一种用于预防去除内固定物后再骨折的多孔生物支架及其制备

摘要

本发明公开了一种具有生物活性的可用于预防去除内固定物后再骨折的复合生物材料及其制备，一种多孔生物支架及其制备，所述复合生物材料包括生物玻璃和交联改性的明胶；所述生物玻璃具有良好的生物相容性和生物活性，能够与周围的骨骼组织牢固的结合在一起；在体液环境中，其快速释放出Si、Ca等离子，促进成骨细胞新陈代谢，同时改善材料的降解性能；植入体内后，其能够诱导在材料表面形成与骨组织成分类似的羟基磷灰石，从而在骨组织与材料之间形成牢固的化学键合，诱导新骨组织的形成；所述交联改性的明胶在骨修复、骨移植替代等领域中应用时，可以调控复合生物材料的力学性能和降解速率；所述多孔生物支架包括上述复合生物材料。

说明书

技术领域

本发明属于生物材料领域，特别涉及一种可促进骨愈合的具有生物活性的能够预防去除内固定物后再骨折的复合生物材料及其制备、多孔生物支架及其制备。

背景技术

手术内固定是临床骨科治疗各种骨折最为有效的治疗方法之一。但内固定材料(即内固定物)若长期存在于人体内会导致诸多弊端，如内固定物造成的疼痛和关节僵硬、金属过敏、潜在的致癌风险、不利于金属探测等等，故经内固定治疗的骨折患者在骨折愈合后常需将内固定物取出。据芬兰一项随访七年的研究报告，有超过80％的患者在内固定骨折愈合后拆除内固定物，约占所有骨科手术的15％，同时，在美国，内固定物取出手术约占全年所有骨科手术总量的5％。但是，在经历内固定物取出术后的患者中有5％会出现再骨折的现象，而残留下的钉道骨缺损被认为是导致再骨折的重要原因之一。故及时修复取出内固定物后残留骨缺损成为了摆在临床骨科医生面前的难题，但遗憾的是目前尚没有针对该类缺损的修复材料。

生物玻璃(BG)是一种新型的生物活性材料，具有良好的骨传导和骨诱导性，在与体液接触的过程中会释放出大量离子，碳酸根羟基磷灰石层可以迅速在材料表面形成，并与患处的胶原纤维作用形成键合，有利于骨整合。同时硅离子等可作用于骨原细胞，促进骨原细胞的增殖和分化，促进新生骨的生长。通过传统制备方法已可制备出和天然骨力学强度相匹配的多孔支架，但是由于生物玻璃本身脆性大，有着较低的断裂韧性，即使对于非常小的损伤，多孔支架也会十分敏感，常在远远低于其能够承担的压缩强度下就发生破坏，故在生物玻璃中引入韧性的高分子材料制备复合材料是增加其韧性的一种可行的方法。

明胶(Gelatin)是食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)认证的一种安全的高分子生物材料，来源于哺乳动物骨和皮肤中胶原的水解产物，其已作为血液扩容剂、止血海绵等材料被广泛应用于临床各领域中。同时，明胶还具有众多结构和生物学上的优势：首先，明胶具有温度可逆性，可通过冷冻干燥的方法得到类似人体松质骨结构的多孔支架材料；其次，明胶具有良好的生物相容性和生物可降解性，并且分子中含有大量的RGD序列，有利于细胞的粘附和生长；再者，作为胶原蛋白的水解产物，明胶相比胶原的免疫原性大大降低，可以作为组织工程材料的基体或者支撑材料使用，同时明胶水溶性大大提高，能够任意塑性，增强了可加工性；另外，明胶来源广泛、价格低廉，为增强其实际应用提供了经济基础。

现有技术中有关于将生物玻璃与明胶复合用于骨替代或骨重建材料等领域的报道，但是所述复合材料的孔的形貌以及粒径难以做到精确控制，而且目前的复合材料中的孔太长且弯曲使得骨纤维不能完全地通过，不利于骨替代和骨重建材料的生长。同时，过长的互连大孔体系也存在细菌蕴藏的风险，所述细菌能定居在大孔体系的封闭端中，从而躲避抗菌素的系统性处理。

