一种竹叶兰内生真菌的分离纯化方法及其应用

摘要

本发明公开一种竹叶兰内生真菌的分离纯化方法及其应用，属于药用植物内生菌研究领域。利用本发明的方法从云南昆明采集带土的新鲜竹叶兰样品中分离纯化得到的菌株发酵产物在抗菌、抗氧化方面具有良好作用尤其是对革兰氏阳性、阴性细菌和植物病原真菌的抑制作用，可以较好地应用于细菌感染以及农业病害防治。通过从药用植物竹叶兰的内生菌中发现活性较好地次级代谢产物，大大提高了研究效率，缩短了研究周期。本发明的方法工艺简单，效率高，并且活性较好，培养大大缩短。可用于活性单体化合物的分离及应用。

说明书

技术领域

本发明属于药用植物内生菌研究领域，具体的说，本发明涉及一种竹叶兰内生真菌的分离纯化，以及其发酵产物抗菌、抗氧化方面的应用，尤其是对革兰氏阳性、阴性细菌和植物病原真菌的抑制作用，可以较好地应用于细菌感染以及农业病害防治。

背景技术

竹叶兰(Arundina graminifolia(D.Don)Hochr.)为兰科竹叶兰属植物，别名长杆兰、百样解，是傣族常用解药，常用于治疗疮痈肿毒、毒蛇咬伤、跌打损伤等。菌根真菌可以侵入根被(皮层)组织形成内生菌根，自然界中,几乎所有的兰科植物都与真菌共生形成菌根，植物内生菌(Endophyte)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌。由于与植物协同进化，所以人们期望从内生菌内找到与宿主植物具有相同或相似的化学成分，以保护濒危药用植物物种，缩短研究周期，提高发现新药的效率。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种竹叶兰内生真菌的分离纯化方法。通过结合ITS序列比对与系统发育树归属，对其进行分子生物学鉴定，结果表明其序列与Fusarium Proliferatum同源性≧99％，因此，鉴定其为层出镰刀菌。

本发明的另一目的在于提供通过上述方法获得的竹叶兰内生真菌发酵产物的应用，通过测试对革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌活性，以及对菜心炭疽、稻瘟菌等14种植物病原真菌的抑菌活性，发现该真菌的次级代谢产物具有广谱抑菌性。

利用DPPH法测试竹叶兰内生真菌发酵产物的抗氧化性能，发现其具有很好的抗氧化性。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种竹叶兰内生真菌的的分离纯化方法，所述竹叶兰是在云南采集的无病虫害的新鲜野生竹叶兰；所述分离方法中，消毒酒精的浓度为75％，次氯酸钠溶液的浓度为1％，消毒时间为2～5min，所用固体培养基采用改良PDA固体培养基。

优选的，培养基采用PDA综合固体培养基，能够分离得到更多的内生真菌；

一种竹叶兰内生真菌的的分离纯化方法，包括如下步骤：

(1)采样：从云南昆明采集带土的新鲜竹叶兰样品，装入密封袋，低温保存；

(2)消毒处理：新鲜竹叶兰放在流动的自来水下面冲洗干净，用无菌滤纸擦干通过经典的表面消毒法对竹叶兰的根、茎、叶进行消毒处理；

根、茎、叶：自来水表面清洗4～5次→消毒纸巾吸干水分→75％酒精漂洗2min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分→1％次氯酸钠溶液漂洗5min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分(叶片仅用酒精消毒)；

(3)培养：无菌条件下将叶片切成5mm×5mm大小，根、茎切成5mm长度，置于改良PDA固体培养基平板上28℃避光恒温培养；最后一次冲洗无菌水设为对照培养，若无菌落生长则说明样品消毒彻底；

(4)纯化：将所得到的内生真菌分别转接至改良PDA固体培养基，根据菌落的颜色、形态不同，挑取单菌落，反复培养、纯化，得到纯菌株TJ-3，名称为层出镰刀菌(FusariumProliferatum)TJ-3；

