若列举医药上可容许的盐的例子，则有：由铝、钙、锂、镁、钾、钠及锌等而形成的金属盐，或由离胺酸、N,N'-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡萄胺)及普鲁卡因等而形成的有机盐等。另外，医药上可容许的盐包含酸加成盐及碱加成盐。

所谓用语「溶剂合物」，意指相对于本发明化合物的通过1个或多个溶剂分子的聚集而形成的含溶剂化合物。溶剂合物例如包含一溶剂合物、二溶剂合物、三溶剂合物、及四溶剂合物。另外，溶剂合物包含水合物。

(2.化合物及放射性标记化合物)

本发明提供下述式(I)的化合物、或其医药上可容许的盐或者溶剂合物。

[化2]

式中，A及Z分别独立，为CO、SO或SO₂，只要为该等基，则可期待在和AMPA受体之间显示相互作用。该等之中，优选A及Z分别独立，为CO或SO₂，更优选A为SO₂且Z为CO。

X及Y分别独立，为S或O，优选X为S且Y为O。

R¹～R⁴分别独立，为氢、烷基、烯基、炔基或卤素。在一实施形态中，并非R¹～R⁴的全部成为氢，即R¹～R⁴的至少1个为氢以外。在一实施形态中，R²为烷基。在另一实施形态中，R¹为烷基或卤素。R¹可存在于邻位、间位、或对位的任一个。优选R¹存在于对位。在此外另一实施形态中，R³及R⁴中的一个为氢，另一个为烷基。

R⁵每次出现时分别独立，为烷基、烯基、炔基或卤素。优选R⁵为卤素，特别优选氟。进一步优选R⁵相对于Y基存在于两者的邻位(即，相对于X基两者的间位)。

n为0～4的整数。优选n为2。

在此外另一实施形态中，作为式(I)的化合物中的各取代基的组合，在A为SO₂、Z为CO、X为S、Y为O、R²为烷基、R¹为氢、烷基或卤素、且R¹为烷基或卤素的情况下，优选R¹存在于对位、R³及R⁴中一个为氢且另一个为烷基、R⁵每次出现时分别独立为烷基、烯基、炔基或卤素、且n为0～4的整数的组合。

在此外另一实施形态中，作为式(I)的化合物中的各取代基的组合，在A为SO₂、Z为CO、X为S、Y为O、R²为烷基、R¹为氢、烷基或卤素、且R¹为烷基或卤素的情况下，优选R¹存在于对位、R³及R⁴中一个为氢且另一个为烷基、R⁵为卤素、特别是氟、R⁵相对于Y基存在于两者的邻位(即，相对于X基两者的间位)、且n为2的组合。

在此外另一实施形态中，作为式(I)的化合物中的各取代基的组合，在A为SO₂、Z为CO、X为S、Y为O、R²为烷基、R¹为氢、烷基或卤素、且R¹为烷基或卤素的情况下，优选R¹存在于对位、R³及R⁴同时为氢、R⁵每次出现时分别独立为烷基、烯基、炔基或卤素、且n为0～4的整数的组合。

在一实施形态中，自式(I)的化合物除去不包含放射性同位素的2-[2,6-二氟-4-({2-[(苯磺酰基)胺基]乙基}硫)苯氧基]乙酰胺(PEPA)、4-[2-(4-氯苯磺酰基胺基)乙硫基]-2,6-二氟苯氧基乙酰胺、N,N-二甲基-4-[2-(4-氯苯磺酰基胺基)乙硫基]-2,6-二氟苯氧基乙酰胺、4-[2-(4-氯苯磺酰基胺基)乙硫基]-2-氟苯氧基乙酰胺、N,N-二甲基-4-[2-(4-氯苯磺酰基胺基)乙硫基]-2-氟苯氧基乙酰胺、N,N-二甲基-4-[2-(苯磺酰基胺基)乙硫基]-2,6-二氟苯氧基乙酰胺、4-[2-(苯磺酰基胺基)乙硫基]-2-氟苯氧基乙酰胺、及N,N-二甲基-4-[2-(苯磺酰基胺基)乙硫基]-2-氟苯氧基乙酰胺。

若列举式(I)的化合物的具体例，则有以下化合物：

[表1]

在一实施形态中，式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物的构成该化合物的1个或1个以上原子为该原子的放射性同位素，即为下述式(I)的化合物、或其医药上可容许的盐或者溶剂合物：

[化3]

(式中，

A及Z分别独立，为CO、SO或SO₂；

X及Y分别独立，为S或O；

R¹～R⁴分别独立，为氢、烷基、烯基、炔基或卤素；

R⁵每次出现时分别独立，为烷基、烯基、炔基或卤素；

n为0～4的整数；

1个或1个以上原子为该原子的放射性同位素)。

在式(I)的化合物中，放射性同位素选自由¹⁵O、¹³N、¹¹C、及¹⁸F等所组成的群，但并无特别限定。就半衰期的观点而言，放射性同位素优选¹¹C或¹⁸F。

优选R¹～R⁴的1、2、3或4个优选1个为包含放射性同位素的基(例如，[¹¹C]烷基(优选¹¹CH₃)、[¹¹C]烯基、或[¹¹C]炔基、或¹⁸F)。

作为式(I)的化合物，在A为SO₂、Z为CO、X为S、Y为O、R²为烷基、R¹为氢、烷基或卤素、且R¹为烷基或卤素的情况下，优选R¹存在于对位、R³及R⁴中一个为氢且另一个为烷基、R⁵为卤素特别是氟、R⁵相对于Y基存在于两者的邻位(即，相对于X基两者的间位)、n为2、且R1～R4的1个为包含放射性同位素的基(例如，[¹¹C]烷基(优选¹¹CH₃)、[¹¹C]烯基、或[¹¹C]炔基、或¹⁸F)。

在此外另一实施形态中，作为式(I)的化合物，在A为SO₂、Z为CO、X为S、Y为O、R²为烷基、R¹为氢、烷基或卤素、且R¹为烷基或卤素的情况下，更优选R¹存在于对位、R³及R⁴中一个为氢且另一个为烷基、R⁵为卤素特别是氟、R⁵相对于Y基存在于两者的邻位(即，相对于X基两者的间位)、n为2、且R¹～R⁴的1个为包含放射性同位素的基(例如，[¹¹C]烷基(优选¹¹CH₃)、[¹¹C]烯基、或[¹¹C]炔基、或者¹⁸F)。

若列举包含放射性同位素的化合物的具体例，则有以下化合物：

[表2]

(3.制造方法及中间物)

(合成例1)

R²为烷基、烯基或炔基的式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物例如可通过使下述式(II)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物：

[化4]