发明内容

为了填补现有技术的缺陷，本发明的一个目的在于提供一种具有生物活性的用于预防去除内固定物后再骨折的复合生物材料及其制备。

本发明的另一个目的在于提供一种具有生物活性的用于预防去除内固定物后再骨折的多孔生物支架及其制备。

发明人研究发现，所述具有生物活性的用于预防去除内固定物后再骨折的复合生物材料具有促进成骨生长，将其应用于人体后，可预防去除内固定物后出现的再骨折现象，促进残留钉孔的愈合；同时，所述的复合生物材料中的生物玻璃具有可控的力学性能，能够针对不同部位以及患者本身骨质量进行调节力学强度，且材料成分均为临床上已使用的材料，安全性能好，便于尽快应用于临床。所述具有生物活性的用于预防去除内固定物后再骨折的复合生物材料具有多孔支架结构，其可以用于制备具有生物活性的用于预防去除内固定物后再骨折的多孔生物支架。基于上述的思路，完成了本发明。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种复合生物材料，所述复合生物材料包括生物玻璃和交联改性的明胶；所述生物玻璃的化学组成为：x(SiO₂)·y(CaO)·m(P₂O₅)·n(Na₂O)·a(ZnO₂)·b(SrO)，其中，x，y，m，n，a，b表示各组成的摩尔百分含量(mol.％)，其范围如下：x为10～99.5mol.％，y为0.5～90mol.％，m为0～70mol.％，n为0～25mol.％，a为0～10mol.％，b为0～10mol.％。

根据本发明，所述复合生物材料具有生物活性，能够用于预防去除内固定物后再骨折的发生。

根据本发明，所述生物玻璃的质量百分含量为大于等于10wt％且小于等于90wt％，优选为大于等于10wt％且小于等于80wt％。

根据本发明，所述交联改性的明胶的质量百分含量为大于等于10wt％且小于等于90wt％，优选为大于等于20wt％且小于等于90wt％。

根据本发明，所述交联改性明胶的交联剂为戊二醛、京尼平、纤维蛋白、壳聚糖中的至少一种。优选地为戊二醛、京尼平中的至少一种。

根据本发明，所述明胶选自A型明胶、B型明胶中的至少一种。

根据本发明，所述生物玻璃中，x为13～75mol.％，y为10～75mol.％，m为0～68mol.％，n为0～25mol.％，a为0～10mol.％，b为0～10mol.％。

优选地，x为13～60mol.％，y为15～75mol.％，m为5～68mol.％，n为0～25mol.％，a为0～10mol.％，b为0～10mol.％。

根据本发明，所述生物玻璃中，P₂O₅与SiO₂的摩尔比为0.1～4，优选0.1～1，且CaO的摩尔百分含量为15～75mol.％。

根据本发明，所述生物玻璃的粒径为1nm～200nm；优选为5nm～150nm；还优选为10nm～120nm。

根据本发明，所述复合生物材料具有联通的孔道。

根据本发明，所述复合生物材料的孔隙率为50～99％；抗压模量为5～35MPa，杨氏模量为200～1000MPa；孔径为30-600μm。

本发明还提供上述复合生物材料的制备方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1)制备明胶水溶液；

步骤2)将生物玻璃加入所述明胶水溶液中，搅拌，陈化；

步骤3)冷冻、干燥处理；

步骤4)将上述干燥后的物质置于交联剂中进行明胶的交联反应，洗涤；

步骤5)将上述洗涤后的物质再次进行冷冻、干燥处理，即制备得到所述复合生物材料。

根据本发明，在步骤1)中，制备明胶水溶液的步骤为：将明胶在水中加热溶解，得到均匀分散的明胶水溶液。其中，所述明胶水溶液的浓度为10～30％；优选为15～25％。进一步地，所述加热溶解的温度为40～70℃；时间为0.5～4h；优选地，所述加热溶解的温度为50～60℃；时间为1～2h。

