功能化长春花碱脂质体及其应用

摘要

本发明公开了功能化长春花碱脂质体及其应用。本发明提供了一种长春花碱脂质体，为用功能化材料转铁蛋白受体结合肽‑聚乙二醇‑二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和硬脂基八聚精氨酸修饰脂质体，得到修饰后脂质体，再将长春花碱包载到所述修饰后脂质体中，得到功能化长春花碱脂质体。本发明的实验证明，本发明合成了一种功能化材料转铁蛋白受体结合肽‑聚乙二醇‑二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(NHS‑PEG2000‑DSPE)，并用其与靶向材料硬脂基八聚精氨酸(stearyl‑R8)修饰长春花碱脂质体，得到一种能够跨越血脑屏障并杀伤脑胶质瘤及其干细胞的功能化长春花碱脂质体。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种功能化长春花碱脂质体及其应用。

背景技术

长春花碱(vinblastine，VLB)由加拿大西安大略大学科学家Robert Noble和Charles Thomas于1958年首次从夹竹桃科植物长春花中提取分离得到，它是一种双吲哚型生物碱，具有抗肿瘤活性。长春花碱的结构式如图1所示，分子式为C₄₆H₅₈N₄O₉，分子量为810.97，常溶于硫酸盐，不溶于水，为白色或类白色结晶性粉末。

转铁蛋白受体结合肽TfR-T₁₂是序列为THRPPMWSPVWP的多肽，包含12个氨基酸(Thr-His-Arg-Pro-Pro-Met-Trp-Ser-Pro-Val-Trp-Pro)，易溶于水和甲醇，分子量为1490.8。TfR-T₁₂多肽能与人转铁蛋白受体(transferrin>12在体内与转铁蛋白受体结合时不会受到转铁蛋白的干扰。由于血脑屏障和肿瘤细胞上高表达转铁蛋白受体，因此TfR-T₁₂在脑部靶向药物递送系统中有潜在应用价值。

硬脂基八聚精氨酸(stearylated octaarginine，Stearyl-R₈)是由八个精氨酸和硬脂基(stearyl)合成连接而得的功能材料，由Shiroh>8能帮助材料进入细胞主要因为精氨酸具有丰富的阳离子中心，而大多数细胞(尤其是肿瘤细胞)和细胞器表面呈负电性，因此具有靶向肿瘤细胞和亚细胞器的功能，同时由于硬脂基的存在，可插入到脂质体的磷脂双分子层上，帮助脂质体靶向肿瘤部位。

二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG₂₀₀₀)是一种用于长循环脂质体制备的材料，1992年由Maruyama>2000为二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-N-琥珀酰亚胺(NHS-PEG₂₀₀₀-DSPE)，易与多肽上的氨基反应，在反应过程中脱去N-羟基琥珀酰亚胺，生成酰胺键，易于操作。

脑胶质瘤是一种重大的脑部疾病，手术治疗难度大，放射治疗副作用多，且手术治疗或放射治疗后仍会残存少量的脑胶质瘤细胞及其干细胞。常规的化学治疗中，化疗药物难以跨越血脑屏障，而少量能跨越血脑屏障的药物由于脑胶质瘤干细胞具有耐药性，也难以将其清除干净，导致脑胶质瘤的复发。因此，如何帮助化疗药物跨越血脑屏障、在杀伤脑胶质瘤的同时清除残存的脑胶质瘤及其干细胞是仍待解决的重要科学问题。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种脂质体或者长春花碱脂质体。

本发明提供的脂质体经转铁蛋白受体结合肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和硬脂基八聚精氨酸修饰；

本发明提供的长春花碱脂质体由所述脂质体以及包载在所述脂质体内的长春花碱组成；

所述转铁蛋白受体结合肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺为由TfR-T₁₂多肽和NHS-PEG₂₀₀₀-DSPE通过酰胺键连接得到的产物。

TfR-T₁₂(Thr-His-Arg-Pro-Pro-Met-Trp-Ser-Pro-Val-Trp-Pro)购自合肥国肽生物科技有限公司。

本发明另一个目的是提供一种制备上述长春花碱脂质体的方法。

本发明提供的方法，为用转铁蛋白受体结合肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和硬脂基八聚精氨酸(stearyl-R₈)修饰脂质体，并将长春花碱包载在所述脂质体内得到长春花碱脂质体。

上述方法包括如下步骤：

1)制备转铁蛋白受体结合肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；

所述制备方法包括如下步骤：将TfR-T₁₂多肽和NHS-PEG₂₀₀₀-DSPE在催化剂的作用下进行酰化反应，得到转铁蛋白受体结合肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；

上述制备转铁蛋白受体结合肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺的方法还具体包括如下步骤：在所述酰化反应步骤之后，将反应体系转移至透析袋中，置于去离子水中透析24小时，除去溶剂和未反应原料，得到转铁蛋白受体结合肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺；

所述透析袋的截留分子量具体为3000Da；所述透析的时间为24小时。

2)用卵磷脂、胆固醇、所述转铁蛋白受体结合肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(TfR-T₁₂-PEG₂₀₀₀-DSPE)和硬脂基八聚精氨酸(stearyl-R₈)进行成膜反应，得到修饰后脂质体，得到修饰后脂质体；

上述制备修饰后脂质体的方法具体包括如下步骤：将卵磷脂、胆固醇和TfR-T₁₂-PEG₂₀₀₀-DSPE溶于有机溶剂中，减压除去有机溶剂，形成含有薄膜的体系；再加入硫酸铵进行水化得到粗脂质体；再将粗脂质体超声，得到超声后产物，将超声后产物通过孔径为200nm的聚碳酯膜，滤液经过透析袋透析，得到脂质体；

3)将长春花碱包载到所述修饰后脂质体中，得到长春花碱脂质体。

上述将长春花碱包载到所述脂质体中包括如下步骤：将所述长春花碱用甲醇溶解，得到溶解产物，再将脂质体与所述溶解产物混匀，反应，得到长春花碱脂质体。

上述方法中，步骤1)中，所述TfR-T₁₂多肽和NHS-PEG₂₀₀₀-DSPE的投料摩尔比为1:1-3:1；

或，所述催化剂为N-甲基吗啉；

或，所述催化剂与所述TfR-T₁₂多肽的投料配比为200μL：8μmol；

或，所述酰化反应的温度为常温，酰化反应的时间为48h；

或，所述酰化反应在溶剂中进行；

或，所述溶剂具体为DMF。

上述方法中，步骤2)中，所述卵磷脂、胆固醇、所转铁蛋白受体结合肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和所述stearyl-R₈的投料摩尔比为60:30:3:5。

上述方法中，步骤3)中，所述长春花碱和所述修饰后脂质体的投料质量比为1:20。

上述方法中制备得到的所述转铁蛋白受体结合肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺也是本发明保护的范围；

或上述方法中制备得到的修饰后脂质体也是本发明保护的范围。

上述的转铁蛋白受体结合肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺在制备脂质体或制备长春花碱脂质体或修饰脂质体或修饰长春花碱脂质体中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的长春花碱脂质体或上述的转铁蛋白受体结合肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺在制备具有如下1)-9)至少一种功能的产品中的应用也是本发明保护的范围：

1)杀伤脑胶质瘤细胞或其干细胞；

2)抑制脑胶质瘤细胞或其干细胞增殖；

3)跨越血脑屏障；

4)促进脑胶质瘤细胞或其干细胞凋亡；

5)促进脑胶质瘤细胞或其干细胞的线粒体损伤；

6)提高脑胶质瘤细胞或其干细胞活性氧水平；

7)促进脑胶质瘤细胞或其干细胞的微管损伤；

8)提高脑胶质瘤细胞或其干细胞中促凋亡相关蛋白基因表达；

9)预防和/或治疗脑胶质瘤。

本发明第三个目的是提供一种具有如下1)-9)至少一种功能的产品。

本发明提供的产品，其活性成分为上述的长春花碱脂质体；

1)杀伤脑胶质瘤细胞或其干细胞；

2)抑制脑胶质瘤细胞或其干细胞增殖；

3)跨越血脑屏障；

4)促进脑胶质瘤细胞或其干细胞凋亡；

5)促进脑胶质瘤细胞或其干细胞的线粒体损伤；

6)提高脑胶质瘤细胞或其干细胞活性氧水平；

7)促进脑胶质瘤细胞或其干细胞的微管损伤；

8)提高脑胶质瘤细胞或其干细胞中促凋亡相关蛋白基因表达；

9)预防和/或治疗脑胶质瘤。

上述中，所述促凋亡相关蛋白为caspase-3/7、caspase-8、caspase-9、Bax、细胞色素C、Mcl-1、LC3B或FoxO1；

或所述产品为药物或试剂盒。

本发明的实验证明，本发明合成了一种功能化材料转铁蛋白受体结合肽-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(TfR-T₁₂-PEG₂₀₀₀-DSPE)，并用其与阳离子材料硬脂基八聚精氨酸(stearyl-R₈)修饰长春花碱脂质体，得到一种能够跨越血脑屏障并杀伤脑胶质瘤及其干细胞的功能化长春花碱脂质体。该功能化长春花碱脂质体具有跨越血脑屏障并特异性杀伤脑胶质瘤干细胞作用，是一种新型的载药系统，有重要的学术意义和潜在临床应用价值。