(式中，A、X、Y、Z、R¹、R³、R⁴、R⁵、及n和在式(I)的化合物中所定义的相同)和X¹-R²(式中，R²为烷基、烯基或炔基，X¹为卤素)进行反应而制造。在一实施形态中，式(I)及式(II)中的R³及R⁴均为氢。在一实施形态中，R²为[¹¹C]烷基、[¹¹C]烯基、或[¹¹C]炔基，优选R²为[¹¹C]烷基特别是¹¹CH₃。在一实施形态中，X¹为I。若列举式(II)的化合物的具体例，则有2-[2,6-二氟-4-({2-[(苯磺酰基)胺基]乙基}硫)苯氧基]乙酰胺(PEPA)。

该反应可在二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃、乙腈、丙酮或二甲基亚砜等极性非质子性溶剂中进行。另外，该反应优选使用NaOH等碱在碱性条件下进行。反应温度优选室温～回流温度，特别是60～100℃，更优选80℃。反应时间为1分钟～10分钟，特别是5分钟。

由于放射性同位素的较短的半衰期，PET探针通常必须在较短的时间内且以高产率进行制造。该反应由于是在较短的时间内定量地进行，故而适合于PET探针的制造。

本发明者等人发现：式(II)的化合物和X¹-R²的反应由式(II)的化合物的和A基邻接的NH基定量地引起。因此，即使R³及R⁴为氢，也能够在不使用保护基的情况下只将该NH基转换为N-R²基。

式(II)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物可用作用以制造R²为烷基、烯基或炔基的式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物的中间物。另外，式(II)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物能够用作用以制造R²为[¹¹C]烷基、[¹¹C]烯基、或[¹¹C]炔基的经放射性标记的式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物的中间物。

(合成例2)

R¹为烷基、烯基、或炔基的式(I)的化合物、或其医药上可容许的盐或者溶剂合物例如可通过使下述式(III)的化合物、或其医药上可容许的盐或者溶剂合物：

[化5]

(式中，A、X、Y、Z、R²、R³、R⁴、R⁵、及n和上述所定义的相同，R^a分别独立，为烷基、烯基、或炔基)和X¹-R¹(式中，R¹和上述所定义的相同，X¹为卤素)进行反应而制造。在一实施形态中，R^a全部为正丁基。在一实施形态中，R¹为[¹¹C]烷基、[¹¹C]烯基、或[¹¹C]炔基，优选R¹为[¹¹C]烷基特别是¹¹CH₃。在一实施形态中，X¹为I。

式(III)的化合物的具体例为如下。

[表3]

该反应可在钯触媒、膦配体、碳酸盐及卤化铜的存在下进行。该钯触媒例如有三(二亚苄基丙酮)二钯等。另外，该膦配体例如有三(邻甲苯基)膦或(二-叔丁基)甲基膦等。该碳酸盐有K₂CO₃等。该卤化铜有CuCl等。该反应可在二甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃、乙腈、丙酮或二甲基亚砜等极性非质子性溶剂中进行。反应温度优选室温～回流温度特别是60～100℃，更优选80℃。反应时间为1分钟～10分钟，特别是5分钟。

PET探针通常由于放射性同位素的较短的半衰期而必须以较短的时间且以高产率进行制造。该反应由于是以较短的时间定量地进行，故而适合于PET探针的制造。

式(III)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物可用作用以制造R¹为烷基、烯基、或炔基的式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物的中间物。另外，式(III)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物可用作用以制造R¹为[¹¹C]烷基、[¹¹C]烯基、或[¹¹C]炔基的进行过放射性标记的式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物的中间物。

式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物也能够利用下述实施例所示的方法而制造。

(4.使用)

式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物能够和AMPA受体特异性结合。因此，式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物能够使用于AMPA受体的成像。该化合物特别能够用作分子探针例如PET探针。

关于成像，包含分子成像，例如正电子发射断层摄影法(Positron EmissionTomography，PET)、多光子成像法、双光子成像法、近红外萤光成像法、放射摄影术(autoradiography)、及单光子发射电脑断层扫描摄影术(Single photon emissioncomputed tomography，SPECT)等。优选成像为PET成像。

本发明提供一种包含式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物的用以使AMPA受体成像的组合物。该组合物可包含医药上可容许的载体。关于医药上可容许的载体，并无特别限制，例如有：杀菌水、盐水、生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)、氯化钠注射液、林葛尔氏注射液、等张性葡萄糖注射液、无菌水注射液、葡萄糖、及乳酸林葛尔氏注射液等。

该组合物中的式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物、及医药上可容许的载体的含量并无特别限制，该等可由所使用的化合物的种类；所投予的哺乳动物的年龄、体重、健康状态、性别及食物内容；投予的次数、及投予路径；治疗时间；同时使用的其他药剂等各种因素而决定。式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物的含量只要为能够使AMPA受体成像的量，则并无特别限制。该组合物优选以能够投予式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物的方式进行制备。关于医药上可容许的载体的含量，例如可设为该组合物的1～99重量％的量。

另外，本发明提供一种用于AMPA受体的成像中的用途的式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物。此外，本发明提供一种用于使AMPA受体成像的药剂的制造中的式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物的用途。

此外，本发明提供一种用以使AMPA受体成像的方法，该方法包含将有效量的式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物投予到哺乳动物。哺乳动物例如包含大鼠、小鼠、豚鼠、或仓鼠等。投予方法并无特别限制，例如有非经口投予、静脉内投予、或腹腔内投予。优选静脉内投予。关于投予量，只要为能够使AMPA受体成像的量，则并无特别限制。

此外，本发明提供一种包含式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物的用以使AMPA受体成像的试剂盒。另外，本发明提供一种用以制造式(I)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物的中间物，例如式(II)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物；及/或包含式(III)的化合物或其医药上可容许的盐或者溶剂合物的用以使AMPA受体成像的试剂盒。该试剂盒可进一步包含对该化合物的投予量、投予方法、使用方法、保管方法、及/或用以使AMPA受体成像的方法进行指示的指示书。该试剂盒可进一步包含放射性标记化用试剂，例如卤化[¹¹C]烷基、卤化[¹¹C]烯基、或卤化[¹¹C]炔基等。

此外，本发明提供一种AMPA受体的成像方法，该方法具有对自投予了式(I)的化合物、或其医药上可容许的盐或者溶剂合物的被检者的脑发出的放射线进行检测的步骤。

[实施例]

(5.实施例)

以下记载实施例。下述实施例是为了加深关于申请专利范围的理解而记载的，并非意在对申请专利范围进行限定。

(实施例1)

(K-1及K-2的合成)

按照下述方案，而合成2-[2,6-二氟-4-({2-[(苯磺酰基)胺基]乙基}硫)苯氧基]乙酰胺(K-1，PEPA)及{4-[2-(苯磺酰基-甲基-胺基)-乙硫基]-2,6-二氟-苯氧基}-乙酰胺(K-2)。

关于各化合物的¹H>

[化6]

步骤(i)：(2,6-二氟-苯氧基)-乙酸甲酯(2)的合成

[化7]

在2,6-二氟-苯酚(1)(5.00g，38.5mmol)的丙酮溶液(75mL)中加入K₂CO₃(8.40g，60.7mmol)，并在10分钟后在反应溶液中加入溴乙酸甲酯(5.80g，38.5mmol)。将该反应溶液在室温下搅拌一晩。在反应结束后，将该反应混合液注入浓盐酸(20mL)和冰水(200ml)的混合液中，利用EtOAc(100mL×3)进行萃取，并利用水(50mL×3)及盐水(100mL×2)清洗有机层，利用Na₂SO₄使其干燥并进行过滤。其后，在真空下进行浓缩，以黄色油的形式而获得化合物(2)(7.50g，97％)。

¹H>3):δ3.78(s,3H),4.74(s,2H),6.86-6.99(m,3H).