根据本发明，在步骤2)中，所述生物玻璃和明胶的摩尔比为(0.1～1.5):1；优选为(0.9～1.1):1。

根据本发明，在步骤2)中，所述搅拌温度为40～70℃，所述搅拌时间为0.5～4h；优选地，所述搅拌温度为50～60℃，所述搅拌时间为1～2h。

根据本发明，在步骤2)中，所述陈化在磨具中进行。其中，所述磨具的材质优选为聚合物；还优选为聚烯烃；进一步优选为聚乙烯。

根据本发明，在步骤2)中，所述陈化时间为12～48h；优选为16～36h。

根据本发明，在步骤3)中，所述冷冻处理为：将陈化后的物质置于-30～-10℃(例如-20℃)的冰箱中冷冻24～72h(例如48h)。进一步地，所述干燥处理为冷冻干燥处理；例如，所述冷冻干燥处理为：将冷冻后的样品在-70～-30℃(例如-54℃)温度下进行冷冻干燥2～3天。

根据本发明，在步骤4)中，所述交联剂选自戊二醛、京尼平、纤维蛋白、壳聚糖中的至少一种。

根据本发明，在步骤4)中，交联剂以溶液形式使用，其中，交联剂溶液的浓度为0.5～5wt％(例如为1wt％)。进一步地，所述浸泡时间为12～48h(例如24h)。

本发明中，所述复合生物材料在交联剂溶液中的浸泡是由于明胶在超过30℃时可能会发生溶解，因此需要将明胶进行交联。

根据本发明，在步骤4)中，所述洗涤为：取出浸泡后的物质，用超纯水充分洗涤，并在水中浸泡24h，并且每隔6-8h换水一次。

根据本发明，在步骤5)中所述的冷冻、干燥处理同步骤3)中所述的冷冻、干燥处理。

本发明还提供一种多孔生物支架，所述多孔生物支架包括上述复合生物材料。

根据本发明，所述多孔生物支架具有生物活性，能够用于预防去除内固定物后再骨折的发生。

本发明还提供上述多孔生物支架的制备，其包括复合生物材料的制备步骤，所述复合生物材料的制备采用上述的复合生物材料的制备方法。

本发明还提供上述具有生物活性的可用于预防去除内固定物后再骨折的复合生物材料的应用，其可以用于制备多孔生物支架。

本发明还提供上述多孔生物支架的应用，其可以用于骨缺损，骨移植替代等领域中。

本发明的有益效果：

1.本发明提供了一种具有生物活性的可用于预防去除内固定物后再骨折的复合生物材料及其制备，所述复合生物材料包括生物玻璃和交联改性的明胶；所述生物玻璃具有良好的生物相容性和生物活性，能够与周围的骨骼组织牢固的结合在一起；在体液环境中，其快速释放出Si、Ca及任选地P等离子，促进成骨细胞新陈代谢，同时改善材料的降解性能；植入体内后，其能够诱导在材料表面形成与骨组织成分类似的羟基磷灰石，从而在骨组织与材料之间形成牢固的化学键合，诱导新骨组织的形成，使所述复合生物材料具备优异的生物活性；所述交联改性的明胶在骨修复、骨移植替代等领域中应用时，可以调控复合生物材料的力学性能和降解速率。

2.本发明还提供一种具有生物活性的可用于预防去除内固定物后再骨折的多孔生物支架及其制备；所述多孔生物支架具有良好的可塑性、力学性能，以及优异的生物活性、生物相容性和生物降解性，同时可以任意塑形能够满足不同内固定物取出后各样缺损的需求。所述多孔生物支架具有可匹配各种松质骨强度的力学性能，可根据不同部位、不同骨质量的患者进行调节。同时在所述多孔生物支架的合成过程中，可根据不同内固定器械残留缺损匹配设计不同尺寸和大小的模具，且成型的多孔生物支架也可以方便地通过剪切和磨削等操作进行大小和形状的调整，方便临床使用。所述具有生物活性的可用于预防去除内固定物后再骨折的多孔生物支架是选用目前临床上最常用的材料进行复合，安全性能得到证实，这样可以促使其尽快应用于临床。

附图说明

图1为本发明实施例1制备得到的具有多孔支架结构的BP-14/Gel固化脱模后的光学图。

图2为本发明制备得到的具有多孔支架结构BP/Gel扫描电镜图；

其中(a)为对比例1制备得到的Gel的扫描电镜图；(b)为实施例1制备得到的BP-14/Gel的扫描电镜图；(c)为实施例2制备得到的BP-65/Gel的扫描电镜图。