附图说明

图1为长春花碱结构式示意图。

图2为合成产物TfR-T₁₂-PEG₂₀₀₀-DSPE的MALDI-TOF-MS图谱。

图3为功能化长春花碱脂质体结构示意图。

图4为HPLC方法测定长春花碱浓度-峰面积的标准曲线。

图5为HPLC方法测定长春花碱的特征图谱。

图6为HPLC方法测定长春花碱的检测限。

图7为功能化长春花碱脂质体原子力显微镜(AFM)观察结果。

图8为功能化长春花碱脂质体透射电镜(TEM)观察结果。

图9为长春花碱从各组脂质体中的释放率。

图10为转铁蛋白受体在脑胶质瘤细胞(A)及其干细胞(B)中的表达情况。

图11为干细胞特征标志物在脑胶质瘤细胞及其干细胞中转铁蛋白受体的表达情况。

图12为各制剂组对脑胶质瘤细胞(A₁)及其干细胞(A₂)的杀伤效应.

图13为转铁蛋白受体在脑微血管内皮细胞(BMVECs)中的表达情况。

图14为各制剂组跨越血脑屏障共培养模型后对脑胶质瘤细胞的杀伤作用。

图15为各制剂组对脑胶质瘤细胞的凋亡诱导效应。

图16为各制剂组对脑胶质瘤干细胞的凋亡诱导效应。

图17为各制剂组对脑胶质瘤细胞的细胞核损伤情况。

图18为各制剂组对脑胶质瘤细胞的线粒体损伤情况。

图19为各制剂组对脑胶质瘤细胞释放活性氧的促进作用。

图20为各制剂组对脑胶质瘤细胞的微管破坏情况。

图21为各制剂组对脑胶质瘤细胞中凋亡酶caspase-3/7的激活作用。

图22为各制剂组对脑胶质瘤细胞中凋亡酶caspase-8的激活作用。

图23为各制剂组对脑胶质瘤细胞中凋亡酶caspase-9的激活作用。

图24为各制剂组对脑胶质瘤细胞中促凋亡蛋白Bax的表达促进作用。

图25为各制剂组对细胞色素c从脑胶质瘤细胞线粒体中的释放促进作用。

图26为各制剂组对脑胶质瘤细胞中抗凋亡蛋白Mcl-1的表达抑制作用。

图27为各制剂组对脑胶质瘤细胞中自噬蛋白LC3B的上调作用。

图28为各制剂组对脑胶质瘤细胞中自噬蛋白FoxO1的上调作用。

图29为正常裸鼠脑组织切片。

图30为荷脑胶质瘤裸鼠脑组织切片。

图31为药物在荷脑胶质瘤裸鼠中的实时活体成像。

图32为给药48h后药物在荷脑胶质瘤裸鼠各器官中的离体成像。

图33为荷脑胶质瘤裸鼠经治疗后卡普兰-梅耶生存曲线。

图34为药物在荷脑胶质瘤裸鼠中的抗脑胶质瘤干细胞效应。

图35为荷脑胶质瘤裸鼠各器官苏木精-伊红(HE)染色。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例1中所用的部分材料和仪器如下：

NHS-PEG₂₀₀₀-DSPE(N-hydroxysuccinimidyl-polyethylene>12(Thr-His-Arg-Pro-Pro-Met-Trp-Ser-Pro-Val-Trp-Pro)购自合肥国肽生物科技有限公司，中国；stearyl-R₈(stearyl-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-NH₂)购自上海吉尔生化有限公司，中国；卵磷脂(egg>2000)，日本油脂株式会社(日本NOF公司)，日本；硫酸长春花碱(vinblastine)，南京多伦化工有限公司，中国；N，N-二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF，超干溶剂)，北京百灵威公司，中国；甲醇(methanol,HPLC级)，默克公司，德国；乙腈(acetonitrile,HPLC级)，默克公司，德国；Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazine>

透析袋(截留分子量3000Da，8000-14000Da)，北京鼎盛伟业生物科技有限公司，中国；BT-25S十万分之一克精密电子天平，Sartorius公司，德国；HJ-6型六头磁力加热/恒温搅拌器，江苏金坛市科析仪器有限公司，中国；基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS，matrix-assisted desorption/ionization time of flight mass)，Shimadzu公司，日本；RE52CS旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂，中国；SB-5200超声机，宁波新芝生物科技有限公司仪器，中国；JY92-IID型超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技有限公司，中国；ZWY-103B恒温培养振荡器，上海智城分析仪器制造有限公司，中国；Tecnar G220ST型透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)，FEI公司，美国；激光散射粒径测定仪(Malvern Zetasizer 3000HS)，Malvern instruments公司，英国；SPI3800N series SPA-400型原子力显微镜(AFM)，NSK有限公司，日本；岛津色谱仪(LC-10AT)，岛津(Shimadzu)有限公司，日本；反相色谱柱(C18column,5μm,250x4.6mm)，托伦斯Phenomenex公司，美国。

所有数据用Mean±SD表示。采用单因素方差分析(ANOVA)，然后经过Bonferroni校验，P<0.05认为有显著性差异。

下述实施例2中所用的部分材料和仪器如下：

脑胶质瘤U87-MG细胞株购自中国医学科学院肿瘤研究所；无血清补充剂，Gibco公司，美国；白血病抑制因子(LIF)购自无锡药科美生物科技有限公司，中国；胎牛血清，PAN公司，德国；MEM、DMEM-F12培养基、胰岛素、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、非必需氨基酸、胰酶购自北京迈晨科技有限公司，中国；Anti-HumanTransferrin Receptor(CD71)antibody-FITC，北京义翘神州生物技术有限公司，中国；Anti-Human Nestin antibody-FITC，R&D公司，美国；Anti-Human ABCG2(CD338)antibody-FITC，Anti-Human CXCR4antibody-PE，以及对应的同型抗体购自Biolegend公司，美国；磷酸盐缓冲液(PBS)，购自北京鼎国生物技术有限公司；磺基罗丹明B(SRB)购自Sigma公司，美国；Triton X-100购自北京中杉金桥生物技术有限公司(ZSGB-BIO)，中国；4％多聚甲醛购自迈晨科技有限公司，中国；三氯乙酸(TCA)购自北京市兴津化工厂，中国；一次性细胞培养实验用品(包括细胞培养板培养瓶、培养皿、无菌离心管等)购自康宁(Corning)公司，美国。细胞培养箱，Thermo公司，美国；AirTECH细胞超净台，苏净安泰公司，中国；TDZ4-WS低速台式离心机，湘仪离心机仪器有限公司，中国；Tecan infinite F50酶标仪，Tecan公司，瑞士；TS-8平板振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司，中国；倒置显微镜，重庆光学电学仪器公司，中国；DK-S24电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司，中国；流式细胞仪(BDFACS Calibur)，Becton Dickinson公司，美国。

下述实施例3的部分材料和仪器如下：

脑胶质瘤U87-MG细胞株购自中国医学科学院肿瘤研究所；鼠脑毛细血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMVECs)，购自中日友好医院临床研究所；双抗(青霉素，链霉素)购自北京索莱宝科技有限公司，中国；胎牛血清，PAN公司，德国；MEM、DMEM培养基、肝素、内皮细胞生长因子(ECGF)、非必需氨基酸、胰酶购自北京迈晨科技有限公司，中国；Anti-Mouse Transferrin Receptor(CD71)antibody-FITC，eBioscience公司，美国；磷酸盐缓冲液(PBS)，购自北京鼎国生物技术有限公司；磺基罗丹明B(SRB)购自Sigma公司，美国；明胶购自北京拜尔迪生物技术公司；三氯乙酸(TCA)购自北京市兴津化工厂，中国；一次性细胞培养实验用品(包括细胞培养板、Transwell聚酯膜插入器、培养瓶、培养皿、无菌离心管等)购自康宁(Corning)公司，美国。