(5)保存菌种：将纯化后的真菌菌丝用无菌水轻轻洗脱，菌丝及孢子悬浮液按1:1的比例与50％的甘油混匀，-20℃保存(长期保存)；同时把真菌菌丝挑取至改良PDA固体斜面培养基上培养，4～5d后，置于5℃冰箱保存(1～2月转接一次)；

优选的，步骤(3)、(4)、(5)中所用到的改良PDA固体培养基是在标准PDA固体培养基的基础上加入适量微量元素进行改良的，配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，七水硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3.0g，维生素B1>

TJ-3发酵产物的制备，即对TJ-3菌株进行液体扩大培养，包括如下步骤：

1)扩大培养：将在改良PDA固体斜面培养基上培养好的真菌菌落，用无菌水冲洗，轻轻刮取菌丝，按10％的接种量接种至液体发酵培养基中，28℃，转速采用100～200rpm，培养3～10天，得到TJ-3发酵液；

2)菌丝菌液分离：在漏斗中用8层纱布过滤TJ-3发酵液，得到TJ-3菌丝和TJ-3菌液，其中菌丝放入70℃烘箱烘干，菌液放置在水浴锅上浓缩；

3)活性测试的供试液：菌丝用适量甲醇浸泡提取3次，得到TJ-3菌丝的甲醇浸泡液；浓缩后的菌液用等体积的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，得到各部位的萃取液，即发酵液二氯甲烷部位、发酵液乙酸乙酯部位、发酵液正丁醇部位；蒸干备用；

优选的，步骤1)中所述的液体发酵培养基配方为：碳源：MgSO₄·7H₂O(0.5g/L)，KH₂PO₄(1.0g/L)，Glucose(38.5g/L)，VB₁(50mg/L)，调pH>

优选的，步骤1)中所述的转速采用160r/min，培养时间为7天。

TJ-3发酵产物的抑细菌菌活性测试，包括如下步骤：

以大肠杆菌(Escherichia coli)CMCC 44825和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC 29213为供试菌，通过滤纸片法进行抑细菌活性测试：取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌液接种于牛肉膏-蛋白胨液体培养基内活化12h，37℃，160rpm，然后用牛肉膏-蛋白胨液体培养基稀释100倍，使得细菌浓度为10⁵个/mL，取稀释好的菌液200μL，均匀涂布在牛肉膏-蛋白胨固体培养基上，表面稍微干燥后，均匀放置蘸取药液的无菌滤纸片，每种药液重复2次(样品液的浓度均为10mg/mL)，其中药液分别为：发酵液二氯甲烷部位、发酵液乙酸乙酯部位、发酵液正丁醇部位、菌丝甲醇浸泡液、竹叶兰乙酸乙酯部位(干燥竹叶兰用85％乙醇溶液提取，提取液浓缩后，依次用石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇萃取，得到各萃取部位，经实验表明，竹叶兰的大多数活性成分都存在于乙酸乙酯萃取部位)、发酵液粗提物(TJ-3菌液浓缩干燥后所得)、氨苄青霉素钠(100μg/L，阳性对照)、水(阴性对照)，封口膜封口，37℃下，静置培养24h，观察抑菌圈大小。

TJ-3发酵产物的抑真菌活性测试，包括如下步骤：

以菜心炭疽菌(Colletolrichum higginsianum)、黄瓜疫霉(Phytophthoramelonis Katsura)、苦瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.momdicaeSun&Huang)RRs-3-2-03、稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、落花生球腔菌(Mycosphaerella arachidicola)、小白菜炭疽(Colletotrichum higginsianum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、长柄链格孢菌(Alternaria longipes)、柑橘白地霉(Geotrichum citri-aurantii)、柑橘灰霉菌(Botrytis cinerea)、柑橘囊胞壳菌(Phytophthora capsici)、猕猴桃拟茎点霉(Phomopsis sp.)、猕猴桃葡萄座腔菌(Botryosphaeria parva)共14种病原真菌为供试菌，通过平板对峙法，进行抑真菌活性测试：取长势良好的植物病原真菌，用灭菌后的打孔器在菌落边缘打取6mm菌饼，用接种针接种于改良PDA固体培养基上正中央，正面朝下，在距中心位置2cm处接种4块TJ-3菌饼，28℃培养4天，观察抑制效果。

