一种与乳腺癌发生发展相关的生物标志物及其应用

摘要

本发明公开了一种与乳腺癌发生发展相关的生物标志物及其应用，所述生物标志物为LOC100996251，本发明公开了检测LOC100996251水平的试剂、试剂盒、芯片，本发明同时公开了含有LOC100996251促进剂的组合物。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种与乳腺癌发生发展相关的生物标志物及其应用，具体地所述lncRNA为LOC100996251。

背景技术

乳腺癌是世界范围内女性最为常见的恶性肿瘤之一(DeSantis CE,Fedewa SA,Goding Sauer A,Kramer JL,Smith RA,Jemal A.Breast cancer statistics,2015.CACancer J Clin.2016；66(1):31--42.)。乳腺癌的发生伴随着基因、表观遗传以及各种各样分子机制的变化(Manca G,Tardelli E,Rubello D,et aI.Nucl MedCommun.2016；37(6):574-576.)。随着乳腺癌的早期诊断的进步，以及放射治疗、各种辅助治疗的发展，乳腺癌的预后已经有了很大的提高，但是乳腺癌仍然是威胁广大女性生命的最常见恶性肿瘤(Fan L,Goss PE,Strasser-Weippl K.2015；10(6):372-378)患者的年龄、肿瘤大小、淋巴结转移状态、组织病理学类型、病理学分级、激素受体状态常常被用来评估患者的预后以指导临床决策。然而，由于乳腺癌基因背景以及对治疗反应的多样性，这些评价乳腺癌的指标还远远不够，我们需要更多更好的生物标记物来指导早期诊断，选择合适的治疗手段以及精准的预测预后。

随着基因组学研究的深入，高通量测序技术的应用，人们发现超过98％的基因组序列大部分区域虽然进行转录，但是生成的RNA却不编码蛋白。这些非编码序列被人们认为是基因组中的“暗物质”。在这些非编码RNA中，有一类长度大于200个核苷酸而且不具备编码蛋白质能力的转录产物被定义为长链非编码RNA(long noncoding RNA,1ncRNA)。越来越多的研究表明，lncRNA在表观遗传调控、转录调控以及翻译后等多个层面上调控基因的表达，参与DNA损伤应答、X染色体沉默、细胞重编程和基因组印记等多种重要生命过程。

lncRNA与疾病之间的关系研究成为目前研究的重点，许多文献报道lncRNA在肿瘤进展转移的过程中发挥重要的作用，如CN201710522240.1、CN201710522694.9、CN201710522693.4报道的lncRNA的差异表达与肝癌细胞的增殖、侵袭和转移相关。研究lncRNA与肿瘤之间的关系对于推进肿瘤的早期诊断和个性化治疗具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与乳腺癌发生发展相关的lncRNA，从而为乳腺癌的诊断和治疗提供分子靶标，实现患者的个性化诊疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种试剂，所述试剂能够检测LOC100996251基因的表达水平。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别LOC100996251的探针；或

特异性扩增LOC100996251的引物。

进一步，所述的特异性扩增LOC100996251基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明的第二发面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第三方面提供了一种芯片，所述芯片包括本发明第一方面所述的试剂。

本发明的第四方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括LOC100996251的促进剂。

进一步，所述促进剂为含有LOC100996251的表达载体。

进一步，所述药物组合物还包括与所述促进剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明的第五方面提供了一种筛选预防或治疗乳腺癌的潜在物质的方法，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有LOC100996251基因的体系；和

检测所述体系中LOC100996251基因的表达；

其中，若所述待筛选物质可促进LOC100996251基因的表达或活性，则表明该筛选物质是预防或治疗乳腺癌的潜在物质。

本发明的第六方面提供了如下任一项所述的应用：

a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的应用；

b.本发明第二方面所述的试剂盒在制备诊断乳腺癌的产品中的应用；

c.本发明第三方面所述的芯片在制备诊断乳腺癌的产品中的应用；

d.本发明第四方面所述的药物组合物在制备治疗乳腺癌的产品中的应用；

e.本发明第四方面所述的药物组合物在制备治疗乳腺癌侵袭的产品中的应用；

f.本发明第四方面所述的药物组合物在制备治疗乳腺癌转移的产品中的应用；

g.本发明第五方面所述的方法在筛选治疗乳腺癌的潜在物质中的应用。

附图说明

图1是利用QPCR检测LOC100996251基因在乳腺癌组织中的表达情况图；

图2是利用QPCR检测LOC100996251基因在乳腺癌细胞系中的表达情况图；

图3是利用QPCR检测LOC100996251在乳腺癌细胞中的转染情况图；

图4是用CCK-8法检测LOC100996251基因对乳腺癌细胞增殖的影响图；

图5是利用Transwell小室检测LOC100996251对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响图；