BT-25S十万分之一克精密电子天平，Sartorius公司，德国；细胞培养箱，Thermo公司，美国；AirTECH细胞超净台，苏净安泰公司，中国；TDZ4-WS低速台式离心机，湘仪离心机仪器有限公司，中国；Tecan infinite F50酶标仪，Tecan公司，瑞士；TS-8平板振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司，中国；ERS-2细胞电阻仪，Millipore公司，美国。

下述实施例4的部分材料和仪器如下：

脑胶质瘤U87-MG细胞株购自中国医学科学院肿瘤研究所；脑胶质瘤干细胞GSCs为本研究自行诱导培养所得；无血清补充剂，Gibco公司，美国；白血病抑制因子(LIF)购自无锡药科美生物科技有限公司，中国；胎牛血清，PAN公司，德国；山羊血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司，中国；MEM、DMEM、DMEM-F12培养基、胰岛素、表皮生长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、非必需氨基酸、胰酶(不含EDTA)购自北京迈晨科技有限公司，中国；线粒体红色荧光探针(Mitotracker Deep Red FM)、Hoechst 33342购自Invitrogen公司，美国；微管红色荧光探针(Tubulin-Tracker Red)购自北京碧云天(Beyotime)公司，中国；细胞凋亡试剂盒(7-AAD和Annexin V-KeyFluor 647)购自上海凯基生物(KeyGEN Biotech)，中国；活性氧检测试剂盒(DCFH-DA)购自北京普利莱(APPLYGEN)，中国；anti-caspase 3/7antibody、anti-caspase 8antibody、anti-caspase 9antibody、anti-Bax antibody、anti-cytochrome c antibody、anti-MCL-1antibody、anti-Forkheadbox protein O1(FoxO1)、antibody and anti-LC3B antibody购自北京碧云天(Beyotime)公司，中国；Alexa488-conjugated goat anti-rabbit antibody、Alexa488-conjugated goat anti-mouse antibody、Triton X-100购自北京中杉金桥生物技术公司(ZSGB-BIO)，中国；4％多聚甲醛购自迈晨科技(北京)有限公司，中国；甘氨酸购自国药集团化学试剂北京有限公司，中国；磷酸盐缓冲液(PBS)，购自北京鼎国生物技术有限公司；一次性细胞培养实验用品(包括细胞培养板、培养瓶、无菌离心管、等)购自康宁(Corning)公司，美国。BT-25S十万分之一克精密电子天平，Sartorius公司，德国；细胞培养箱，Thermo公司，美国；AirTECH细胞超净台，苏净安泰公司，中国；TDZ4-WS低速台式离心机，湘仪离心机仪器有限公司，中国；倒置显微镜，重庆光学电学仪器公司，中国；LEICA TCS-SP8激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning fluorescent microscope)，LEICA公司，德国；流式细胞仪(BD FACS Calibur)，Becton Dickinson公司，美国；Operetta高内涵分析系统，Perkin Elmer公司，美国。

下述实施例5的部分材料和仪器如下：

BALB/c雄性裸鼠(18-20g)购自北京大学实验动物中心，中国；脑胶质瘤U87-MG细胞株购自中国医学科学院肿瘤研究所；胎牛血清，PAN公司，德国；MEM培养基、非必需氨基酸、胰酶购自北京迈晨科技有限公司，中国；山羊血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司，中国；Hoechst 33342购自Invitrogen公司，美国；一次性注射器(1mL、2mL和5mL)购自Becton Dickinson(BD)公司，美国；DiR荧光染料，购自Sigma公司，美国；anti-nestinantibody购自AbCam公司，英国；Alexa488-conjugated goat anti-rabbitantibody、Triton X-100购自北京中杉金桥生物技术公司(ZSGB-BIO)，中国；4％多聚甲醛购自迈晨科技(北京)有限公司，中国；磷酸盐缓冲液(PBS)，购自北京鼎国生物技术有限公司；一次性细胞培养实验用品(包括细胞培养板、培养瓶、无菌离心管、等)购自康宁(Corning)公司，美国。

BT-25S十万分之一克精密电子天平，Sartorius公司，德国；细胞培养箱，Thermo公司，美国；AirTECH细胞超净台，苏净安泰公司，中国；TDZ4-WS低速台式离心机，湘仪离心机仪器有限公司，中国；倒置显微镜，重庆光学电学仪器公司，中国；LEICA TCS-SP8激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning fluorescent microscope)，LEICA公司，德国；脑立体定位仪，深圳瑞沃德生命科技有限公司，中国；Caikon XDS-300C系统，上海蔡康光学仪器有限公司，中国；IVIS Spectrum活体成像系统，Perkin Elmer公司，美国。

所有数据用Mean±SD表示。采用单因素方差分析(ANOVA)，然后经过Bonferroni校验，P<0.05认为有显著性差异。生存率数据用卡普兰-迈耶存活曲线显示，并用log-rank检验做统计学处理，P<0.05认为有显著性差异。

实施例1、功能化长春花碱脂质体的构建与表征

一、功能化长春花碱脂质体的构建

1、TfR-T₁₂-PEG₂₀₀₀-DSPE的合成

TfR-T₁₂-PEG₂₀₀₀-DSPE为在催化剂存在的条件下，将TfR-T₁₂多肽和NHS-PEG₂₀₀₀-DSPE进行酰化反应而得；其中TfR-T₁₂多肽与NHS-PEG₂₀₀₀-DSPE的投料摩尔比为1:1。

具体合成方法如下：

向反应瓶中加入8μmol TfR-T₁₂多肽(THRPPMWSPVWP)和8μmol>2000-DSPE，用2mL>

利用基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)验证产物，使用2,5-二羟基苯甲酸(DHB)作为检测基质。

结果如图2所示，产物的MALDI-TOF-MS图谱，图中显示产物的平均分子质量为4441.77Da，与反应物PEG₂₀₀₀-DSPE分子量(3000.00Da)之间的差值为1441.77Da，这与TfR-T₁₂的分子量(1490.80Da)吻合，说明目标产物TfR-T₁₂-PEG₂₀₀₀-DSPE合成成功。

2、功能化长春花碱脂质体的制备

1)普通长春花碱脂质体

按摩尔比60:30:3精密称取卵磷脂(EPC)、胆固醇(CHOL)、PEG₂₀₀₀-DSPE于茄形瓶中，按体积比3:1加入二氯甲烷和甲醇，用旋转蒸发仪在40℃水浴、90rpm转速下减压除去有机溶剂，得到一层均匀薄膜贴于茄形瓶底部。加入50mL硫酸铵(250mM)水溶液进行水化：先水浴超声5min，至薄膜完全脱落，并且体系呈均匀的乳白色粗脂质体；之后将粗脂质体转移至EP管中，用JY92-IID型超声波细胞粉碎机中进一步超声10min(设置超声工作时间为1s，间歇时间为1s，保护温度为30℃，功率为200W)。超声结束后，得到带微弱蓝色乳光的半透明液体，将该液体挤压并通过孔径为200nm的聚碳酯膜，得到的液体转移至透析袋中(截留分子量8000-14000Da)，在HBS缓冲溶液(151mM>

按药脂质量比1:20(w/w)精密称量长春花碱加入25mL茄形瓶中，加入甲醇溶解，用旋转蒸发仪在40℃水浴、90rpm转速下减压除去甲醇，得到均匀分散的长春花碱。利用硫酸铵梯度载药法，将上述获得的空白脂质体溶液加入该茄形瓶中，在60℃水浴中振摇20min，得到普通长春花碱脂质体。

2)TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体

与普通长春花碱脂质体制备方法相同，但成膜过程中将PEG₂₀₀₀-DSPE替换为上述1)制备的TfR-T₁₂-PEG₂₀₀₀-DSPE，得到TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体。

3)Stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体

与普通长春花碱脂质体制备方法相同，但成膜过程中按摩尔比60:30:3:5精密称取卵磷脂(EPC)、胆固醇(CHOL)、PEG₂₀₀₀-DSPE、stearyl-R₈于茄形瓶中，得到Stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体。

4)功能化长春花碱脂质体

与普通长春花碱脂质体制备方法相同，但成膜过程中按摩尔比60:30:3:5精密称取卵磷脂(EPC)、胆固醇(CHOL)、TfR-T₁₂-PEG₂₀₀₀-DSPE、stearyl-R₈于茄形瓶中，得到功能化长春花碱脂质体。