优选的，供试真菌菌株采用农业上常见的且危害较大的植物病原真菌。

TJ-3发酵产物的抗氧化测试，包括如下步骤：

以DPPH分析法测定TJ-3菌株的活性成分对DPPH自由基的清除作用，具体操作为：取19.72mg DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)粉末，加入50mL甲醇溶解，定容至250mL，得到0.2mmol/L的DPPH溶液；取一定量的菌液浸膏，用蒸馏水溶解，一定量的菌丝甲醇浸泡液的浸膏，用甲醇溶解，稀释浓度为1、0.5、0.25、0.1、0.05mg/mL；取样品液2mL于5mL离心管中，加入2mL DPPH溶液，混匀后，25℃水浴30min，在517nm处测光吸收值A_i；以2mL溶剂代替DPPH溶液，加入2mL样品液，同样操作下测得试剂空白的光吸收值A_j；以2mL溶剂代替样品液，加入2mL>0；每个操作设置3个重复，取平均值计算DPPH清除率，并绘制DPPH自由基清除率对待测液浓度曲线，计算公式如下；

上述TJ-3菌株的活性应用是指在广谱抑菌和抗氧化等方面的应用。

优选的，所述抑菌活性指对革兰氏阳性、阴性细菌的抑制作用，以及对植物病原真菌的抑制作用，可以较好地应用于农业上的病害防治；

优选的，所述抗氧化作用在抗衰老、抗癌上的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)通过从药用植物竹叶兰的内生菌中发现活性较好地次级代谢产物，大大提高了研究效率，缩短了研究周期。

(2)本发明发现的真菌菌株TJ-3具有很好的广谱抑菌效果，可以广泛应用于细菌感染以及农业病害防治。

(3)通过紫外全波长扫描，发现其发酵液与菌丝在260～290nm范围内有最大吸收波长，与竹叶兰乙酸乙酯萃取物紫外特征有重叠部分，可能含有与竹叶兰相同或相似的活性成分；测试供试液的抑菌活性和抗氧化活性，均有较理想的结果。相比于传统的从植物中分离活性产物，本发明的方法工艺简单，效率高，并且活性较好，培养大大缩短。可用于活性单体化合物的分离及应用。

附图说明

图1是竹叶兰内生真菌TJ-3的分离纯化过程。

图2是TJ-3的宏观和微观形态。

图3是TJ-3发酵液各萃取部位的紫外全波长扫描图。

图4是TJ-3菌丝和发酵液各萃取部位的抑细菌活性；其中，a：供试菌-大肠杆菌，b：供试菌-金黄色葡萄菌；1-发酵液二氯甲烷部位；2-发酵液乙酸乙酯部位；3-发酵液正丁醇部位；4-菌丝甲醇浸泡液；5-竹叶兰乙酸乙酯部位；6-发酵液；7-氨苄青霉素钠(100μg/L，阳性对照)；8-水(阴性对照)。

图5是平板对峙法测定TJ-3菌株对14种植物病原真菌的抑制活性；其中，①菜心炭疽；②稻瘟菌；③柑橘白地霉；④柑橘灰霉菌；⑤柑橘囊胞壳菌；⑥禾谷镰刀菌；⑦黄瓜疫霉；⑧灰葡萄孢菌；⑨黄瓜枯萎病菌；⑩落花生球腔菌；猕猴桃拟茎点霉；猕猴桃葡萄座腔菌；小白菜炭疽；长柄链格孢菌。