其中图A是LOC100996251对乳腺癌细胞迁移的影响图；图B是LOC100996251对乳腺癌细胞侵袭的影响图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量方法，采用目前覆盖数据库最广的lncRNA芯片，检测乳腺癌标本中lncRNA在肿瘤组织和癌旁组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncRNA，探讨其与乳腺癌的发生发展之间的关系，从而为乳腺癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了乳腺癌中LOC100996251显著性下调。实验证明，通过提高LOC100996251的表达水平，能够有效地抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭。

LOC100996251基因

LOC100996251是位于人1号染色短臂1区3带上，一种代表性的人LOC100996251基因的核苷酸序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中LOC100996251基因(NR_103777.1)所示。本发明的LOC100996251核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。本发明中的LOC100996251包括野生型、突变型或其片段。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

检测技术

本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常称为PCR的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；TMA的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝；LCR的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为NASBA的基于核酸序列的扩增；使用RNA复制酶(通常称为Qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

芯片、试剂盒

本发明提供了检测中LOC100996251基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)制剂、芯片或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LOC100996251所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严格性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明中的示例性探针包括PCR引物以及基因特异性DNA寡核苷酸探针，例如固定于微阵列基底上的微阵列探针、定量核酸酶保护检验探针、与分子条形码连接的探针、以及固定于珠上的探针。

这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测LOC100996251的表达。优选的，所述的制剂或试剂盒中还含有用于标记RNA样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取RNA、PCR、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。

促进剂和药物组合物

基于本发明的发现，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含LOC100996251的促进剂。

所述的LOC100996251的促进剂是指任何可提高LOC100996251基因或表达产物稳定性、上调LOC100996251的表达、增加lncRNALOC100996251的有效作用时间或促进LOC100996251基因的转录的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调LOC100996251基因的表达有用的物质，从而可用于预防或治疗肺腺癌。

作为本发明的一种优选方式，所述的LOC100996251的促进剂是一种含有LOC100996251的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

药物组合物

本发明中的药物组合物包括LOC100996251的促进剂、和/或与所述促进剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

药学上可接受的载体可以是一种也可以是多种，所述载体包括但不限于粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或延时剂(timedelayagent)。合适的粘合剂包括阿拉伯胶、明胶、玉米淀粉、黄耆树胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴特或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、柑橘或树莓调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯类的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米蛋白、虫胶或麸质。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。合适的延时剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。本发明中的药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂等添加剂。

如本文所用，所述“有效量”是指其用量足以治疗疾病，以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比率。组合物的有效剂量水平可以根据受试者的类型、疾病的严重程度、受试者的年龄和性别、药物活性、对药物的敏感性、给药时间，给药途径、排泄率、治疗时间、与组合物联用的药物和医疗领域中其他已知因素来确定。本发明的药物组合物可单独使用或与其它治疗剂组合施用，并且可以与常规的治疗剂依次或同时给药。可采用一种或多种剂型中施用组合物。考虑所有上述因素，在能够表现出最大效果而不引起副作用的最小量下施用组合物至关重要，该最小量可由本领域技术人员容易地确定。

术语“有效的”表示治疗引起受试者体内病理性上调的基因表达下降，病理性下调的基因表达上升或乳腺导管癌的大小、流行性(prevalence)或转移潜力降低。当预防性采取所关注的治疗时，术语“有效的”指治疗能够延迟或防止乳房肿瘤的形成，或者能延迟、防止或减轻乳腺癌的临床症状。乳房肿瘤的评价可以按标准的临床方案进行。

本发明的药物组合物可以进一步包含一种或多种抗癌剂。在具体的实施方案中，药物组合物包含至少一种抑制LOC100996251基因表达的化合物和至少一种化疗剂。用于本发明的方法的化疗剂，包括但不限于，DNA-烷化剂，抗肿瘤抗生素剂，抗代谢剂，微管蛋白稳定剂，微管蛋白去稳定剂，激素拮抗剂，拓扑异构酶抑制剂，蛋白激酶抑制剂，HMG-COA抑制剂，CDK抑制剂，细胞周期蛋白抑制剂，胱天蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，反义核酸，三链螺旋DNA，核酸适体，和分子修饰的病毒、细菌和外毒素试剂。