图3为功能化长春花碱脂质体的示意图，卵磷脂构成了脂质体的双分子层，具有流动性，同时插入胆固醇增加脂质体的刚性。功能化材料TfR-T₁₂-PEG₂₀₀₀-DSPE和stearyl-R₈修饰在脂质体表面，水溶性长春花碱在硫酸铵梯度作用下主动进入脂质体的内水相。

二、表征

1、长春花碱含量测定方法

1)色谱条件

色谱柱：Luna C18柱(Phenomenex,C18column,5μm,250x4.6mm)；流动相：甲醇-0.02M磷酸二氢钠溶液(70:30，v/v)；检测波长：267nm；流速：1.0mL/min；进样量：20μL，测定温度：25℃。

2)标准曲线

精密称量长春花碱，加入适量甲醇溶解并稀释成浓度分别为0.78、1.56、3.12、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μg/mL的标准溶液。按照上述色谱条件测定各样品的色谱峰面积A值。以长春花碱浓度C为自变量，对其相应的色谱峰面积A值进行线性回归，求得长春花碱的标准曲线(图4)。标准曲线为y＝19476x+1348.2，R²＝1。

长春花碱在此液相条件下的色谱图如图5，其保留时间在7min左右，峰形良好。3)回

收率

取适量空白脂质体，加入九倍体积的甲醇进行破坏。然后加入精密称定的长春花碱对照品适量，加流动相溶解，依次配制为含长春花碱12.50、25.00、50.00μg/mL的溶液，过滤，分别用上述色谱条件测定峰面积，计算回收率。

结果如表1所示，显示，回收率在96.49％-98.56％范围内。

表1为HPLC-UV测定脂质体中对长春花碱的回收率

Notes:Data are presented as mean±standard deviation(SD,n＝5).

4)精密度

取适量的空白脂质体，加入九倍体积的甲醇破坏。然后加入精密称定长春花碱对照品适量，加流动相溶解，依次配制为含长春花碱12.50、25.00、50.00μg/mL的溶液，于5日内分别用上述色谱条件测定峰面积，计算日内和日间相对标准偏差。

结果如表2显示，此方法测定长春花碱的日内和日间相对偏差RSD<2％，该测定方法精密度良好。

表2为HPLC-UV方法精密度的测定

Notes:Data are presented as mean±standard deviation(SD,n＝5).

5)检测限

精密称取长春花碱对照品适量，加甲醇溶解并稀释，按倍比稀释依次配制标准溶液，按照上述色谱条件测定样品的色谱峰面积。当信噪比约为3:1时的检测浓度为本方法的最低检测限。

结果如图6显示，本方法测定长春花碱的检测限为0.024μg/mL。

2、包封率的测定

取功能化空白脂质体500μL通过Sephadex G-50葡聚糖凝胶柱，以HBS缓冲溶液(25mM HEPES,150mM NaCl,pH 7.4)为流动相预饱和葡聚糖凝胶柱。之后取载药脂质体(普通长春花碱脂质体、TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体、stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体、功能化长春花碱脂质体)500μL通过Sephadex>

利用如下公式计算各脂质体中长春花碱的包封率：

包封率％＝过凝胶柱脂质体含药物的量/未过凝胶柱脂质体含药物的量×100％。

药物浓度用对照品法(比较一点法)计算，即得。

长春花碱在各组脂质体中的包封率均大于97.0％，见表3。

表3为脂质体的理化表征

Notes:Data are presented as mean±standard deviation(SD,n＝3).

3、粒径和Zeta电位的测定

1)粒径的测定

分别取普通长春花碱脂质体、TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体、stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体、功能化长春花碱脂质体，用PBS稀释20倍，取1mL加入样品池，使用激光散射粒径测定仪测定脂质体的粒径(波长633nm，入射光与散射光束的夹角为90°)，每个样品平衡时间为120s，测定20个循环时间，测定温度设定为25℃。每个样品最后的测定结果为20次测定结果的平均值。多分散度表示粒子大小的均匀程度，多分散度越小则粒子越均匀。

结果如表3所示，各脂质体的平均粒径均在90-120nm范围内，多分散系数(PDI，polydisperisty indexes)在0.176-0.253之间。

2)Zeta电位的测定

测定完粒径后，将普通长春花碱脂质体、TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体、stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体、功能化长春花碱脂质体转移至电位杯中(溶液要淹过导电铜片)，设置Zeta电位测定条件为平衡时间120s，每次最少测定20个循环时间，测定温度设定为25℃。每个样品最后的测定结果为20次测定结果的平均值。

结果如表3所示，stearyl-R₈修饰的脂质体Zeta电位为正，其它组脂质体均略显负电。

4、形态学观察

1)原子力显微镜(AFM)观察

使用去离子水作为分散介质，将未经修饰的普通长春花碱脂质体与功能化长春花碱脂质体稀释至100μg/mL(脂材浓度)并用0.2μm微孔滤膜过滤。取10μL稀释液涂于硅片表面，室温静置干燥后，用原子力显微镜轻敲模式检测和记录。

结果如图7所示，A1为普通长春花碱脂质体，A2为功能化长春花碱脂质体，原子力显微镜下，两种脂质体呈现为表面圆整、光滑的形态，粒子直径100nm左右，与粒径结果相符。

2)透射电镜(TEM)观察

使用去离子水作为分散介质，将未经修饰的普通长春花碱脂质体与功能化长春花碱脂质体稀释至1μg/mL(脂材浓度)并用0.2μm微孔滤膜过滤。然后，将铺有碳膜的铜网放在脂质体溶液上，1min后取出，用滤纸吸干后，将俘获有脂质体粒子的铜网漂放在1％醋酸双氧铀水溶液上，1min后取出并用滤纸吸干。室温放置过夜晾干后，使用透射电镜仪在120kV下进行观测和记录。

结果如图8显示，A1为普通长春花碱脂质体，A2为功能化长春花碱脂质体，透射电镜下，两种脂质体均呈现为边缘光滑圆整的球形，粒子直径100nm左右，与粒径结果相符。

5、药物释放度

体外释放实验在含血清蛋白的释放介质(含10％胎牛血清的PBS缓冲液)中进行。分别取1mL普通长春花碱脂质体、TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体、stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体、功能化长春花碱脂质体加入透析袋(8000-14000Da)中，并加入1mL释放介质，用缝合线扎紧后置于装有20mL释放介质的西林瓶中，放入摇床，在37℃、100rpm条件下开始振荡。分别于1、2、4、8、12、24h取出0.2mL释放介质，并每次取样后立即补入同等体积的新释放介质。

取出的各份样品用甲醇(样品:甲醇＝2:8，v/v)进行破坏稀释，使蛋白析出，高速离心，再用滤膜过膜，除去大分子蛋白，用HPLC进行测定各样品中长春花碱对应的峰面积，利用所得的线性回归方程计算浓度，从而计算出各个样品在不同时刻的释放量，得到其在某一时刻的累积释放量。

体外释放率用以下的公式计算：

体外释放率％＝(第i时间点释放液中药物的量/与透析体积相同的透析前脂质体溶液中药物的量)×100％。

各组脂质体在释放介质中的释放结果如图9，结果显示，各组脂质体在24h内的长春花碱释放率均低于12％。

上述结果表明，功能化长春花碱脂质体是将功能化材料TfR-T₁₂-PEG₂₀₀₀-DSPE和stearyl-R₈修饰到脂质体上、并利用硫酸铵梯度法将长春花碱包入脂质体所得到的。

实施例2、功能化长春花碱脂质体对脑胶质瘤及其干细胞靶向性杀伤效应细胞培养

一、细胞培养

脑胶质瘤细胞U87-MG细胞在含10％FBS和1％非必需氨基酸的MEM培养基中培养，培养条件为37℃、含5％CO₂。

脑胶质瘤干细胞(glioma stem cells,GSCs)的诱导及培养(Yu SC；Ping YF；YiL；Zhou ZH；Chen JH；Yao XH；Gao L；Wang JM；Bian XW.Isolation and characterizationof cancer stem cells from a human glioblastoma cell line U87[J].CancerLetters,2008,265(1):124-34)：以每mL 2×10⁴个U87-MG细胞的浓度在含2％无血清补充剂、10ng/mL LIF、20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF、181.6ng/mL胰岛素的DMEM-F12培养基中悬浮培养，培养条件为37℃、含5％CO₂。培养四周后进行鉴定。

鼠脑毛细血管内皮细胞BMVECs在含20％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、40U/mL肝素、100ug/mL ECGF的DMEM培养基中培养，培养条件为37℃、含5％CO₂。培养瓶提前30min用2％明胶溶液处理。2％明胶溶液的配制方法：称取2g明胶，用100ml>

