一种人肺癌A549衍生细胞株及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种人肺癌A549衍生细胞株，该细胞株命名为人非小细胞肺癌细胞系A549‑SE06，其保藏编号为CGMCC No.14315。此外，本发明还公开了该细胞株的制备方法及其用途。本发明可用于分析肺癌细胞突变后的形态学及生物学表型的变化；研究影响肿瘤细胞增殖侵袭过程的分子机制及分子表达变化；研究相关分子蛋白与患者临床表现之间的联系及其对患者预后的影响；包括在研究肺癌肿瘤细胞增殖分子机制和特定蛋白分子对临床预后影响中的应用；在制备肺癌肿瘤动物模型中的应用；在制备肺癌诊断试剂中的应用；以及在开发肺癌肿瘤药物靶点中的应用。经实验验证，本发明人肺癌A549衍生细胞株A549‑SE06比A549细胞株具有更快的增殖速率和更强的增殖能力，生长速度加快，裸鼠成瘤时间缩短。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种肺癌细胞株，尤其涉及一种人肺癌A549衍生细胞株，此外本发明还涉及一种人肺癌A549衍生细胞株的制备方法和用途。

背景技术

肺癌作为一种常见的恶性肿瘤，在每年新生癌症人群中，肺癌患者所占比例大约为12.7%，男女患者所占比例为2.1:1，大约75%的病人确诊时年纪在60岁或以上。肺癌患者普遍具有较差预后，患者五年生存率在6-18%之间。为进一步研究肺癌的发生和发展机制，申请人于中科院细胞库购得A549细胞系，在裸鼠上进行动物实验研究。该A549细胞系由D.J.Griad通过肺癌组织移植培养建系，患者为58岁白人男性，主要用于肺癌的相关研究当中，如研究药物对肺癌细胞的杀伤作用或用于裸鼠成瘤。实验最初成瘤率稳定，经多次传代后，成瘤能力逐步减弱，直至完全不成瘤，我们于2016年5月份接种5只裸鼠腋部皮下进行成瘤实验，2个月内均未见成瘤，小鼠未处理，第四月准备处理小鼠时发现5只裸鼠中有四只成瘤，继续观察发现肿瘤生长迅猛，处死小鼠，肿瘤研磨培养，待细胞生长状态良好时，单克隆分选肿瘤细胞株，分离后的细胞与原A549细胞进行对照试验并做了细胞鉴定，发现该细胞为A549细胞突变系，western bloting检测发现突变系细胞部分蛋白表达异常，突变系细胞与原A549细胞进行动物实验发现突变系细胞肿瘤生长迅猛，原A549细胞成瘤率极低，生长不均一。此A549突变系可用于替代原A549细胞，以用于肺癌临床前研究。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种人肺癌A549衍生细胞株。

本发明解决的技术问题之二是提供一种人肺癌A549衍生细胞株的制备方法。

本发明解决的技术问题之三是提供一种人肺癌A549衍生细胞株的用途。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供一种人肺癌A549衍生细胞株，该细胞株命名为人非小细胞肺癌细胞系A549-SE06，其保藏编号为CGMCC No. 14315。该人肺癌A549衍生细胞株已于2017年8月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏编号为CGMCC No.14315. 保藏地点：中国，北京）。

所述人非小细胞肺癌细胞系A549-SE06的生物学特性为：细胞呈上皮样，多角形，贴壁生长，细胞圆润饱满，生长迅速，该细胞周期各时相的细胞百分率分别为G₀-G₁期35.45%，S期47.25%，G₂-M期17.30%，表现出肿瘤细胞增殖特性。

在本发明的第二方面，提供一种人肺癌A549衍生细胞株的制备方法，包括以下步骤：步骤一，人肺癌A549细胞系接种于裸鼠皮下，数月后成瘤；步骤二，取所成瘤块，剪切消化后，加入1640培养基中培养；步骤三，经过多次贴壁纯化、挑选单克隆后得到单一细胞，即为人肺癌A549衍生细胞株。

作为本发明优选的技术方案，上述人肺癌A549衍生细胞株的制备方法具体包括如下步骤：

（1）人肺癌A549细胞系接种于裸鼠皮下，数月后成瘤；

（2）取A549裸鼠皮下所成瘤块，剪切消化后，离心去除胰蛋白酶，转移至细胞培养瓶中，加入1640培养基；

（3）培养一段时间，当有大量细胞贴壁后，去除瓶内组织，加入1640培养液；

（4）当细胞生长至70-80%左右时，用胰蛋白酶消化液消化细胞，离心后用不含血清的培养基重悬；将细胞悬液加入培养瓶中，静置15-20min，在倒置显微镜下观察,见部分细胞贴壁,稍加摇动也不浮起时,将细胞悬液导入另一培养瓶中；

（5）多次重复上述步骤（4）中的过程，逐渐将成纤维细胞和其他细胞分隔开，对最后一批悬液贴壁得到的细胞挑取单克隆，得到分离纯化的人肺癌A549衍生细胞株。

作为本发明优选的技术方案，步骤（2）、（3）、（4）、（5）的培养条件为： 37℃、5%CO₂、95%湿度条件下培养。

在本发明的第三方面，提供该人肺癌A549衍生细胞株的用途，包括在研究肺癌肿瘤细胞增殖分子机制和特定蛋白分子对临床预后影响中的应用；在制备肺癌肿瘤动物模型中的应用；在制备肺癌诊断试剂中的应用；以及在开发肺癌肿瘤药物靶点中的应用。本发明可用于分析肺癌细胞突变后的形态学及生物学表型的变化；研究影响肿瘤细胞增殖侵袭过程的分子机制及分子表达变化；研究相关分子蛋白与患者临床表现之间的联系及其对患者预后的影响。