本发明的药物组合物还可与其他治疗乳腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

本发明的药物组合物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物组合物的剂量。

药物筛选

本发明提供了一种筛选预防或治疗乳腺癌药物的方法，即：

在实验组中，向培养体系中加入待测化合物，并测定LOC100996251的表达水平；在对照组中，向同样的培养体系中不加入待测化合物，并测定LOC100996251的表达水平；其中，如果实验组中LOC100996251的表达水平大于对照组，则说明该待筛选的物质为LOC100996251的潜在物质。

在本发明中，所述的方法还包括：对上面步骤获得的潜在物质进一步测试其抑制乳腺癌的效果，若测试化合物对乳腺癌有显著的抑制效果，则说明该化合物为预防或治疗乳腺癌的潜在物质。

所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

当将通过本发明的筛选方法分离的化合物作为药物施用于人或其它哺乳动物，其包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、羊、猪、牛、猴子、狒狒、黑猩猩时，分离的化合物可以直接施用，或者可以利用已知的药物制备方法配制成各种剂型。例如，根据需要，所述药物可以作为糖衣片剂、胶囊剂、酏剂和微胶囊口服施用；或者用水或任何其它药物可接受的液体配制成无菌溶液或悬浮液，以注射剂的形式非口服施用。例如，可以将化合物以一般接受的药物施用方式所需的单位剂型(unit dose)、与药学可接受的载体或介质混合在一起，所述载体或介质包括但不限于无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味剂、赋形剂(excipient)、媒介物(vehicle)、防腐剂、粘合剂等。根据这些制剂中有效成分的含量，可以获得在指定范围内的合适的给药量。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与乳腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

收集病理明确诊断的8例乳腺癌患者的癌旁组织和乳腺癌组织样本，写明样本名称、组织类型、编号、取样日期、样本处理过程等情况，患者均签知情同意书，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、RNA样品的制备

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。

3、逆转录和标记

用Low RNAInput Linear Amplification Kit将mRNA逆转录成cDNA，同时用Cy3分别标记实验组和对照组。

4、杂交

基因芯片采用康城生物-Human lncRNAArray，按芯片使用说明书的步骤进行杂交。

5、数据分析

利用Agilent GeneSpring软件对芯片结果进行分析，筛选表达量具有显著性差异(标准为该lncRNA在癌与癌旁的表达量相差2倍以上，而且p<0.05)的lncRNA。

6、结果

结果显示，LOC100996251在乳腺癌患者中呈现差异性表达，与癌旁组织相比，其在癌组织中的表达水平显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)

实施例2QPCR测序验证LOC100996251基因的差异表达

1、对LOC100996251基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择乳腺癌癌旁组织和乳腺癌组织各50例。

2、RNA提取

利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品，具体操作详见说明书。

3、QPCR

1)反应体系：

RNA模板1μl，随机引物1μl，双蒸水加至12μl，混匀，低转速离心，65℃5min，然后放在冰上冷却。

继续在12μl反应液中加入下列成分：

5×反应缓冲液4μl，RNA酶抑制剂(20U/μl)1μl，10mM dNTP混合液2μl，AMV反转录酶(200U/μl)1μl；充分混匀并进行离心处理；

2)逆转录反应条件

25℃5min，42℃60min，70℃5min。

3)聚合酶链反应

引物设计：

根据Genebank中LOC100996251基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下：

LOC100996251基因：

正向引物为5’-AGTGATATGGAATAACAG-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-CGTGTATAATGTAGAGTT-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

配制PCR反应体系：

2×qPCR混合液12.5μl，基因引物2.0μl，反转录产物2.5μl，ddH₂O>

PCR反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环，60℃5min延伸反应。75℃至95℃，每20s升温1℃，绘制溶解曲线。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

4、ROC曲线分析

使用R语言中的pROC包分析LOC100996251的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制ROC曲线。

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

QPCR结果如图1所示，与乳腺癌癌旁组织相比，LOC100996251在乳腺癌组织中表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同芯片检测结果一致；ROC曲线结果显示，LOC100996251的AUC值高达0.967，具有较高的特异性和敏感性(0.914/0.913)，提示LOC100996251可应用于乳腺癌的特异性诊断，LOC100996251应用于乳腺癌的诊断具有较高的准确性。