二、脑胶质瘤及其干细胞转铁蛋白受体标记

BSA缓冲液：每100mL PBS缓冲液中加入500mg BSA和74.45mg EDTA。

分别收集GSCs(B)、U87-MG细胞(A)，加入BSA缓冲液使细胞重悬，将细胞分装至1.5mL EP管中，每管中加入1×10⁷个细胞。向GSCs和U87-MG的实验组中加入5μL>

采用流式细胞仪FACScan flow cytometer测定，使用前向角散射和侧向角散射来排除双细胞团块。检测FITC的激发波长为488nm，发射波长为530nm。

结果如图10显示，转铁蛋白受体在脑胶质瘤细胞(A)及其干细胞(B)中的表达情况,表明，转铁蛋白受体在两种细胞上均有表达，其中，在U87-MG中的表达量为94.65％(A)。

三、脑胶质瘤干细胞的鉴定

脑胶质瘤干细胞GSCs诱导并培养四周后对特征标志物进行鉴定，包括神经巢蛋白(nestin)、ABCG2、CXCR4。同时取等量U87-MG细胞进行对照。

将悬浮培养的细胞球离心，用0.05％胰酶消化为单细胞悬液，分装至1.5mL EP管内，每管中加入1×10⁷个细胞。

对于nestin的标记：用4％冰的多聚甲醛在在4℃固定10min，再用0.2％Triton X-100溶液室温下孵育10min对细胞打孔，向GSCs和U87-MG细胞的实验组中加入10μL Anti-Human Nestin antibody-FITC，同时向对照组中加入10μL同型对照抗体，充分吹打混匀，室温下避光孵育30min。之后细胞用PBS洗两遍，用300μL PBS重悬并过400目筛至流式管中，上机前避光冰浴保存。

对于ABCG2的标记：用4％冰的多聚甲醛在在4℃固定10min，向GSCs和U87-MG细胞的实验组中加入5μL Anti-Human ABCG2(CD338)antibody-FITC，同时向对照组中加入5μL同型对照抗体，充分吹打混匀，室温下避光孵育30min。之后细胞用PBS洗两遍，用300μL PBS重悬并过400目筛至流式管中，上机前避光冰浴保存。

对于CXCR4的标记：使用Anti-Human CXCR4 antibody-PE和对应的同型抗体，步骤同ABCG2。

采用流式细胞仪FACScan flow cytometer测定，使用前向角散射和侧向角散射来排除双细胞团块。检测FITC的激发波长为488nm，发射波长为530nm；检测FITC的激发波长为488nm，发射波长为564nm。

结果如图11所示，ABCG2在脑胶质瘤细胞(A₁)及其干细胞(A₂)中的表达；CXCR4在脑胶质瘤细胞(B₁)及其干细胞(B₂)中的表达；nestin在脑胶质瘤细胞(C₁)及其干细胞(C₂)中的表达；图11B₁和图11B₂显示，ABCG2在U87-MG和GSCs中的表达量分别为5.76％和23.93％；图11B₁和图11B₂显示，CXCR4在U87-MG和GSCs中的表达量分别为22.80％和98.60％；图11C₁和图11C₂显示，nestin在U87-MG和GSCs中的表达量分别为39.36％和97.77％。结果显示，三种特征标志物在GSCs的表达均比U87-MG增加，表明诱导干细胞成功。

四、对脑胶质瘤细胞及其干细胞的杀伤效应

1.细胞接种

收集消化对数生长期的U87-MG和GSCs细胞，分别以每个孔4×10³个细胞(180μL培养基)接种到96孔板上，设六个复孔，在37℃、含5％CO₂的培养箱中孵育24h。

2.给药方案

用无血清培养基配制系列浓度的游离长春花碱、普通长春花碱脂质体、TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体、stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体、功能化长春花碱脂质体。每孔加入20μL，使长春花碱的终浓度为0-50μM。加药后的96孔培养板，置于37℃、含5％CO₂的培养箱中孵育，继续孵育48h。

3.测定与计算

孵育结束后，取出96孔培养板，弃掉培养基，每孔加入10％冰的三氯乙酸(TCA)200μL，在4℃条件下放置超过1h固定细胞。然后用蒸馏水洗涤5遍培养板，以去除三氯乙酸。在空气中过夜干燥后，向每孔中加100μL 0.4％的SRB(以1％冰醋酸配制)，室温下放置15min后弃去液体，用1％乙酸洗涤5遍，以去除未结合的染料，空气中干燥后每孔加入200μL10mmol/L Tris base(pH 10.5)溶解，在平板振荡器(脱色摇床)上振荡30min，至染料全部溶解。置酶标仪中于540nm波长下测定每孔光密度值(OD)。采用经过加药培养以后细胞的存活百分数(Cell survival rate,％)来评价各制剂对细胞的毒性作用。细胞存活百分数按照如下公式计算：

结果如图12所示，每个浓度下的一组柱状图依次为：游离长春花碱，长春花碱脂质体，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体，功能化长春花碱脂质体，功能化空白脂质体；图12A1和图12A₂分别表示各制剂组对体外U87-MG和GSCs细胞的抑制效应。结果显示，功能化长春花碱脂质体对于U87-MG和GSCs均有着最强的增殖抑制作用。各制剂组对U87-MG和GSCs的增殖抑制能力顺序一致：功能化长春花碱脂质体>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体>普通长春花碱脂质体>游离长春花碱>功能化空白脂质体。功能化长春花碱脂质体抑制U87-MG和GSCs细胞增值。

实施例3、功能化长春花碱脂质体在跨越血脑屏障的效应

一、细胞培养

鼠脑毛细血管内皮细胞BMVECs在含20％FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、40U/mL肝素、100ug/mL ECGF的DMEM培养基中培养，培养条件为37℃、含5％CO₂。培养瓶提前30min用2％明胶溶液处理。2％明胶溶液的配制方法：称取2g明胶，用100ml>

二、BMVECs表面转铁蛋白受体标记

BSA缓冲液：每100mL PBS缓冲液中加入500mg BSA和74.45mg EDTA。

收集BMVECs细胞，加入BSA缓冲液使细胞重悬，将细胞分装至1.5mL EP管中，每管中加入1×10⁷个细胞。向BMVECs的实验组中加入5μL>

采用流式细胞仪FACScan flow cytometer测定，使用前向角散射和侧向角散射来排除双细胞团块。检测FITC的激发波长为488nm，发射波长为530nm。

结果如图13，转铁蛋白受体在BMVECs中的表达量为17.68％。

二、血脑屏障模型的建立及评价

用2％明胶预先包被细胞插入器30min，将BMVECs以每孔1×10⁴个细胞的密度加入到包被过的细胞插入器中(每孔1mL培养基)，并在下室中加入1mL>

在显微镜下观察BMVECs形成的紧密连接，进行初步评价；使用细胞电阻仪检测细胞插入器与下室中的跨上皮电阻(TEER)。发现所建立的血脑屏障模型TEER值均大于300Ω·cm²。因此，体外血脑屏障模型建立成功。

三、BMVECs/U87-MG共培养模型的建立

以每孔2×10³的密度在12孔板中加入U87-MG细胞(1mL培养基)，并将之前铺有BMVECs的细胞插入器转移至12孔板上方，在37℃、含5％CO₂的培养箱中共同培养24h，即得到BMVECs/U87-MG共培养模型。

四、跨越血脑屏障后杀伤脑胶质瘤效应

在建立的BMVECs/U87-MG共培养模型的细胞插入器中分别加入各组制剂，给药方案如下：游离长春花碱、普通长春花碱脂质体、TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体、stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体、功能化长春花碱脂质体，以加入空白培养基的孔作为空白对照组，以不铺有BMVECs的孔作为阳性对照组，长春花碱的终浓度为50nM。在37℃、含5％CO₂的培养箱中孵育48h后，弃去液体，每孔加入2mL>540nm制剂组/A_540nm对照组)x100％，A>540nm是540nm下的吸光度值。

结果如图14所示，1，游离长春花碱；2，长春花碱脂质体；3，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；4，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；5，功能化长春花碱脂质体；表示各制剂组跨越体外血脑屏障对体外U87-MG细胞的抑制效应。结果显示，功能化长春花碱脂质体有着最强的跨越体外血脑屏障能力并对于U87-MG有着最强的增殖抑制作用。各组存活率顺序为：空白对照组>游离长春花碱>普通长春花碱脂质体>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体>功能化长春花碱脂质体>阳性对照组。其中，阳性对照组中，不在细胞插入器内铺设BMVECs，以此排除实验过程中可能出现的假阳性结果。