步骤(ii)：(4-氯磺酰基-2,6-二氟-苯氧基)-乙酸甲酯(3)的合成

[化8]

在(2,6-二氟-苯氧基)-乙酸甲酯(2)(5.00g，24.7mmol)的DCM(dichloromethane，二氯甲烷)溶液中加入氯磺酸(17.2g，24.7mmol)，在冰浴下滴加加入，将反应溶液加热到45℃，并搅拌1.5小时。在反应结束后，将该反应混合液利用50mL的冰水进行骤冷，分离有机层，且利用水(300mL×3)进行清洗。利用Na₂SO₄使其干燥并进行过滤，其后，在真空下进行浓缩，由此以黄色油的形式而获得化合物(3)(5.50g，74％)。

¹H>3):δ3.81(s,3H),4.96(s,2H),7.61(s,1H),7.64(s,1H).

步骤(iii)：(2,6-二氟-4-巯基-苯氧基)-乙酸甲酯(4)的合成

[化9]

在(4-氯磺酰基-2,6-二氟-苯氧基)-乙酸甲酯(3)(5.50g，18.3mmol)、SnCl₂(14.5g，64.2mmol)、及甲醇(50mL)的混合液中滴加加入浓盐酸(25mL)。将反应混合液加热到回流温度，并搅拌2小时。在冷却后，将该反应混合液注入冰水(100mL)中，利用DCM(100mL×3)进行萃取。利用水(100mL×3)及盐水(100mL×2)清洗有机层，并利用Na₂SO₄使其干燥并进行过滤，其后，在真空下进行浓缩，由此以黄色油的形式而获得化合物(4)(3.30g，77％)。

¹H>3):δ3.52(s,1H),3.77(s,3H),4.71(s,2H),6.83(s,1H),6.86(s,1H).

步骤(iv)：[4-(2-苯磺酰基胺基-乙硫基)-2,6-二氟-苯氧基]-乙酸甲酯(5)的合成

[化10]

将(2,6-二氟-4-巯基-苯氧基)-乙酸甲酯(4)(1.10g，4.7mmol)、碳酸钾(778mg，5.6mmol)、及丙酮(15mL)的混合液在N₂下在室温下搅拌20分钟。在该反应溶液中加入N-(2-溴-乙基)-苯磺酰胺(9)(1.30g，4.90mmol)，并将该反应溶液在室温下搅拌一晩。在反应结束后，将该反应溶液注入30mL的2N>2SO₄使其干燥并进行过滤，其后，在真空下进行浓缩，由此获得残渣。利用矽胶管柱层析法(PE(petroleum>

¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ2.95(t,J＝6.6Hz,2H),3.12(q,J＝6.3Hz,2H),3.78(s,3H),4.72(s,2H),5.20(t,J＝6.0Hz,1H),6.76-6.83(m,2H),7.47-7.60(m,3H),7.82-7.84(m,2H).

步骤(v)：{4-[2-(苯磺酰基-甲基-胺基)-乙硫基]-2,6-二氟-苯氧基}-乙酸甲酯(6)的合成

[化11]

在[4-(2-苯磺酰基胺基-乙硫基)-2,6-二氟-苯氧基]-乙酸甲酯(5)(300mg，0.72mmol)及K₂CO₃(397mg，2.88mmol)的10mL>2SO₄使其干燥并进行过滤，其后，在真空下进行浓缩，由此以黄色油的形式而获得化合物(6)(285mg，92％)。

¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ2.81(s,3H),3.04-3.09(m,2H),3.19-3.24(m,2H),3.79(s,3H),4.74(s,2H),6.90-6.94(m,2H),7.50-7.60(m,3H),7.74-7.77(m,2H).

步骤(vi)：{4-[2-(苯磺酰基-甲基-胺基)-乙硫基]-2,6-二氟-苯氧基}-乙酰胺(K-2)的合成

[化12]

将{4-[2-(苯磺酰基-甲基-胺基)-乙硫基]-2,6-二氟-苯氧基}-乙酸甲酯(6)(40.0mg，0.09mmol)及13mL的4N MeOH/NH₃的混合液在室温下搅拌18小时。在反应结束后，将该反应混合液在真空下进行浓缩，由此获得残渣。利用制备型HPLC(high>

¹HNMR(300MHz,CDCl3):δ2.82(s,3H),3.08-3.13(m,2H),3.20-3.26(m,2H),4.58(s,2H),6.93-6.99(m,2H),7.50-7.63(m,3H),7.75-7.78(m,2H).

步骤(vii)：2-[2,6-二氟-4-({2-[(苯磺酰基)胺基]乙基}硫)苯氧基]乙酰胺(K-1)的合成

[化13]

将[4-(2-苯磺酰基胺基-乙硫基)-2,6-二氟-苯氧基]-乙酸甲酯(5)(200mg，0.48mmol)及10mL的4N MeOH/NH₃的混合液在室温下搅拌18小时。在反应结束后，将该反应混合液在真空下进行浓缩，由此获得残渣。利用制备型HPLC将该残渣进行纯化，以白色固体的形式而获得化合物K-1(110mg，57％)。

¹HNMR(300MHz,CDCl₃+D₂O):δ2.97-3.02(m,2H),3.11-3.16(m,2H),4.56(s,2H),6.82-6.90(m,2H),7.48-7.61(m,3H),7.82-7.87(m,2H).

步骤(viii)：N-(2-溴-乙基)-苯磺酰胺(9)的合成

[化14]

在苯磺酰基氯(7)(3.00g，17.0mmol)及2-溴乙胺氢溴酸盐(8)(3.80g，18.7mmol)的DCM(30mL)溶液中，在冰浴下加入DIPEA(diisopropylethylamine，二异丙基乙胺)(4.80g，37.4mmol)。其后，将反应溶液在相同温度下搅拌1.5小时。在反应结束后，将该反应溶液利用20mL的水进行稀释，并利用EtOAc(30mL×3)进行萃取。利用水(30mL×3)及盐水(20mL×2)清洗有机层，并利用Na₂SO₄使其干燥并进行过滤，其后，在真空下进行浓缩，由此以白色固体的形式而获得化合物(9)(4.40g，98％)。

¹HNMR(300MHz,CDCl₃):δ3.36-3.39(m,4H),5.09(s,1H),7.50-7.63(s,3H),7.87-7.89(s,2H).