对本方法建立的A549衍生细胞株进行形态学观察及生物学特性鉴定，结果显示A549衍生细胞株细胞形态有细微变化，生长速度加快，裸鼠成瘤时间缩短。经实验验证，本发明人肺癌A549衍生细胞株A549-SE06比A549细胞株具有更快的增殖速率和更强的增殖能力。

附图说明

图1是本发明实施例2中倒置显微镜下A549细胞的观察图（×100）；

图2是本发明实施例2中倒置显微镜下A549-SE06细胞的观察图（×100）；

图3是本发明实施例2中A549细胞和A549-SE06细胞的增殖曲线图；

图4是本发明实施例2中A549细胞的周期结果图；

图5是本发明实施例2中A549-SE06细胞的周期结果图；

图6是本发明实施例2中A549细胞和A549-SE06细胞的动物成瘤结果图。

代号为A549-SE06的人非小细胞肺癌细胞系已于2017年8月18日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏编号为CGMCC No. 14315；保藏地点：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所）。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1

本发明采用多次贴壁、挑选单克隆的纯化方法建立人肺癌A549衍生细胞株。具体步骤如下：

（1）人肺癌A549细胞株（购自中国科学院上海细胞库，由本实验室冻存），复苏后用DMEM培养液（含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml）于37℃、5%CO₂、95%湿度条件下培养；

（2）取对数生长期A549细胞用胰蛋白酶消化液消化，计数，调整密度为每只裸鼠5×10⁶/200μl，混匀在生理盐水中，接种于裸鼠皮下。裸鼠在实验设定时间内未长出瘤块，继续饲养数月后，裸鼠突然成瘤。取瘤块进行剪切消化后，加入1640培养基（含10%胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml）于37℃、5%CO₂、95%湿度条件下培养；

（3）培养一段时间，观察到有大量细胞贴壁后，去除瓶内组织，加入新的1640培养液；

（4）当细胞生长至80%左右时，用胰蛋白酶消化液消化细胞，离心后用不加血清的1640培养基（Gibco，61870036）重悬。将细胞悬液加入培养瓶中，静置20min，在倒置显微镜下观察，见部分细胞贴壁，稍加摇动也不浮起时，将细胞悬液导入另一培养瓶中。

（5）多次重复上述步骤（4）中的过程，逐渐将成纤维细胞和其他细胞分隔开，对最后一批悬液贴壁得到的细胞挑取单克隆，得到分离纯化的人肺癌A549衍生细胞株。

当细胞生长稳定后，冻存部分细胞于液氮中，冻存液按FBS：1640培养基：DMSO比例5:4:1配比得到，冻存过程逐步降温，采取4℃ 30分钟→20℃ 1小时→-80℃过夜→液氮的顺序进行。冻存细胞的复苏按以下程序进行：在一个10cm的细胞培养皿中加入至少10ml含10% 胎牛血清的培养液；从液氮中取出装有细胞的冻存管，立即放入37℃水浴轻轻摇动使冻存物在1分钟内解冻，用酒精棉球擦拭冻存管外壁后拿入超净台；将解冻后的细胞悬液离心，去除冻存液，用1640培养液重悬。将细胞悬液移入已加了培养液的培养皿中，稍加摇动混匀，平放入二氧化碳培养箱中，在37℃、5% CO₂、95%湿度条件下培养，约24小时细胞贴壁后换新鲜培养液5-10ml继续培养。

实施例2 对应用本发明的方法建立的人肺癌A549衍生细胞株进行形态学观察及生物学特性鉴定：

1. 显微镜观察细胞形态

取对数生长期 A549细胞和 A549衍生细胞各一瓶，换液后在倒置相差显微镜下观察活细胞形态并照像。A549细胞如图1所示，A549-SE06衍生细胞如图2所示。如图2所示，本发明人非小细胞肺癌细胞系A549-SE06的细胞呈上皮样，多角形，贴壁生长，细胞圆润饱满，生长迅速。

2. CCK8比色法测定细胞增殖速率

分别取对数生长期A549细胞和 A549衍生细胞，细胞消化、计数、调整细胞密度为3×10⁴个/mL，接种于96孔培养板中，100μl/孔。置37℃、CO₂体积分数为5%的恒温培养箱中培养。分别在0h、24h、48h和72h>

3. 流式细胞仪检测细胞周期

取对数生长期A549细胞和 A549-SE06细胞铺6cm培养皿，24h后用胰蛋白酶消化细胞，将细胞离心至1.5mlEP管底部。加1ml -20℃预冷的70%乙醇（PBS配置）固定细胞，将固定的细胞放置于-20℃过夜，第二天取出细胞，1000rpm x 5min离心去除乙醇并用PBS漂洗一次，去掉残存的乙醇。管中剩余少许PBS，将细胞混匀后加入300ul含有10ug/ml RNase的PI溶液重悬细胞，避光30min后进行流式检测。细胞周期如图 4和图 5所示，细胞周期分布见表1 ：结果显示A549-SE-06细胞株的S期细胞明显增多，为47.25%，而A549细胞为45.85%; A549-SE-06细胞的G0-G1期细胞明显减少，提示A549-SE-06细胞具有更强的增殖能力。

表1 A549和A549-SE-06细胞周期分布表

4. 裸鼠皮下接种观测细胞成瘤能力

取对数生长期A549细胞和 A549-SE06细胞，计数，调整密度为每只裸鼠5×10⁶/200μl，混匀在生理盐水中，分别皮下接种于同一只裸鼠的左右两侧。比较两种细胞成瘤能力，如图6所示，A549-SE06细胞成瘤大于A549细胞成瘤，结果显示本发明A549-SE06细胞加快了瘤的生长速度，裸鼠成瘤时间缩短。