图3为本发明制备得到的具有多孔支架结构BP/Gel中BP分布图；

其中(a)为实施例1制备得到的BP-14/Gel的BP分布图；(b)为实施例2制备得到的BP-65/Gel的BP分布图；(c)为实施例3制备得到的BP-106/Gel的BP分布图。

图4为本发明制备得到的具有多孔支架结构的BP/Gel在SBF(模拟人体液)中浸泡7d、14d的XRD图；其中，(a)为浸泡7d后BP/Gel的XRD结果；(b)为浸泡14d后BP/Gel的XRD结果。

图5为利用MTT法对MC3T3细胞与本发明制备得到的具有多孔支架结构的BP/Gel共培养1d、3d、7d后的细胞活性对比图。

具体实施方式

如上所述，本发明利用生物玻璃的生物活性和明胶的塑性，制备出与人体各部位骨骼力学性能相近的具有多孔支架结构的复合生物材料，并用于骨缺损，骨移植替代等领域中。

所述生物玻璃的制备方法，具体包括如下步骤：

以水、乙醇或乙醇和水的混合物作为溶剂，将植酸、正硅酸乙酯及硝酸钙或氯化钙混合配制成凝胶前驱体溶胶溶液；将配制的凝胶前驱体溶胶溶液在室温下放置直到凝胶；于60℃陈化，然后取出放入烘箱中烘烤，使其中的溶剂全部挥发，降温至室温，然后将温度由室温升温至温度为300～400℃，将干的凝胶在温度为300～400℃下恒温进行烧结至少10分钟后自然冷却，从而得到生物玻璃；其中：植酸、正硅酸乙酯及硝酸钙或氯化钙的加入量是通过生物玻璃中的P₂O₅、SiO₂和CaO的摩尔百分含量来体现。

任选地，所述生物玻璃的制备过程中，还可以任选地加入钠盐、锌盐、锶盐，配制成凝胶前驱体溶胶溶液；所述钠盐、锌盐、锶盐的加入量是通过生物玻璃中的Na₂O、ZnO₂和SrO的摩尔百分含量体现的。

其中，所述的将温度由室温升温至温度为300～400℃，是在空气中将温度由室温以5℃/min的升温速度升温到300～400℃。

其中，所述的烘箱的温度为120℃。

其中，由凝胶前驱体形成的溶胶溶液通过浸沾或喷涂的方法在其它材料表面形成膜。

本发明中，所述“降解”是指可以在患者机体内通过细胞吸收和/或水解降解而降解的复合生物材料。

此外，申请号为201010248059.4的中国专利中公开了生物玻璃及其制备方法，此处全文引入作为参考。

下面结合具体附图和实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。

下述实施例中使用的原料，如无特殊说明，均是可以商业购买得到的。

本实施例中，生物玻璃(BP)的化学组成为45mol.％(SiO₂)·55mol.％(CaO)；其中，BP-14指的是尺寸粒径为14nm的生物玻璃，BP-65指的是尺寸粒径为65nm的生物玻璃，BP-106指的是尺寸粒径为106nm的生物玻璃；Gel指的是戊二醛交联改性后的明胶。

实施例1具有多孔支架结构的BP-14/Gel的制备

室温下将明胶在水中溶胀，然后在40℃下加热溶解，得到浓度为20wt％的均匀明胶溶液。将生物玻璃BP-14加入明胶溶液中(生物玻璃BP-14和明胶的加入摩尔比为1:1)，于40℃下搅拌8h，充分混合。将混合均匀的液体倒入聚乙烯模具中并陈化24h，陈化完成后置于-20℃的冰箱中冷冻48h，将冷冻的样品在-54℃下进行冷冻干燥，时间为2-3天。将冷冻干燥后的样品置于1wt％的戊二醛溶液中浸泡24h进行充分交联，交联完成后取出样品并用超纯水充分洗涤，并在水中浸泡24h，每隔6-8h换水一次，以保证未反应的戊二醛能够完全清除。最后，将在水中浸泡后的样品再次进行冷冻干燥即可得到具有多孔支架结构的BP-14/Gel。