(实施例2)

(M-1、M-2及M-3的合成)

按照下述方案，而合成2-[4-(2-苯磺酰基胺基-乙硫基)-2,6-二氟-苯氧基]-N-甲基-乙酰胺(M-1)、2-{2,6-二氟-4-[2-(4-氟-苯磺酰基胺基)-乙硫基]-苯氧基}-乙酰胺(M-2)、及2-{2,6-二氟-4-[2-(4-甲基-苯磺酰基胺基)-乙硫基]-苯氧基}-乙酰胺(M-3)。

关于各化合物的¹H>3的水)；梯度(B％)：如实施例所示。

[化15]

步骤(i)：3,5-二氟-4-羟基-苯磺酰基氯(10)的合成

[化16]

在化合物(1)(5.0g)的DCM(50mL)溶液中滴加加入氯磺酸(15mL)。将反应混合液在25℃下搅拌1小时。TLC(石油醚/EtOAc：20/1)表示反应已完成。其后，将该溶液注入碎冰中。将有机层分离，并使其通过矽藻土进行过滤。使滤液干燥，并在真空下进行蒸馏去除，而以黄色油的形式而获得化合物(10)：5g(57％)。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ6.30(s,1H),7.66-7.68(m,2H).

步骤(ii)：2,6-二氟-4-巯基-苯酚(11)的合成

[化17]

在三苯基膦(3.4g，13.1mmol)及DMF(0.1mL)的DCM(3mL)溶液中，在氮气下在0℃下滴加加入化合物(10)(1.0g，4.3mmol)的DCM(4mL)溶液。将反应混合液在25℃下搅拌2小时。其后，在该混合液中加入1N HCl调整为pH值＝3，并利用EA进行萃取。利用硫酸钠使有机层干燥，将溶剂去除，以黄色油的形式而获得粗化合物(11)。

步骤(iii)：2-[2-(3,5-二氟-4-羟基-苯基硫基)-乙基]-异吲哚-1,3-二酮(12)的合成

[化18]

在粗化合物(11)(14g，86mmol)的DMF(100mL)溶液中，加入2-(2-溴-乙基)-异吲哚-1,3-二酮(13.2g，51.8mmol)及K₂CO₃(23.8g，172.4mmol)。将混合液在25℃下搅拌一晩。其后，在该混合液中加入1N>

¹H-NMR(400MHz,DMSO_d6):δ3.20-3.23(t,2H),3.75-3.79(t,2H),7.08-7.10(d,2H),7.84(s,4H).

步骤(iv)：{4-[2-(1,3-二侧氧基-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-乙硫基]-2,6-二氟-苯氧基}-乙酸乙酯(13)的合成

[化19]

在将化合物(12)(5.0g，15mmol)溶解到DMF(30mL)中而成的溶液中，加入3-溴-丙酸乙酯(2.5g，15mmol)及K₂CO₃(3.0g，22.5mmol)。将混合液在25℃下搅拌一晩。其后，利用EA对该混合液进行萃取。利用硫酸钠使有机层干燥，将溶剂去除，以白色固体的形式而获得化合物(13)(6g，97％)。

¹H-NMR(400MHz,CDCl₃):δ1.21-1.24(t,3H),3.11-3.14(t,2H),3.84-3.88(t,2H),4.18-4.20(d,2H),4.61(s,2H),6.91-6.94(d,2H),7.66-7.68(m,2H),7.77-7.79(m,2H).

步骤(v)：2-{4-[2-(1,3-二侧氧基-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-乙硫基]-2,6-二氟-苯氧基}-N-甲基-乙酰胺(14)的合成

[化20]

将化合物(13)(0.5g，1.2mmol)的甲基胺醇溶液(10mL)在100℃下搅拌30分钟。其后，将混合液进行浓缩，以黄色油的形式而获得粗化合物(14)(1g)。

步骤(vi)：2-[4-(2-胺基-乙硫基)-2,6-二氟-苯氧基]-N-甲基-乙酰胺(15)的合成

[化21]

在90℃下将肼水合物(0.25g，5mmol)加入粗化合物(14)(1g，2.5mmol)的EtOH(10mL)溶液中。将溶液加热到90℃，并搅拌30分钟，其后，冷却到室温。将产物过滤，并利用EtOH进行清洗。利用硫酸钠使有机层干燥，并进行浓缩，以黄色油的形式而获得粗化合物(15)(0.5g)。

步骤(vii)：2-[4-(2-苯磺酰基胺基-乙硫基)-2,6-二氟-苯氧基]-N-甲基-乙酰胺(M-1)的合成

[化22]

将苯磺酰基氯(0.4g，2.2mmol)及三乙基胺(0.2g，2.2mmol)加入粗化合物(15)(0.5g，1.8mmol)的DCM(10mL)溶液中。其后，将混合液在25℃下搅拌1小时，并利用EA进行萃取。利用硫酸钠使有机层干燥，并进行浓缩。将残渣利用急速层析法进行纯化，以白色固体的形式而获得化合物(M-1)(20mg)。

¹H-NMR(400MHz,DMSO_d6):δ2.65-2.66(d,3H),2.91-2.94(t,2H),2.01-3.04(t,2H),4.50(s,2H),7.10-7.12(d,2H),7.57-7.65(m,3H),7.76-7.78(d,2H),7.92-7.95(t,1H),8.05(s,1H).

MS：m/z 417(M+1)⁺

LCMS[流动相：90％水(0.1％NH₄OH)及10％CH₃CN更换成5％水(0.1％NH₄OH)及95％CH₃CN；6.0分钟；最后在该等条件下0.5分钟]纯度97.4％，Rt＝3.341分钟；MS>+).