实施例3LOC100996251在乳腺癌细胞系中的表达情况

1、细胞培养

培养人乳腺癌细胞系MCF-7，SK-BR-3，MDA-MB-231和乳腺正常上皮细胞系MCF-l0A，其中，MDA-MB-231培养于10％胎牛血清的L15培养基中，SKBR3培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，MCF-7和正常乳腺上皮细胞系MCF-10A培养于含10％胎牛血清的DMEM培养基中。培养液中加入1％P/S。在37℃、5％CO₂、相对湿度为90％的培养箱中培养。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。

2、RNA的提取与浓度测定

使用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，具体操作参照说明书。

3、QPCR具体步骤同实施例2

4、统计学分析

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，癌与癌旁组织的配对比较采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

5、结果

结果如图2所示，LOC100996251在乳腺癌细胞中的表达显著低于正常细胞系，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例4LOC100996251基因的过表达

1、细胞培养

培养人乳腺癌细胞系MCF-7，详细步骤同实施例3。

将培养瓶中的细胞用胰酶进行消化并接种在6孔板中，保证细胞数为2-8×10⁵个/孔，加入细胞培养基。过夜，第二天观察细胞密度，细胞密度为70％以上可进行转染。

2、基因过表达载体的构建

根据LOC100996251的cDNA序列合成特异的PCR扩增引物，在5’端引物和3’端引物分别添加限制性酶切位点，经限制性酶切后插入到真核表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-1用于后续实验。

3、转染

将实验分为三组：对照组(MCF-7)、阴性对照组(pcDNA3.1-NC)和实验组(pcDNA3.1-1)，使用脂质体3000进行载体的转染，具体转染方法按照说明书的指示进行

4、QPCR检测LOC100996251基因的转录水平

1)细胞总RNA的提取

利用QIAGEN的细胞RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，具体操作参照说明书。

2)QPCR扩增具体步骤同实施例2

5、统计学方法

实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的，LOC100996251基因实验组与对照组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

6、结果

结果如图3显示，与对照组相比，实验组中的LOC100996251的表达水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例5LOC100996251基因对乳腺癌细胞增殖的影响

采用CCK-8实验检测LOC100996251基因对乳腺癌细胞增殖能力影响。

1、细胞培养与转染步骤同实施例3，转染后6h换液，放置细胞培养箱过夜。

2、第二天将细胞取出，显微镜下观察细胞生长情况，1ml/孔加入含EDTA的胰酶，进行细胞消化，待消化完成后去除胰酶，加入细胞培养基混匀使细胞悬浮，然后进行细胞计数。

3、将细胞悬液浓度稀释为15000个/ml，接种200μl到96孔板中，每孔3000个细胞，设置8个复孔。

4、24h后，将第一块96孔板取出，每孔中加入10μl的CCK-8检测液，将96孔板继续放入细胞培养箱中孵育4h左右，用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值并记录数据。

5、在48h、72h、96h后分别重复步骤4中的操作，最后统计出各时间点的吸光度值，作出生长曲线图。

6、统计学分析

实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果如图4所示，与对照相比，实验组在转染pcDNA3.1-1后，细胞的增殖明显受到了抑制，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明LOC100996251具有抑制细胞增殖的作用，提示提高LOC100996251的水平可以抑制乳腺癌细胞。

实施例6细胞迁移及侵袭实验

1、Transwell小室制备

无菌条件下Matrigel冰浴融化，用PBS进行20倍稀释，以50μl/孔的体积铺在Transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待Matrigel胶聚合成凝胶后取出，轻轻吸出上层析出液。每孔中加入50μl的含BSA的无血清培养液对基底膜进行水化处理，37℃放置30min。

2、配置细胞悬液

细胞饥饿处理12-24h，胰酶消化离心，使用无血清培养基进行重悬，调整细胞密度为5×l0⁵个/ml。

3、细胞接种

取细胞悬液200μl加入到Transwell小室中，在24孔板下室加入500μl含FBS的DMEM培养基。把细胞放入细胞培养箱中培养24h。

4、染色

细胞在培养结束后使用DAPI染色。把小室细胞先用PBS漂洗2遍，放入DAPI工作液中室温染色5-20min。用PBS漂洗2遍，放入荧光显微镜下观察并计数。

5、结果

结果如图5所示，与对照组相比，实验组的迁移及侵袭能力均有明显下降，结果说明LOC100996251水平的增加能够抑制乳腺癌的迁移及侵袭，提示LOC100996251可作为靶标应用于乳腺癌转移的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 北京泱深生物信息技术有限公司

<120> 一种与乳腺癌发生发展相关的生物标志物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agtgatatgg aataacag 18

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgtgtataat gtagagtt 18

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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