图1为本发明实施例1制备得到的具有多孔支架结构的BP-14/Gel固化脱模后的光学图，从图中可以看出，具有多孔支架结构的BP-14/Gel可制备成不同尺寸，同时也能看出支架成多孔状。

图2(b)为本发明实施例1制备得到的具有多孔支架结构BP-14/Gel扫描电镜(SEM)图，从图中可以看出，本实施例制备得到的具有多孔支架结构BP-14/Gel可明显观察到大孔贯穿结构，说明其具有联通的孔道；所述BP-14/Gel的孔隙率为79.9±1.2％，孔径大小为50-400μm。

图3(a)为本发明实施例1制备得到的具有多孔支架结构BP-14/Gel中BP分布图，从图中可以看出，本实施例制备得到的具有多孔支架结构BP-14/Gel中BP颗粒在明胶中均匀分布。

表1给出了本发明制备得到的具有多孔支架结构BP/Gel在万能力学机上测量的物性参数，由表可知，本实施例制备得到的具有多孔支架结构BP-14/Gel的抗压模量为15.4±2.5MPa，杨氏模量为602.3±73.4MPa，说明其能够达到天然松质骨力学强度的上限水平。

表1本发明制备得到的具有多孔支架结构BP/Gel的物性参数

样品杨氏模量(MPa)抗压模量(MPa)密质骨3*10³～3*10⁴130～180天然松质骨20～5004～12对比例147.2±16.31.8±0.2实施例1602.3±73.415.4±2.5实施例2319.8±28.110.9±1.8实施例3409.3±53.610.5±1.7

图4中包括本发明实施例1制备得到的具有多孔支架结构BP-14/Gel在模拟人体液(SBF)中浸泡7d、14d后XRD的图，从图中可以看出，经不同时间的浸泡，在2θ角为26°、28°、32°、40°、46°、49°和53°处均能看到明显的羟基磷灰石峰，说明BP-14/Gel在早期即有羟基磷灰石峰形成，且随着在模拟人体液(SBF)中浸泡时间的延长，具有多孔支架结构BP-14/Gel表面的羟基磷灰石峰的衍射峰强度逐渐变强，证明羟基磷灰石峰再继续生长，说明所述具有多孔支架结构BP-14/Gel具有良好的生物活性。

图5为利用MTT法对MC3T3细胞与本发明制备得到的具有多孔支架结构BP/Gel共培养1d、3d、7d后的细胞活性对比图。从图中可以看出，共培养7d后本实施例制备得到的具有多孔支架结构的BP-14/Gel相对对照组(本发明对比例1制备得到的Gel)的细胞数量为141.8％，说明具有多孔支架结构的BP-14/Gel有良好的细胞相容性。

实施例2具有多孔支架结构的BP-65/Gel的制备

所述具有多孔支架结构的BP-65/Gel的制备方法同实施例1，区别仅在于所述生物玻璃选用BP-65。

图2(c)为本发明实施例2制备得到的具有多孔支架结构BP-65/Gel扫描电镜图，从图中可以看出，本实施例制备得到的具有多孔支架结构BP-65/Gel可明显观察到大孔贯穿结构，说明其具有联通的孔道；所述BP-65/Gel的的孔隙率为85.1±2.4％，孔径大小为50-400μm。

图3(b)为本发明实施例2制备得到的具有多孔支架结构BP-65/Gel中BP分布图，从图中可以看出，本实施例制备得到的具有多孔支架结构BP-65/Gel中BP颗粒在明胶中均匀分布。

表1给出了本发明制备得到的具有多孔支架结构BP/Gel在万能力学机上测量的物性参数，由表可知，本实施例制备得到的具有多孔支架结构BP-65/Gel的抗压模量为10.9±1.8MPa，杨氏模量为319.8±28.1MPa，说明其满足天然松质骨力学强度范围。