步骤(viii)：2-{4-[2-(1,3-二侧氧基-1,3-二氢-异吲哚-2-基)-乙硫基]-2,6-二氟-苯氧基}-乙酰胺(16)的合成

[化23]

将化合物(13)(5.0g，11.8mmol)的NH₃/EtOH(100mL)溶液在25℃下搅拌2小时。其后，将该溶液进行浓缩，以黄色油的形式而获得粗化合物(16)(6.0g)。

步骤(ix)：2-[4-(2-胺基-乙硫基)-2,6-二氟-苯氧基]-乙酰胺(17)的合成

[化24]

在90℃下将肼水合物(1.5g，30mmol)加入粗化合物(16)(6.0g，15.3mmol)的EtOH(50mL)溶液中。将溶液加热到90℃，并搅拌30分钟，其后，冷却到室温。将产物过滤，并利用EtOH进行清洗。利用硫酸钠使有机层干燥，并进行浓缩，以黄色油的形式而获得粗化合物(17)(4.0g)。

步骤(x)：2-{2,6-二氟-4-[2-(4-氟-苯磺酰基胺基)-乙硫基]-苯氧基}-乙酰胺(M-2)的合成

[化25]

将4-氟-苯磺酰基氯(0.4g，2.3mmol)及三乙基胺(0.2g，2.2mmol)加入粗化合物17(0.5g，1.9mmol)的DMF(10mL)溶液中。其后，将混合液在25℃下搅拌1小时，并利用EA进行萃取。利用硫酸钠使有机层干燥，并进行浓缩。将残渣利用急速层析法进行纯化，以白色固体的形式而获得化合物(M-2)(20mg)。

¹H-NMR(400MHz,DMSO_d6):δ2.92-2.95(t,2H),3.01-3.04(t,2H),4.45(s,2H),7.09-7.11(d,2H),7.40-7.44(m,3H),7.47(s,1H),7.81-7.85(m,2H),7.95-7.98(t,1H).

MS：m/z 421(M+1)⁺

LCMS[流动相：90％水(0.1％NH₄OH)及10％CH₃CN更换成5％水(0.1％NH₄OH)及95％CH₃CN，6分钟，最后在该等条件下0.5分钟]纯度95.1％，Rt＝3.284分钟；MS>+).

步骤(xi)：2-{2,6-二氟-4-[2-(4-甲基-苯磺酰基胺基)-乙硫基]-苯氧基}-乙酰胺(M-3)的合成

[化26]

将4-甲基-苯磺酰基氯(0.5g，2.3mmol)及三乙基胺(0.2g，2.2mmol)加入粗化合物(17)(0.5g，1.9mmol)的DMF(10mL)溶液中。其后，将混合液在25℃下搅拌1小时，并利用EA进行萃取。利用硫酸钠使有机层干燥，并进行浓缩。将残渣利用急速层析法进行纯化，以白色固体的形式而获得化合物(M-3)(20mg)。

¹H-NMR(400MHz,DMSO_d6):δ2.38(s,3H),2.88-2.91(t,2H),2.99-3.02(t,2H),4.49(s,2H),7.08-7.10(d,2H),7.37-7.48(m,4H),7.64-7.66(d,2H),7.81-7.84(t,1H).

MS：m/z 417(M+1)⁺

LCMS[流动相：90％水(0.1％NH₄OH)及10％CH₃CN更换成5％水(0.1％NH₄OH)及95％CH₃CN，6.0分钟，最后在该等条件下0.5分钟]纯度96.6％，Rt＝3.365分钟；MS>+).

(实施例3)

(M-3pre的合成)

按照下述方案，而合成2-(2,6-二氟-4-((2-(4-(三丁基甲锡烷基)苯基磺酰胺)乙基)硫)苯氧基)乙酰胺(M-3pre)。

关于各化合物的¹H>

[化27]

步骤(i)：2-(2,6-二氟苯氧基)乙酸乙酯(19)的合成

[化28]

将化合物(1)(39.0g，0.30mol)、K₂CO₃(62.0g，0.45mol)、化合物(18)(50.1g，0.30mol)、及丙酮(200mL)的混合液在室温下搅拌约16小时。将反应混合液注入3％HCl中，并利用乙酸乙酯(90mL×3)进行萃取。利用无水硫酸钠使合并的有机层干燥并进行过滤、浓缩。将残渣利用矽胶管柱层析法(PE：EA＝10：1)进行纯化，而获得化合物(19)(57g，87％)。

¹H>3,300MHz):δ1.19(t,J＝7.2Hz,3H),4.17(q,J＝7.2Hz,2H),4.82(s,2H),7.06-7.13(m,3H).

步骤(ii)：2-(4-(氯磺酰基)-2,6-二氟苯氧基)乙酸乙酯(20)的合成

[化29]

在化合物(19)(50g，0.23mol)的DCM(180mL)溶液中，在35℃下加入ClSO₃H(106mL，1.38mol)。将反应混合液加热至回流温度，并搅拌约1.5小时。其后，注入冰中。将有机层分离，利用无水硫酸钠使其干燥并进行浓缩，而获得化合物20(37g，50％)。

¹H>3,300MHz):δ1.18(t,J＝6.9Hz,3H),4.16(q,J＝6.9Hz,2H),4.83(s,2H),7.18-7.21(m,2H).

步骤(iii)：2-(2,6-二氟-4-巯基苯氧基)乙酸甲酯(21)的合成

[化30]

将化合物(20)(25.0g，0.08mol)、SnCl₂(63.3g，0.28mol)、浓盐酸(46.6mL，0.56mol)、及MeOH(333mL)的混合液加热到回流温度，并搅拌约1.5小时。其后，将反应混合液注入冰中，并利用甲苯进行萃取。利用12％HCl将有机层清洗3次，并利用无水硫酸钠使其干燥并进行浓缩。将残渣利用矽胶管柱层析法(PE：EA＝2：1)进行纯化，而获得化合物(21)(14g，75％)。

¹H>3,300MHz):δ3.52(s,1H),3.79(s,3H),4.72(s,2H),6.88(d,J＝6.3Hz,2H).

步骤(iv)：4-溴-N-(2-溴乙基)苯磺酰胺(24)的合成

[化31]

将化合物(23)(1.35g，11.0mmol)加入化合物(22)(2.54g，10.0mmol)的DCM(40mL)溶液中，继而，加入TEA(Tetraethylammonium，四乙基铵)(1.52g，15.0mmol)。其后，将反应混合液在室温下搅拌约3小时，并利用水进行稀释。将该溶液利用DCM(80mL×3)进行萃取。利用盐水清洗有机层，并利用无水硫酸钠使干燥并进行浓缩。将粗产物利用矽胶管柱层析法(PE：EA＝5：1)进行纯化，而获得化合物(24)(2.45g，72％)。

¹H>6,300MHz):δ3.12-3.16(m,2H),3.43(t,J＝3.6Hz,2H),7.69-7.73(m,2H),7.79-7.82(m,2H),8.13(t,J＝3.9Hz,1H).

步骤(v)：2-(4-((2-(4-溴苯基磺酰胺)乙基)硫)-2,6-二氟苯氧基)乙酸甲酯(25)的合成

[化32]

将化合物(21)(1.25g，5.36mmol)、K₂CO₃(905mg，6.55mmol)、化合物(24)(1.88g，5.50mmol)、及丙酮(50mL)的混合液在室温下搅拌约16小时。将反应混合液注入3％HCl中，并利用乙酸乙酯(90mL×3)进行萃取。利用无水硫酸钠使有机层干燥并进行浓缩。将粗残渣利用矽胶管柱层析法(PE：EA＝5：1)进行纯化，而获得化合物(25)(2g，76％)。

¹H>3,300MHz):δ2.94-2.98(m,2H),3.08-3.14(m,2H),3.77(s,3H),4.73(s,2H),5.33(t,J＝6.0Hz,1H),6.78-6.84(m,2H),7.61-7.70(m,4H).