实施例4、功能化长春花碱脂质体诱导脑胶质瘤凋亡效应

一、功能化长春花碱脂质体诱导脑胶质瘤凋亡效应

1.细胞接种

将脑胶质瘤细胞U87-MG和脑胶质瘤干细胞GSCs以每孔5×10⁵个细胞的密度分别接种于6孔板中，并加入2mL培养基，在37℃、含5％CO₂的培养箱中孵育24h。

2.给药方案

弃掉培养基，分别加入2mL用无血清培养基配制的游离长春花碱、普通长春花碱脂质体、TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体、stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体、功能化长春花碱脂质体溶液，使长春花碱浓度为30nM；空白组加入无血清培养基，置于37℃、含5％CO₂的培养箱中孵育。孵育12h后，用PBS清洗细胞2次，使用不含EDTA的胰酶将细胞消化下来并离心收集细胞，分散于300μl>

3.测定与计算

采用流式细胞仪FACScan flow cytometer测定，使用前向角散射和侧向角散射来排除双细胞团块。检测KeyFluor 647的激发波长为651nm，发射波长为667nm；检测7-AAD的激发波长为546nm，发射波长为647nm。使用单标样本数据在设置合理的十字门，并进行数据处理。

凋亡率＝实验组凋亡率-空白组凋亡率

制剂对脑胶质瘤细胞及其干细胞的凋亡诱导效应如图15(a，空白对照；b，游离长春花碱；c，长春花碱脂质体；d，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；e，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；f，功能化长春花碱脂质体)和图16(a，空白对照；b，游离长春花碱；c，长春花碱脂质体；d，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；e，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；f，功能化长春花碱脂质体)所示。十字门根据阴性组和两个单阳组确定，它将每个结果分为了四部分，左下(Lower>

结果显示，功能化长春花碱脂质体对脑胶质瘤细胞及其干细胞均具有最强的凋亡诱导效应，且主要体现在凋亡早期(在十字门右下区域即为早期凋亡)，而凋亡晚期无明显变化。

对于脑胶质瘤细胞，各制剂诱导早期凋亡的顺序为：功能化长春花碱脂质体(40.98％)>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体(28.90％)>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体(24.01％)>游离长春花碱(23.79％)>长春花碱脂质体(17.82％)。

对于脑胶质瘤干细胞，各制剂诱导早期凋亡的顺序为：功能化长春花碱脂质体(15.36％)>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体(10.90％)>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体(9.70％)>游离长春花碱(7.23％)>长春花碱脂质体(7.29％)。

二、对脑胶质瘤细胞核及线粒体的损伤效应

将脑胶质瘤细胞U87-MG以每孔5×10³个细胞(180uL培养基)的密度接种于96孔细胞培养板中，在37℃、含5％CO₂的培养箱中孵育24h。分别向各组中加入游离长春花碱、普通长春花碱脂质体、TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体、stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体、功能化长春花碱脂质体溶液，使长春花碱浓度为30nM；空白组加入无血清培养基。每组制剂设置6个复孔，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育。12h后，弃掉培养基，PBS洗涤2遍，加入线粒体红色荧光探针(Mitotracker>

利用Operetta高内涵筛选系统在10倍目镜下对每孔采集图片并测定荧光强度。

利用Operetta高内涵对各组采集图片，用Columbus system进行分析所采集图片中细胞核的变异程度，并将其量化。细胞核损伤比例＝实验组细胞核变异程度系数/空白组细胞核变异程度系数。

结果如图17(1，空白对照；2，游离长春花碱；3，长春花碱脂质体；4，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；5，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；6，功能化长春花碱脂质体。)所示，细胞核损伤比例顺序为：功能化长春花碱脂质体(1.64±0.12)>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体(1.43±0.08)>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体(1.44±0.08)>长春花碱脂质体(1.21±0.09)>游离长春花碱(1.15±0.05)。

利用Operetta高内涵对各组采集图片，用Columbus system进行分析所采集图片中细胞核的变异程度，并将其量化。线粒体损伤比例＝实验组线粒体变异程度系数/空白组线粒体变异程度系数。结果如图18(1，空白对照；2，游离长春花碱；3，长春花碱脂质体；4，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；5，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；6，功能化长春花碱脂质体)所示，线粒体损伤比例顺序为：功能化长春花碱脂质体(1.281±0.013)>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体(1.226±0.022)>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体(1.215±0.023)>游离长春花碱(1.141±0.027)>长春花碱脂质体(1.137±0.035)。

三、对脑胶质瘤细胞活性氧水平的调控

将脑胶质瘤细胞U87-MG以每孔5×10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，在37℃、含5％CO₂的培养箱中孵育24h。

弃掉培养基，分别加入2mL用无血清培养基配制的游离长春花碱、普通长春花碱脂质体、TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体、stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体、功能化长春花碱脂质体溶液，使长春花碱浓度为30nM；空白组加入无血清培养基，置于37℃、含5％CO₂的培养箱中孵育。孵育12h后，用PBS清洗细胞两次，向各孔中加入500μL>

采用流式细胞仪FACScan flow cytometer测定，使用前向角散射和侧向角散射来排除双细胞团块。检测的激发波长为485nm，发射波长为525nm。

各组细胞被诱导产生活性氧的水平结果如图19(1，空白对照；2，游离长春花碱；3，长春花碱脂质体；4，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；5，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；6，功能化长春花碱脂质体)所示，各组活性氧水平顺序为：功能化长春花碱脂质体>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体>长春花碱脂质体>游离长春花碱。

四、对破坏脑胶质瘤细胞微管的损伤效应

将脑胶质瘤细胞U87-MG以每孔2×10⁵个细胞的密度接种于玻底培养皿中，在37℃、含5％CO₂的培养箱中孵育24h。

24h后，弃掉培养基，分别加入1mL用无血清培养基配制的游离长春花碱、普通长春花碱脂质体、TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体、stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体、功能化长春花碱脂质体溶液，使长春花碱浓度为30nM；空白组加入无血清培养基。置于37℃、含5％CO₂的培养箱中孵育。孵育3h后，用PBS清洗细胞两次，加入微管红色荧光探针(Tubulin-Tracker>

各制剂对脑胶质瘤细胞中微管的破坏结果如图20所示，a，空白对照；b，游离长春花碱；c，长春花碱脂质体；d，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；e，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；f，功能化长春花碱脂质体；空白组(图20a)中，能观察到清晰的丝状微管蛋白，微管撑起整个细胞且呈长条梭状，为脑胶质瘤的典型形态。而在功能化长春花碱脂质体组(图20f)中，不能观察到丝状的微管蛋白，整个细胞也丧失了原有形状而变圆。各制剂组对脑胶质瘤细胞中微管破坏能力顺序为：功能化长春花碱脂质体>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体(图20e)>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体(图20d)>长春花碱脂质体(图20c)>游离长春花碱(图20b)。

五、诱导脑胶质瘤细胞凋亡的机制

将脑胶质瘤细胞U87-MG以每孔5×10³个细胞(180uL培养基)的密度接种于96孔细胞培养板中，在37℃、含5％CO₂的培养箱中孵育24h。分别向各组中加入游离长春花碱、普通长春花碱脂质体、TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体、stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体、功能化长春花碱脂质体溶液，使长春花碱浓度为30nM；空白组加入无血清培养基。每组制剂设置6个复孔，于37℃、5％CO₂培养箱中孵育。6h后，弃掉培养基，PBS洗涤2遍，加入4％多聚甲醛固定15min，冷的PBS洗涤2遍；加入含有0.5％Triton>488二抗(1:500稀释)室温避光孵育2h，用PBS浸洗3次，每次2min。再加入核染料Hoechst 33342(5μg/ml)孵育10min，用PBS浸洗3次，每次2min。最后，加入封片液(含90％甘油的PBS)，4℃避光保存。

利用Operetta高内涵筛选系统在20倍目镜下测定每个孔中的荧光强度，并用Columbus system进行数据处理。

1.促凋亡蛋白caspase-3/7

利用Operetta高内涵测定各组细胞中促凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-3/7)的表达情况，用Columbus system进行对各组中荧光强度进行计算。caspase-3/7表达倍数＝实验组荧光强度/空白组荧光强度。结果显示(图21，1，空白对照；2，游离长春花碱；3，长春花碱脂质体；4，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；5，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；6，功能化长春花碱脂质体)，caspase-3/7表达顺序为：功能化长春花碱脂质体(1.24±0.05)>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体(1.15±0.02)>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体(1.13±0.03)>游离长春花碱(1.11±0.01)>长春花碱脂质体(1.03±0.02)。

