产甘油假丝酵母热休克蛋白基因CgHsp10及其应用

摘要

本发明属于酵母基因工程领域，公开了一种源于产甘油假丝酵母Candida glycerinogenes CCTCC M93018的热休克蛋白基因CgHsp10，在Saccharomyces cerevisiae中过表达该基因，可显著提高S.cerevisiae的热耐受性。其核苷酸序列为与如序列表SEQ ID NO.1中所示的DNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列表SEQ ID NO.1中所示的DNA序列相同功能的DNA序列；最优选DNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示。本发明在利用基因工程技术提高S.cerevisiae热耐受性上有重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及产甘油假丝酵母C.glycerinogenes CCTCC M93018基因CgHsp10及其应用,利用基因CgHsp10在S.cerevisiae中过表达，提高S.cerevisiae对热胁迫的耐受力，属于基因工程技术领域。

背景技术

提高工业酵母菌株耐热性，可有效降低冷却水使用及能耗，降低生产成本，同时可以有效降低染菌几率。为提高酵母细胞耐热性，传统的育种技术高温驯化、自然选育、诱变育种等方法曾发挥重要作用，但其不稳定性、无方向性等缺点显而易见。现代基因工程技术定向改造菌株提高其耐热性发挥重要作用。在酵母中热休克应答的调节主要是在表达水平和转录水平上进行，生物耐热性的获得与热激蛋白的合成有着密切的正相关性。热休克蛋白是在所有生物如古生菌，细菌和真核生物中发现的超家族。它可以作为分子伴侣，结合部分变性的蛋白质，协助变性蛋白质的降解，并且还可以阻止由各种环境压力诱导引起的蛋白质不可逆的聚集，帮助细胞适应外界压力环境。热休克蛋白的过度表达可以保护微生物免受外界高温压力对细胞的损伤。不同酵母的遗传背景不同，同源基因序列在过表达过程中存在一定的优劣差异，从耐热酵母菌株中筛选获得通用耐热基因，在其他酵母中过表达该基因可提高其耐热性，这种通用耐热基因的筛选对改造酵母耐热性具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供C.glycerinogenes CCTCC M93018热休克蛋白基因CgHsp10及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明首先筛选获得耐热基因，申请人将其命名为CgHsp10基因，通过在S.cerevisiae中过表达增加酵母耐热性。

申请人通过基因组表达文库筛选，序列比对，结构分析，克隆方法获得一种来源于C.glycerinogenes CCTCC M93018具有抗热性的CgHsp10基因。

基因CgHsp10氨基酸序列为与如序列表SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列在相似性在90％以上，优选在95％以上，更优选在98％以上且具有与如序列表SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。

基因CgHsp10的DNA序列，优选所述DNA序列为与如序列表SEQ ID NO.1中所示的DNA序列的相似性在75％以上，进一步优选在85％以上，更优选在95％以上且具有与如序列表SEQ ID NO.1中所示的DNA序列相同功能的DNA序列；最优选所述DNA序列如序列表SEQ IDNO.1所示。

其中克隆所述CgHsp10基因的特异上游引物CgHsp10F(SEQ ID NO.2)和下游引物CgHsp10R(SEQ ID NO.3)，其核苷酸序列如下所示(见序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3)：

申请人建立了一种利用CgHsp10基因提高S.cerevisiae耐热性的方法，其包括如下步骤：

1)设计权利要求2所述的引物，从C.glycerinogenes CCTCC M93018基因组中克隆具有耐热性基因CgHsp10，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

2)构建CgHsp10基因过量表达载体，并将该载体转化到S.cerevisiae中；

3)采用基因组PCR检测方法对步骤2)的重组S.cerevisiae进行鉴定；

4)进一步通过42℃梯度稀释点板生长，高温热激(70℃)后的存活率统计，42℃液体培养基培养下的生长情况分析鉴定重组S.cerevisiae的耐热性。

权利要求1-4所述的基因在提高酵母耐热性中的应用。

权利要求2所述的引物在提高酵母耐热性中的应用。

在S.cerevisiae中过表达基因CgHsp10,可以提高S.cerevisiae在高温条件下的存活率和生长能力，进而提高S.cerevisiae对热胁迫的耐受力。

本发明取得的有益效果如下：本发明利用C.glycerinogenes CCTCC M93018基因CgHsp10来提高对热胁迫的耐受力，在S.cerevisiae中过表达基因CgHsp10,可以提高S.cerevisiae在热激条件下的存活率,从而提高S.cerevisiae的热耐受性。

附图说明

图1是过表达C.glycerinogenes CCTCC M93018基因CgHsp10的重组S.cerevisiae在42℃梯度稀释点板生长情况，实验经过三次以上重复。

图2是过表达C.glycerinogenes CCTCC M93018基因CgHsp10的重组S.cerevisiae高温热激(70℃)后的存活率统计结果，实验经过三次以上重复。

图3中：A图是过表达C.glycerinogenes CCTCC M93018基因CgHsp10的重组S.cerevisiae在42℃培养下的生长情况。B图是重组S.cerevisiae在42℃培养过程中存活率情况。实验均经过三次以上重复。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明。