步骤(vi)：2-(4-((2-(4-溴苯基磺酰胺)乙基)硫)-2,6-二氟苯氧基)乙酰胺(26)的合成

[化33]

将化合物(25)(3.00g，6.06mmol)及2M NH₃/MeOH(150mL，300mmol)的混合液在室温下搅拌约16小时。利用过滤对所获得的沈淀物进行回收，而获得化合物(26)(2.3g，80％)。

¹H>6,400MHz):δ2.93-2.96(m,2H),3.00-3.03(m,2H),4.48(s,2H),7.10(d,J＝9.2Hz,2H),7.40-7.45(m,2H),7.70(d,J＝8.4Hz,2H),7.80(d,J＝8.4Hz,2H),8.01(br>

步骤(vii)：2-(2,6-二氟-4-((2-(4-(三丁基甲锡烷基)苯基磺酰胺)乙基)硫)苯氧基)乙酰胺(M-3pre)的合成

[化34]

在化合物(26)(670mg，1.39mmol)的二甲苯(50mL)溶液中加入双(三丁基锡)(0.87mL，1.81mmol)及Pd(PPh₃)₄(40mg)。将反应混合液在N₂下在120℃下搅拌约1小时。其后，将该反应混合液在真空下进行浓缩，并将残渣利用矽胶管柱层析法(PE：EA＝3：1)进行纯化，以黄色油的形式而获得化合物(M-3pre)(180mg，18％)。

¹H>3OD,300MHz):δ0.94(t,J＝7.2Hz,9H),1.12-1.17(m,5H),1.29-1.39(m,8H),1.52-1.60(m,5H),2.98-3.06(m,4H),4.55(s,2H),7.01(d,J＝9.0Hz,2H),7.68(d,J＝8.1Hz,2H),7.77(d,J＝8.1Hz,2H)；LCMS[流动相：30％水(0.02％NH₄OAc)及70％CH₃CN更换成5％水(0.02％NH₄OAc)及95％CH₃CN，6分钟，最后在该等条件下0.5分钟]纯度＞95％，Rt＝4.259分；MS>+).

(实施例4)

(放射性标记化K-2的合成)

以下述方式合成放射性标记化K-2。

[化35]

将PEPA 1mg(ca 2.5μmol)溶解到DMF(0.3mL)中，添加0.5N-NaOH aq(7μL)并进行混合，装入到辐射室(hot cell)内的反应容器中。利用常规方法捕获[¹¹C]碘甲烷后，使其在80℃下反应5分钟。冷却到室温附近，利用500μl的LC溶剂(CH₃CN：H₂O＝1：1)进行稀释，进行LC分离。在管柱中使用CapcellPak>

使用HPLC，对放射性标记化K-2和非标记K-2进行比较。HPLC分析是在管柱中使用CapcellPak UG-80(4.6×250)(资生堂，日本)，以流速1.0ml/min进行展开，检测是使用UV254nm及RI进行。非标记K-2(UV检测)及放射性标记化K-2(RI检测)在保持时间8分钟时呈现出同一波峰。其表示两者为同一物质，且能够制造放射性标记化K-2。

可知，进行过反应的碘甲烷会和100％PEPA的磺酰胺结合，且可知放射性标记化K-2的合成极为简单，且呈现出较高的产率。

(实施例5)

(放射性标记化M-3的合成)

称取Pd₂(dba)₃(1.74mg)、氯化亚铜(1.7mg)、碳酸钾(2.25mg)到1mL的玻璃瓶中，在氮气氛围下将P(o-tol)₃(1.7mg)的DMF(300μL)溶液加入到该混合物中。在室温下搅拌约5分钟左右后将本溶液移到标记用反应容器中。在冷却下捕获[¹¹C]CH₃I，使放射能饱和，其后，加入原料的三丁基锡体(preM-3)(1.6mg)的DMF溶液(300μL)，并使其在80℃下反应约5分钟。使反应混合物通过PTFE滤波器将固形物去除后进行HPLC分离，分取约7分钟附近的RI波峰部分进行浓缩并进行配制。

Pd₂(dba)₃：三(二亚苄基丙酮)二钯

P(o-tolyl)₃：三(邻甲苯基)膦

(实施例6)

(生物学实施例)

(AMPA受体结合化合物的制备及投予)

将在LC-MS/MS实验中所合成的所有化合物以成为2.5mM的浓度的方式溶解到100％DMSO中，并于即将投予前利用生理盐水进行稀释(PEPA(1.2pmol/g)、M-1(12pmol/g)、K-2(12pmol/g)、M-3(60pmol/g)、及M-2(240pmol/g))，经静脉投予。在电生理学实验中，将PEPA及K-2以成为150mM的浓度的方式溶解到100％DMSO中，并在即将实验前利用作为回流液的ACSF(Artificial cerebrospinal fluid，人工脑脊液)以成为150μM的浓度的方式进行稀释而使用。生物化学实验及PET的阻断实验中，将K-2以成为2.5mM及25mM的浓度的方式溶解到50％DMSO中，以1μl/体重(g)的投予量分别以成为0.5mg/kg及5mg/kg的方式对大鼠进行经静脉投予。

(实验动物)

所有动物实验接受了横浜市立大学及放射线医学综合研究所的动物实验委员会的审议及批准。

大鼠是使用6～10周龄的公成体Sprague-Dawley大鼠(SD大鼠)(Charles River，日本)。

LC-MS/MS实验及生物化学实验是通过异氟醚的吸入使大鼠入眠后，使用专用的气化器在1.5％的浓度下维持麻醉而进行。以成为1μl/体重(g)的投予量的方式对化合物进行调整。将大鼠的颈部切开使颈静脉露出，其后，使用胰岛素注射器(TERUMO，日本)在直视下将化合物自颈静脉投予。在投予化合物后，将大鼠在麻醉下维持15分钟，其后，将脑取出。在LC-MS/MS实验中，自所取出的全脑使用Brain matrix(ASI instruments，美国)以前后2mm的厚度回收海马区域，并测量组织重量，其后，放入到1.5ml的锥形管。在生物化学实验中，自所取出的全脑使用Vibratome(VT1000；Leica，德国)制作包含海马的厚度400μm的急性脑切片。

(LC-MS/MS实验)

作为测定条件的事先研究，使用海马组织逐个化合物地决定最佳的稀释溶剂及稀释倍率(表4)。

[表4]