2.促凋亡蛋白caspase-8

利用Operetta高内涵测定各组细胞中促凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-8)的表达情况，用Columbus system进行对各组中荧光强度进行计算。caspase-8表达倍数＝实验组荧光强度/空白组荧光强度。结果显示(图22，1，空白对照；2，游离长春花碱；3，长春花碱脂质体；4，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；5，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；6，功能化长春花碱脂质体)，caspase-8表达顺序为：功能化长春花碱脂质体(1.28±0.02)>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体(1.24±0.04)>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体(1.22±0.02)>长春花碱脂质体(1.17±0.02)>游离长春花碱(1.10±0.05)。

3.促凋亡蛋白caspase-9

利用Operetta高内涵测定各组细胞中促凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-9)的表达情况，用Columbus system进行对各组中荧光强度进行计算。caspase-9表达倍数＝实验组荧光强度/空白组荧光强度。结果显示(图23，1，空白对照；2，游离长春花碱；3，长春花碱脂质体；4，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；5，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；6，功能化长春花碱脂质体)，caspase-9表达顺序为：功能化长春花碱脂质体(2.20±0.04)>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体(2.09±0.02)>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体(2.00±0.12)>长春花碱脂质体(1.65±0.05)>游离长春花碱(1.57±0.03)。

4.促凋亡蛋白Bax

利用Operetta高内涵测定各组细胞中促凋亡蛋白Bax的表达情况，用Columbussystem进行对各组中荧光强度进行计算。Bax表达倍数＝实验组荧光强度/空白组荧光强度。结果显示(图24，1，空白对照；2，游离长春花碱；3，长春花碱脂质体；4，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；5，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；6，功能化长春花碱脂质体)，Bax表达顺序为：功能化长春花碱脂质体(1.13±0.03)>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体(1.10±0.02)>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体(1.09±0.01)>长春花碱脂质体(1.04±0.03)>游离长春花碱(1.01±0.03)。

5.细胞色素C(Cytochrome C)

利用Operetta高内涵测定各组细胞中细胞色素C(Cytochrome C)的产生量，用Columbus system进行对各组中荧光强度进行计算。Cytochrome C表达倍数＝实验组荧光强度/空白组荧光强度。结果显示(图25，1，空白对照；2，游离长春花碱；3，长春花碱脂质体；4，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；5，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；6，功能化长春花碱脂质体)，Cytochrome>8修饰的长春花碱脂质体(1.47±0.04)>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体(1.40±0.04)>游离长春花碱(1.37±0.02)>长春花碱脂质体(1.29±0.04)。

6.抗凋亡蛋白Mcl-1

利用Operetta高内涵测定各组细胞中抗凋亡蛋白Mcl-1的表达情况，用Columbussystem进行对各组中荧光强度进行计算。Mcl-1表达倍数＝实验组荧光强度/空白组荧光强度。结果显示(图26，1，空白对照；2，游离长春花碱；3，长春花碱脂质体；4，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；5，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；6，功能化长春花碱脂质体)，Mcl-1表达顺序为：长春花碱脂质体(1.03±0.02)>游离长春花碱(0.86±0.03)>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体(0.85±0.03)>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体(0.69±0.02)>功能化长春花碱脂质体(0.54±0.01)。

7.自噬相关蛋白LC3B

利用Operetta高内涵测定各组细胞中自噬相关蛋白(LC3B)的表达情况，用Columbus system进行对各组中荧光强度进行计算。LC3B表达倍数＝实验组荧光强度/空白组荧光强度。结果显示(图27，1，空白对照；2，游离长春花碱；3，长春花碱脂质体；4，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；5，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；6，功能化长春花碱脂质体)，LC3B表达顺序为：功能化长春花碱脂质体(1.55±0.05)>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体(1.48±0.05)>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体(1.45±0.05)>长春花碱脂质体(1.36±0.04)>游离长春花碱(1.34±0.05)。

8.自噬相关蛋白FoxO1

利用Operetta高内涵测定各组细胞中自噬相关蛋白(FoxO1)的表达情况，用Columbus system进行对各组中荧光强度进行计算。FoxO1表达倍数＝实验组荧光强度/空白组荧光强度。结果显示(图28，1，空白对照；2，游离长春花碱；3，长春花碱脂质体；4，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体；5，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体；6，功能化长春花碱脂质体)，FoxO1表达顺序为：功能化长春花碱脂质体(1.14±0.02)>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体(1.09±0.01)>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体(1.08±0.02)>游离长春花碱(1.05±0.01)>长春花碱脂质体(1.03±0.01)。

上述结果显示，(1)功能化长春花碱脂质体对脑胶质瘤细胞及其干细胞均具有最强的凋亡诱导效应，且主要体现在凋亡早期，而凋亡晚期无明显变化；(2)功能化长春花碱脂质体对脑胶质瘤细胞的细胞和及线粒体损伤最大；(3)各组活性氧水平顺序为：功能化长春花碱脂质体>stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体>TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体>长春花碱脂质体>游离长春花碱；(4)功能化长春花碱脂质体有着最强的破坏脑胶质瘤细胞中微管的能力；(5)功能化长春花碱脂质体能显著提高促凋亡蛋白caspase-3/7、caspase-8、caspase-9、Bax及细胞色素C(Cytochrome>

实施例5、在裸鼠体内抗脑胶质瘤及其干细胞效应

一、荷脑胶质瘤裸鼠模型的建立与评价

1.动物

BALB/c雄性裸鼠数只，起始体重约为18-20g。

2.细胞准备

细胞处于对数生长期，消化后用无血清培养基中重悬细胞，制备为每3μL含2×10⁵个U87-MG脑胶质瘤细胞，并将细胞悬液于4℃冰浴放置，待用。

3.脑胶质瘤细胞接种方法

采用脑立体定位技术，将脑胶质瘤干细胞接种于BALB/c裸鼠的颅脑内，建立脑胶质瘤原位瘤动物模型，操作步骤如下：

(1)称重；

(2)麻醉，固定：用4％水合氯醛(1mL/100g)腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上；

(3)消毒、切口与钻孔：用75％酒精消毒小鼠头顶皮肤，沿内眦连线中点向后纵向切开头皮1cm，暴露颅骨。根据脑立体定位图谱：前囟后1.0mm，矢状缝右2.0mm的颅骨上，以电钻钻孔，为防止刺破硬脑膜，仅准许钻透颅骨深1.0-1.5mm；

(4)右脑尾状核内接种脑胶质瘤干细胞：使用20μL微量注射器吸入3.0μL脑胶质瘤干细胞悬液(约含6×10⁵个细胞)，垂直进针深3.5mm(距硬脑膜)，静置1min后返回0.5mm，以1μL/min速率将3.0μL细胞悬液注入尾状核内。注射完毕后留针5min，缓慢拔针，骨孔立即用无菌骨蜡封闭，术野用生理盐水冲洗，逢合切口。

每日定时检查其意识、接触反应、运动缺陷、颅神经损害、视觉反应，观察有无偏瘫、苍老和癫痫发作。手术后约两周时，可观察明显病理特征，判断是否可用于给药。

4.模型评价

12天后，对麻醉后的正常BALB/c雄性裸鼠和荷瘤裸鼠进行100ml PBS及100ml 4％的多聚甲醛心脏灌流，取出脑组织，按接种穿刺点做切口并做连续冰冻切片(4μm)，并进行尼氏染色，利用Caikon XDS-300C系统观察。

对脑胶质瘤荷瘤裸鼠进行常规观察，发现裸鼠自接种脑胶质瘤细胞后0.5h苏醒。手术5天后，荷瘤裸鼠进食减少伴饮水增多，动作减少，体重逐渐减轻，随后出现双侧或对侧的反射损害，通常以后肢更为明显，皮肤变灰暗；在后期阶段(约第10天)，荷瘤裸鼠表现为面部不洁、呈苍老面容、精神不振，对刺激反应慢，身体呈蜷缩状，颈部凹陷，偶有癫痫发作。

利用病理学检查评价体内脑胶质瘤模型，结果显示，正常脑组织(图29)经尼氏染色后可见细胞稀疏，各区域特征明显；而接种脑胶质瘤的脑组织(图30)经尼氏染色后可见脑胶质瘤细胞密集堆积成群，呈侵袭性生长。说明体内脑胶质瘤模型建立成功。