实施例

1、C.glycerinogenes CCTCC M93018基因CgHsp10

本发明者根据C.glycerinogenes CCTCC M93018表达基因组文库转化S.cerevisiae筛选耐热性提高的重组菌株，经酵母质粒提取(酵母质粒提取试剂盒购自BBI公司)，核苷酸序列测序(由上海生物工程有限公司完成测序)，获得大量潜在的耐热相关核苷酸序列。通过核苷酸序列及氨基酸序列比对(由Basic Local Alignment Search Tool，clustalX2等分析软件完成)，及其结构分析(由TMHMM-2.0，Swiss-model等软件完成)，获得基因完整的开放阅读框，扩增该片段，反应体系如下(50μl)：25μl Prime STAR Max Premix(2×),15pmol引物，150ng模板，加双蒸水至50μl(引物为上海生工生物工程有限公司合成，其余购自TaKaRa公司)，扩增反应条件如下：98℃，10s；55℃，15s，72℃，1kb/min，30个循环。扩增产物电泳完毕后采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程有限公司)进行切胶回收。回收程序按照试剂盒说明：用刀片切出目标片段放入1.5ml的离心管，加结合缓冲液，置于55℃水浴加热10min，每2min混匀一次；胶完全融化后转移至套在收集管内的UNIQ-10柱中，室温放置2min；8,000rpm，离心1min；倒掉收集管中的废液，加入500μl冲洗液，8,000rpm室温离心1min，将该步骤重复一次；倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，12,000rpm离心15sec；将UNIQ-10柱放入一根新的1.5ml的离心管中，在柱子膜中央滴加50μl的双蒸水，室温放置3min；12,000rpm离心1min，离心管中的液体即为回收的DNA片段。回收的目标片段双酶切后连接pYX212表达载体，使用T4连接酶(购自TaKaRa公司)按照说明书指示完成连接工作,并将连接产物转化大肠杆菌，收集平板上菌体，提取质粒(质粒抽提试剂盒购自上海生工生物工程有限公司)，并转化酿酒酵母：转化方法采用醋酸锂转化法。步骤如下：S.cerevisiae接入YEPD液体培养基中30℃摇瓶培养(200r/min)，当OD₆₀₀值达到3-4后，离心收集菌体，无菌双蒸水洗涤2次。重悬于转化体系：240μl>

2、过表达热休克蛋白基因CgHsp10的S.cerevisiae重组菌，在YEPD液体培养基中30℃、200r/min条件下培养12小时后，(1)以2％的接种量接种于尿嘧啶缺陷型液体培养基中，分别在30℃和42℃、200r/min条件摇瓶培养，测定重组S.cerevisiae高温生长情况及存活率(42℃下活细胞数/30℃下活细胞数)；(2)稀释OD₆₀₀至1，以10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5梯度稀释，点板培养(42℃下YEPD固体培养基)；(3)收集菌体，70℃热激30min，测细胞存活率(热激后活细胞数/热激前活细胞数)。

通过实施例2证实,在S.cerevisiae中过表达C.glycerinogenes CCTCC M93018基因CgHsp10,可以提高S.cerevisiae的热耐受性，同时提高其42℃下生长能力。

以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换均应属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 江南大学

<120> Candida glycerinogenes热休克蛋白基因CgHsp10及其应用

<130> 2017.12.4

<141> 2017-12-12

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 309

<212> DNA

<213> 产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)

<400> 1

atgtctttca tcaagtctgc caagtccatt cttccaactc ttgacagggt tctcgttcaa 60

agaatcaagg ttcctcaaca aacctcttcc ggtatctata ttccagaaca aaacttacca 120

aagaacaacg ttgccaccgt tattgcagtc ggtcctggct tcaagactgc agagggcaaa 180

ctaattgagc ctaccttgaa tgccggcgac aaggtgctca ttcctcaaca cggcggtacc 240

ccagtcaccg ttgagaagga cgaattttta ctcttcagag atgctgatat tcttgccaag 300

atcaatgaa 309

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)

<400> 2

ggaattcatg tctttcatca agtctgcc 28

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)

<400> 3

cccaagcttt cattcattga tcttggcaag aatat 35

<210> 4

<211> 103

<212> PRT

<213> 产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes )

<400> 4

Met Ser Phe Ile Lys Ser Ala Lys Ser Ile Leu Pro Thr Leu Asp Arg

1 5 1015

Val Leu Val Gln Arg Ile Lys Val Pro Gln Gln Thr Ser Ser Gly Ile

202530

Tyr Ile Pro Glu Gln Asn Leu Pro Lys Asn Asn Val Ala Thr Val Ile

354045

Ala Val Gly Pro Gly Phe Lys Thr Ala Glu Gly Lys Leu Ile Glu Pro

505560

Thr Leu Asn Ala Gly Asp Lys Val Leu Ile Pro Gln His Gly Gly Thr

65707580

Pro Val Thr Val Glu Lys Asp Glu Phe Leu Leu Phe Arg Asp Ala Asp

859095

Ile Leu Ala Lys Ile Asn Glu

100