投予化合物的调整及回收组织的调整条件

*acn乙腈、FA甲酸、MeOH甲醇

样品回收后，将预设量的经事先研究的溶剂加入到锥形管。使用均质机杵(Homogenizer pestle)进行悬浮，并使用手持音波振动器(UR-20P；TOMY SEIKO，日本)充分地进行破碎。其后，进行涡旋，分别在预设的条件下进行离心后，回收上清液。上清液在即将在LC-MS/MS的测定前利用预设的倍率进行稀释。海马组织中所包含的化合物的浓度是使用液相层析法及四极质谱分析装置(UPLC-MS/MS，Aquity UPLC I-Class System，Xevo TQ-S，日本waters公司，日本)进行测定。UPLC是使用2.1mm i.d.×100mm 1.8μm的管柱(HSS T3，日本Waters，日本)，对各化合物的流动相条件进行事先研究(表5)，在其条件下对化合物的浓度进行测定。

[表5]

样品在LC/MS-MS中的测定条件及流动相的组成、测定条件

*asn乙腈、FA甲酸、AA乙酸铵

在质量分析中，逐个化合物地预先使用高浓度化合物制定MS方法(表6)，按照其协定(protocol)将母离子分解成子离子，并使用MRM(multiple reaction monitoring，质谱多反应监测)方式对化合物的浓度进行测定。另外，浓度测定中使用的校正曲线是对将6～10周龄的药剂非投予大鼠在异氟醚麻醉下断头所回收的海马组织以已知的浓度加入各化合物而制作的。

[表6]

MS中的各化合物的测定条件

(化合物的组织集积率的计算)

逐个化合物地进行测定条件的最佳化，结果得知：对活体的投予量或测定时的稀释倍率不同。因此，为了展现所投予的化合物的几％集积到海马，使用以下计算式算出％ID/g(percentage injected dose per gram tissue，每克组织的注射剂量百分比)：

％ID/g＝测定值(pM)×稀释倍率×10/化合物的投予浓度(pmol/g)×体重(g)/组织重量(mg)

将5种已知会和AMPA受体结合的化合物自尾静脉对大鼠进行投予，在投予15分后回收海马组织，并对此处所累积的化合物浓度进行测定，结果为PEPA的集积最高。根据该结果，提示了PEPA自血液向脑的移行率最高(图1)。

对60个目标受体网罗性地研究了作为PEPA的甲基赋予体的K-2对自身的结合区域以外的受体进行结合的能力。其结果为，无其他可结合的受体，提示了PEPA的特异性较高。

[表7]

(电生理学实验)

使用7～8周龄的雄性SD大鼠。在利用异氟醚的麻醉下进行断头，使用Vibratome(VT1000；Leica，德国)而制作包含海马的厚度400μm的急性脑切片。将该切片在ACSF中在室温下静置60分钟，其后，利用全细胞记录法测量AMPA电流。在以3ml/min的速度使ACSF回流的条件下投予100μM苦毒素及100μM DL-APV，只单离出AMPA电流进行测量。

记录电极是置于CA1的锥体细胞，刺激电极是置于距记录细胞100～200μm的薛佛氏纤维(Schaffer fiber)上。全细胞记录是将细胞膜电位固定到-80mV而进行，并以30秒一次的频度施加100微秒的刺激而进行。记录5分钟基底状态的AMPA电流，其后在加入了PEPA或K-2的ACSF中回流15分钟，其后，在不包含PEPA或K-2的回流液下记录AMPA电流30分钟。

在脑切片的静置时及回流时，利用95％O₂/5％CO₂使常规ACSF饱和而使用。ACSF的组成如下所述：119mM>2、1.5mM>4、26mM>3、1mMNaH₂PO₄。记录电极是使用玻璃管(GD-1.5；成茂科学器械研究所，日本)以前端电阻成为3-5MOhm的方式进行制作而使用。记录电极内填充液的组成如下所述：115mM>4、20mMCsCl、10mM>2、4mM>2ATP、0.4mM>3GTP、10mM磷酸肌酸钠(Na-phosphocreatinine)、0.6mM>

(生物学实验)

海马膜表面馏分-使用7～8周龄的雄性SD大鼠。在利用异氟醚的麻醉下经静脉投予K-2或50％DMSO，并在15分钟后进行断头。使用Vibratome制作包含海马的厚度400μm的急性脑切片，并将该切片在室温的ACSF下静置60分钟。继而，为了使膜表面蛋白质生物素化，自急性脑切片只取出海马切片，并将该切片在包含2.0mg/ml的生物素(EZ Link Sulfo-NHS-Biotin；Thermo Scientific，美国)的ACSF内在4℃下缓慢地搅拌45分钟。在生物素化后，将该切片利用1ml的冰浴冷却TBS(Tetrapropylenebenzene sulfonate，四丙烯本磺酸盐)在pH值7.5下冲洗5次，并在150μl的均质缓冲液(Homogenization buffer)(150mMNaCl、0.5mM EDTA、0.1mM EGTA、1mM HEPES、20％Triton X100)内利用杵使其悬浮。此外，加入150μl的均质化缓冲液，使用手持音波振动器进行超音波破碎。其后，以14,000×g在4℃下进行15分钟离心分离，并回收上清液(～300μl)。利用蛋白质定量进行上清液的蛋白质浓度的均一化，其后，将50μl的上清液和10μl的6×样品缓冲液进行混合，并在100℃下加热5分钟，回收总蛋白质馏分(total fraction)。另外，为了将经生物素化的表面蛋白质进行免疫沈淀，将150μl的剩余的上清液和150μl的NeutrAvidin琼脂糖树脂(Thermo Scientific，美国)进行混合，并在4℃下搅拌16小时。其后，以2,000×g在4℃下进行离心1分钟，将上清液废弃，将剩余的颗粒利用1000μl的IP(ImmunoPrecipitation，免疫沈降)缓冲液冲洗5次。继而，加入150μl的2×样品缓冲液，并加热5分钟，其后，回收上清液，而获得膜蛋白质馏分(surface fraction)。

定量使西方墨点转渍法(Western blot)-总蛋白质馏分及膜蛋白质馏分在聚丙烯酰胺凝胶(Mini-PROTEAN TGX precast Gel；Bio-rad，美国)中进行电泳，其后，转印到PVDF(polyvinylidenefluoride，聚偏二氟乙烯)膜。关于膜，通过利用阻断剂(Perfectblock；Mobitec，美国)/TBS-T(137mM NaCl、2.68mM KCl、25mM Tris、0.1％Triton-X、PH值7.6)制作而成的阻断溶液处理1小时。关于1次抗体，为了确认细胞内馏分未混入膜蛋白质馏分，使用Pan AMPA抗体/GluA2/3/4兔抗体(1：1000，cell signaling technology，美国)、及GAPDH抗体(1：1000，cell signaling technology)，以1：1000在阻断溶液中进行稀释，在室温下分别使其反应1及3小时。其后，利用TBS-T进行10分钟、3次清洗，其后，使其和抗兔2次抗体(1：1000；Jackson ImmunoResearch，美国)在室温下反应1小时。继而，利用TBS-T进行3次10分钟的清洗，并使用amersham ECL(GE Healthcare Japan，日本)，利用化学发光(Chemiluminescence)摄像装置(LAS4000mini；GE)对频带进行检测。利用Multi GaugeV3.0(FUJIFILM，日本)对所获得的频带的讯号强度进行定量分析。