二、荷瘤裸鼠的活体成像

1.DiR脂质体的制备

精密称取各组脂质体材料和DiR，按DiR：脂材＝1:500(w/w)加入到茄形瓶中，溶解于适当体积的甲醇中，通过旋转蒸发40℃真空干燥除去甲醇，在茄形瓶底部及内壁形成一层薄薄的均匀膜。再向茄形瓶中加入适量的HEPES缓冲液(10mM，pH7.4，150mM NaCl)在60℃水浴中水化30min，冷却至室温，过量的DiR通过0.2μm的聚碳酸酯膜过滤除去，即得DiR标记的靶向性脂质体。

2.在荷瘤裸鼠体内的活体成像

接种脑胶质瘤细胞12天后，将成功建立脑胶质瘤模型的荷瘤小鼠模随机分成5组，每组3只分别尾静脉注射给药，给药方案如下：

(1)生理盐水空白对照组；

(2)游离DiR组(2.0mg/kg)；

(3)TfR-T₁₂修饰的DiR脂质体组(2.0mg/kg)；

(4)stearyl-R₈修饰的DiR脂质体组(2.0mg/kg)；

(5)功能化DiR脂质体组(2.0mg/kg)；

给药后1、3、6、12、24、48h，利用IVIS Spectrum Pre-clinical In Vivo ImagingSystem考察DiR标记的功能化脂质体在小鼠体内实时定位情况。并于48h后，处死每组小鼠，立即取出心、肝、脾、肺、肾和荷瘤脑组织，对不同组织进行成像。

DiR标记的功能化脂质体在脑胶质瘤荷瘤裸鼠体内的靶向效应及药物实时分布如图31所示，a，生理盐水组；b，游离DiR；c，TfR-T₁₂修饰的DiR脂质体；d，stearyl-R₈修饰的DiR脂质体；e，功能化DiR脂质体。功能化DiR脂质体组(图31e)中，1h时，脑部荧光强度最大，其他部位分布均匀，随着时间的增加，脑部荧光略有减弱，肝脏部位荧光在3h时最强，之后随着时间减弱，其它部位未见显著的药物荧光；生理盐水组(图31a)中未见荧光；游离DiR组(图31b)中，荧光集中在肝脏部位，荧光强度随着时间的增加而增强，脑部未见荧光；TfR-T₁₂修饰的DiR脂质体组(图31c)和stearyl-R₈修饰的DiR脂质体组(图31d)中，脑部均有一定的荧光，肝脏部位荧光强度最大，其它部位也具有一定荧光。

DiR标记的功能化脂质体在脑胶质瘤荷瘤裸鼠各组织48h时药物分布如图32所示，a，生理盐水组；b，游离DiR；c，TfR-T₁₂修饰的DiR脂质体；d，stearyl-R₈修饰的DiR脂质体；e，功能化DiR脂质体。各组中，功能化DiR脂质体组(图32e)中脑部荧光最强，TfR-T₁₂修饰的DiR脂质体组(图32c)中脑部也具有较强荧光，stearyl-R₈修饰的DiR脂质体组(图32e)中脑部具有微弱荧光，生理盐水组(图32a)游离DiR组(图32b)中脑部未见荧光。除生理盐水组，其余各组中心、肝、脾、肺、肾都有一定荧光，但主要均集中在肝脏。

三、在荷瘤裸鼠体内的抗脑胶质瘤效应

1.生存期考察

接种脑胶质瘤细胞12天后，将成功建立脑胶质瘤模型的荷瘤小鼠模随机分成6组，每组9只分别尾静脉注射给药，给药方案如下：

(1)生理盐水空白对照组；

(2)游离长春花碱组(50μg/kg)；

(3)长春花碱脂质体组(50μg/kg)；

(4)TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体组(50μg/kg)；

(5)stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体组(50μg/kg)；

(6)功能化长春花碱脂质体组(50μg/kg)；

每三天给一次药，共给药三次。给药后，每组取9只鼠，每天对荷瘤裸鼠行为状态进行观察，记录其活动状况、症状、死亡日期，考察生存曲线。绘制卡普兰-迈耶生存曲线(Kaplan-Meier survival curves)，并计算生存时间中位值(the median survivaltimes，MeST)及生存时间平均值(the mean survival times，MST)。按以下公式计算生存期增加百分比(the percentage-increased life span，ILS％)：

t：代表接受治疗的裸鼠，U：代表未接受治疗的裸鼠。

图33为脑胶质瘤荷瘤裸鼠接受各个制剂组治疗后的卡普兰-迈耶生存曲线，a，生理盐水组；b，游离长春花碱组；c，长春花碱脂质体组；d，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体组；e，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体组；f，功能化长春花碱脂质体组。结果显示，功能化长春花碱脂质体组具有最大的中位生存期(29天)，比生理盐水组(19天)增加了52.63％。此外，与生理盐水组相比，游离长春花碱组(20天)增加了5.26％，长春花碱脂质体组(21天)增加了10.53％，TfR-T₁₂修饰的长春花碱脂质体组(26天)增加了36.84％，stearyl-R₈修饰的长春花碱脂质体组(27天)增加了42.11％。结果表明，与对照制剂相比，功能化长春花碱脂质体能够显著提高对脑胶质瘤荷瘤裸鼠脑肿瘤的治疗作用。

2.体内抗脑胶质瘤干细胞效应

按照上述方法接种脑胶质瘤细胞并给药治疗后，取生理盐水空白对照组、长春花碱脂质体组和功能化长春花碱脂质体组荷瘤裸鼠各三只，以未接种脑胶质瘤细胞的健康裸鼠为阴性对照组，麻醉后经生理盐水及4％多聚甲醛心脏灌流，取出脑组织(同时取出心、肝、脾、肺、肾备用)，蔗糖脱水过夜。按小鼠脑表面接种穿刺点作为切口，做连续冰冻切片(4μm)。

将切片浸于0.2％Triton X-100溶液里30min进行细胞打孔后，转移至含10％山羊血清的PBS溶液中封闭5h，用anti-nestin antibody(1：100稀释)在4℃条件下孵育过夜，再用anti-rabbit secondary antibody conjugated with Alexafluor-488(1：500稀释)和Hoechst 33342((5μg/mL))孵育1h。利用激光共聚焦扫描显微镜进行观察各组中脑胶质瘤干细胞情况。

采用干细胞标记物nestin进行免疫荧光染色，用以评价给药后荷瘤裸鼠脑部脑胶质瘤干细胞的数量。免疫荧光染色结果如图34所示，a，正常脑组织；b，注射生理盐水的荷脑胶质瘤脑组织；c，注射长春花碱脂质体的荷脑胶质瘤脑组织；d，注射功能化长春花碱脂质体的荷脑胶质瘤脑组织，蓝色荧光为被Hoechst 33342染色的细胞核，通过对所有脑组织细胞标记勾勒出全脑形态；绿色荧光为nestin染色区域，可以用于指示脑胶质瘤干细胞。从图中可以看出，正常大脑皮层组织(未接种脑胶质瘤细胞)区域，细胞核分布均匀且较为稀疏；而肿瘤组织区域，细胞核分布致密，能看出脑胶质瘤区域。各个制剂组的治疗效果，可以用nestin表达区域占全脑区域的比率作为评价标准。结果显示，功能化长春花碱脂质体组中，被nestin标记的荧光区域最少，在局部图中，观察到肿瘤细胞较少且分布稀疏；而在生理盐水组中，被nestin标记的荧光区域较大，占到了右脑约二分之一的面积，局部图中细胞较为密集；长春花碱脂质体中，被nestin标记的荧光区域较功能化长春花碱脂质体组多，且在脑部发生了转移形成了两个病灶，局部图显示细胞非常密集。各制剂组体内抗脑胶质瘤干细胞效应排序为：功能化长春花碱脂质体组>长春花碱脂质体组>生理盐水组。

四、安全性评价

将上述中所取的心、肝、脾、肺、肾组织4％的多聚甲醛固定，制备为石蜡切片(4μm)，进行HE(hematoxylin-eosin)染色，并利用Caikon XDS-300C系统观察。

结果如图35所示，a，生理盐水组；b，功能化长春花碱脂质体组与生理盐水组的各组织HE染色结果相比较，功能化长春花碱脂质体组裸鼠各组织未出现明显的病理改变。

综上所述，经功能性载体材料TfR-T₁₂-PEG₂₀₀₀-DSPE和stearyl-R₈同时修饰的功能化脂质体具有最明显的肿瘤区域药物蓄积和最强的抗脑胶质瘤及脑胶质瘤干细胞效果，能显著增加荷瘤裸鼠的生存时间。