图4中包括本发明实施例2制备得到的具有多孔支架结构BP-65/Gel在模拟人体液(SBF)中浸泡7d、14d后XRD的图，从图中可以看出，经不同时间的浸泡，在2θ角为26°、28°、32°、40°、46°、49°和53°处均能看到明显的羟基磷灰石峰，说明BP-65/Gel在早期即有羟基磷灰石峰形成，且随着在模拟人体液(SBF)中浸泡时间的延长，具有多孔支架结构BP-65/Gel表面的羟基磷灰石峰的衍射峰强度逐渐变强，证明羟基磷灰石峰再继续生长，说明所述具有多孔支架结构BP-65/Gel具有良好的生物活性。

图5为利用MTT法对MC3T3细胞与本发明制备得到的具有多孔支架结构BP/Gel共培养1d、3d、7d后的细胞活性对比图。从图中可以看出，共培养7d后本实施例制备得到的具有多孔支架结构的BP-65/Gel相对对照组(本发明对比例1制备得到的Gel)的细胞数量为133.9％，说明具有多孔支架结构的BP-65/Gel有良好的细胞相容性。

实施例3具有多孔支架结构的BP-106/Gel的制备

所述具有多孔支架结构的BP-106/Gel的制备方法同实施例1，区别仅在于所述生物玻璃选用BP-106。

图3(c)为本发明实施例3制备得到的具有多孔支架结构BP-106/Gel中BP分布图，从图中可以看出，本实施例制备得到的具有多孔支架结构BP-106/Gel中BP颗粒在明胶中均匀分布。

表1给出了本发明制备得到的具有多孔支架结构BP/Gel在万能力学机上测量的物性参数，由表可知，本实施例制备得到的具有多孔支架结构BP-106/Gel的抗压模量为10.5±1.7MPa，杨氏模量为409.3±53.6MPa，说明其满足天然松质骨力学强度范围。

图4中包括本发明实施例3制备得到的具有多孔支架结构BP-106/Gel在模拟人体液(SBF)中浸泡7d、14d后XRD的图，从图中可以看出，经不同时间的浸泡，在2θ角为26°、28°、32°、40°、46°、49°和53°处均能看到明显的羟基磷灰石峰，说明BP-106/Gel在早期即有羟基磷灰石峰形成，且随着在模拟人体液(SBF)中浸泡时间的延长，具有多孔支架结构BP-106/Gel表面的羟基磷灰石峰的衍射峰强度逐渐变强，证明羟基磷灰石峰再继续生长，说明所述具有多孔支架结构BP-106/Gel具有良好的生物活性。

图5为利用MTT法对MC3T3细胞与本发明制备得到的具有多孔支架结构BP/Gel共培养1d、3d、7d后的细胞活性对比图。从图中可以看出，共培养7d后本实施例制备得到的具有多孔支架结构的BP-106/Gel相对对照组(本发明对比例1制备得到的Gel)的细胞数量为132.3％，说明具有多孔支架结构BP-106/Gel有良好的细胞相容性。

对比例1Gel的制备

室温下将明胶在水中溶胀，然后在40℃下加热溶解，得到浓度为20wt％的均匀明胶溶液。将明胶溶液倒入聚乙烯模具中并陈化24h，陈化完成后置于-20℃的冰箱中冷冻48h，将冷冻的样品在-54℃下进行冷冻干燥，时间为2-3天。将冷冻干燥后的样品置于1wt％的戊二醛溶液中浸泡24h进行充分交联，交联完成后取出样品并用超纯水充分洗涤，并在水中浸泡24h，每隔6-8h换水一次，以保证未反应的戊二醛能够完全清除。最后，将在水中浸泡后的样品再次进行冷冻干燥即可得到戊二醛交联改性后的明胶，记为Gel。

图2(a)为本发明对比例1制备得到的Gel扫描电镜图，从图中可以看出，制备得到的Gel的孔隙率为85％。

表1给出了本发明对比例1制备得到的Gel在万能力学机上测量的物性参数，由表可知，其抗压模量为1.8±0.2MPa，杨氏模量为47.2±16.3MPa，不满足天然松质骨力学强度范围。

图4为本发明对比例1制备得到的Gel在模拟人体液(SBF)中浸泡7d、14d后XRD的图，从图中可以看出，经不同时间的浸泡，在2θ角为26°、28°、32°、40°、46°、49°和53°处没有能看到明显的羟基磷灰石峰，说明Gel不具有生物活性。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。