(使用大鼠的体内PET摄像)

PET摄像使用microPET(Focus 220；Siemens Medical Solution)而进行。

使用大鼠的PET摄像实验：利用异氟醚(DS-pharma animal-health，日本)使大鼠入眠，其后，在1.5％的异氟醚浓度(空气2L/min)下维持麻醉，自尾静脉利用24G SURFLO留置针(TERUMO，日本)确保静脉路。将大鼠固定到PET摄像台，其后，在摄像前进行用以确认位置的放射摄像。其后，将50％DMSO或溶解到50％DMSO的K-2进行经静脉投予，在投予3分钟后，投予经放射性标记的K-2(约4MBq)。在PET摄像中，使用反馈型加温盘(BWT-100A；Bioresearch Center，日本)将体温维持在37±0.5℃。在摄像后，拔除静脉路并中止异氟醚投予，其后，将大鼠自PET摄像台取下，放回居住笼(home cage)。大鼠在摄像后1周在所摄像的房间进行饲养，其后，放回普通大鼠集体饲养室。

构成相加(Summation)图像，并利用0.5mm汉宁(Hanning)滤波器除去透印，重建动态图像。重建图像是使用PMOD图像分析软体(PMOD technologies)，和将包含纹状体、海马、小脑、脑干等多个区域的VOIs制作到模板MRI图像上而成的合并进行分析。用于定量的运算值为％SUV(％of standardized uptake value，标准摄取值百分比)，利用以下式求出：

％SUV＝由VOI所包围的各组织的放射线量(MBq)/所投予的放射线量(MBq)×体重(g)

(实验结果)

(AMPA受体识别化合物的特性评价)

为了评价所合成的化合物对AMPA受体的结合特性，使用电生理学及生物化学方法进行分析。使用利用成体大鼠所制作的急性海马切片，通过PEPA的15分钟投予，确认到AMPA电流显著地增加(2.4±0.13，自4组动物n＝4；p＝0.01vs基准)。另外，使用K-2进行相同的实验，K-2也确认到AMPA电流显著地增加(1.7±0.22，自4组动物n＝5；p＝0.01vs基准)(图2)。

继而，生物化学性地研究该AMPA电流的增加是依据何种机制。利用对活体投予了K-2的大鼠制作包含海马的脑切片，并利用生物素化法对呈现在细胞膜表面的AMPA受体进行定量。其结果为，通过投予5mg/kg的K-2，使AMPA受体向膜表面的移行得到促进(136％±14，自5组动物n＝5；p＝0.05vs 50％DMSO)。其另一方面，在相同动物中，对于AMPA受体的总量未确认到有变化(图3)。根据以上结果，可知K-2会使AMPA受体的表面呈现量急性地增加。

(在使用了AMPA受体识别化合物K-2的大鼠中的PET摄像)

由于已明确K-2会表现出对AMPA受体的结合，故而继而对大鼠投予放射性标记化K-2，并进行在体内的PET摄像。其结果为，在大鼠中，放射性标记化K-2呈现出极高的在脑内的吸收，且特异性地集积于包含海马、纹状体、及小脑的组织学上已知大量存在AMPA受体的区域(图4左及图5中(a))。

继而，为了研究K-2集积的特异性，在投予放射性标记化K-2的3分钟前，进行投予非放射性标记化K-2的阻断实验。明确：通过在0.5mg/kg的非放射性标记化K-2前进行投予，放射性标记化K-2的特异性集积消失，且K-2在体内对AMPA受体特异性结合(图4右及图5中(b))。

另外，由于在0.05mg/kg的非放射性标记化K-2前进行投予较在0.5mg/kg的K-2前进行投予，特异性结合的消失程度较少，所以表现出阻断中的浓度依存性，结果为暗示饱和性结合(图6)。关于脑干，由于不会因阻断而使吸收产生变化，故而可知：在该区域中，AMPA受体的显现较少(图5中(c)及(d))。因此，若以脑干作为参照部位而算出海马中的放射性标记化K-2的吸收的比，则可知：在投予放射性标记化K-2后20～60分钟呈现出较高的特异性结合(图7)。利用Logan Plot法将特异性结合数值化(图8)。因使用了非放射性标记化K-2的阻断(图8中的灰色)，BPnd(estimated binding potential，估计结合可能性)显著降低。另外，明确：表示特异性结合的值(图8中的黑色)和生物化学性地对AMPA受体的组织显现总量进行研究而得的值(图9)显示出较高的关联，且使用了放射性标记K-2的体内PET摄像反映了AMPA受体的分布。另外，各脑区域中的AMPA受体的生物化学显现量(粗馏分)和相同区域的PET图像值显示出较高的关联(图10)。

shRNA能够特异性地抑制特定的蛋白质的显现。使用慢病毒使能够抑制AMPA受体(GluA1～3)的显现的shRNA显现在左侧纹状体，使非功能shRNA即零乱RNA显现在右侧纹状体。结果为，在体内PET图像中，在shRNA侧确认到放射性标记K-2的吸收降低(图11)。另外，实施例中的PET图像值的降低为约30％(图12)。根据该结果，放射性标记K-2在活体内显示出对AMPA受体的较高的特异性。

(缩写的说明)

ACSF：人工脑脊髄液

AMPA：α-胺基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑-丙酸

DIPEA：二异丙基乙胺

DCM：二氯甲烷

EA：乙酸乙酯

PE：石油醚

PEPA：2-[2,6-二氟-4-({2-[(苯磺酰基)胺基]乙基}硫)苯氧基]乙酰胺

PET：正电子发射断层摄影法

TEA：四乙基铵

TMS：四甲基矽烷

1-BCP：1-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基羰基)-哌啶(1-(1,3-benzodioxol-5-ylcarbonyl)-piperidine)

SYM2206：(±)-4-(4-胺基苯基)-1,2-二氢-1-甲基-2-丙基胺甲酰基-6,7-亚甲基二氧基酞嗪((±)-4-(4-Aminophenyl)-1,2-dihydro-1-methyl-2-propylcarbamoyl-6,7-methylenedioxyphthal azine)

GYKI：4-(8-甲基-9H-[1,3]二恶茂并[4,5-h][2,3]苯二氮呯-5-基)苯胺(4-(8-methyl-9H-[1,3]dioxolo[4,5-h][2,3]benzodiazepin-5-yl)aniline)

CX546：2,3-二氢-1,4-苯并戴奥辛-7-基-(1-哌啶基)甲酮(2,3-dihydro-1,4-benzodioxin-7-yl-(1-piperidyl)methanone)