图6是TJ-3发酵液和菌丝的抗氧化能力。

图7是TJ-3的系统发育进化树。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

所用的菌株：菜心炭疽菌(Colletolrichum higginsianum)、黄瓜疫霉(Phytophthoramelonis Katsura)、苦瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.momdicaeSun&Huang)RRs-3-2-03均由广东省农业科学院植物保护研究所蔬菜病虫害研究室提供；其中，菜心炭疽菌(Colletolrichum higginsianum)在文献“广东不同地区菜心炭疽菌的致病力测定[C],中国植物病理学会2015年学术年会论文集,2015年”中公开，黄瓜疫霉(Phytophthoramelonis Katsura)在文献“温度对瓜疫霉菌生长速率的影响研究[J],广东农业科学,2004,06,025”中公开，苦瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.momdicaeSun&Huang)RRs-3-2-03在文献“广东苦瓜主要品种对枯萎病的抗性评价[J],广东农业科学,2010,09,059”中公开。

所用的菌株：稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)、禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、落花生球腔菌(Mycosphaerella arachidicola)、小白菜炭疽(Colletotrichum higginsianum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、长柄链格孢菌(Alternaria longipes)均由福建农林大学农学院提供；其中，稻瘟菌(Magnaportheoryzae)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、小白菜炭疽(Colletotrichumhigginsianum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、长柄链格孢菌(Alternaria longipes)均在文献“2株银杏内生真菌的抑菌活性研究[D].福建:福建农林大学农学院,2013,1-74”中公开，落花生球腔菌(Mycosphaerella arachidicola)在文献“Antifungal activity ofthe ribosome-inactivating proteins momordin,saporin and luffin[C],中国菌物学会第三届会员代表大会暨全国第六届菌物学学术讨论会论文集,2003年”中公开。

所用的菌株：柑橘白地霉(Geotrichum citri-aurantii)、柑橘灰霉菌(Botrytiscinerea)、柑橘囊胞壳菌(Phytophthora capsici)、猕猴桃拟茎点霉(Phomopsis sp.)、猕猴桃葡萄座腔菌(Botryosphaeria parva)均由江西农业大学提供；并均在文献“白薇提取物的抗氧化和抑菌活性[J],江苏农业科学,2017,04(25),140-144”中公开。

实施例1

一种竹叶兰内生真菌的分离纯化方法，分离纯化过程如图1所示，包括如下步骤：

(1)采样：从云南昆明采集带土的新鲜竹叶兰样品，装入密封袋，低温保存；

(2)消毒处理：新鲜竹叶兰放在流动的自来水下面冲洗干净，用无菌滤纸擦干通过经典的表面消毒法对竹叶兰的根、茎、叶进行消毒处理；

(3)根、茎、叶：自来水表面清洗4～5次→消毒纸巾吸干水分→75％酒精漂洗2min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分→1％次氯酸钠溶液漂洗5min→无菌水冲洗3次→消毒纸巾吸干水分(叶片仅用酒精消毒)；

(4)培养：无菌条件下将叶片切成5mm×5mm大小，根、茎切成5mm长度，置于改良PDA固体平板培养基上28℃避光恒温培养；最后一次冲洗无菌水设为对照培养，若无菌落生长则说明样品消毒彻底；

(5)纯化：将所得到的内生真菌分别转接至改良PDA固体培养基，根据菌落的颜色、形态不同，挑取单菌落，反复培养、纯化，得到纯菌株TJ-3，名称为层出镰刀菌(FusariumProliferatum)TJ-3；

(6)保存菌种：将纯化后的真菌菌丝用无菌水轻轻洗脱，菌丝及孢子悬浮液按1:1的比例与50％的甘油混匀，-20℃保存(长期保存)；同时把真菌菌丝挑取至改良PDA固体斜面培养基上培养，4～5d后，置于5℃冰箱保存(1～2月转接一次)；

优选地，步骤(4)、(5)、(6)中所用到的改良PDA固体培养基是在标准固体培养基的基础上加入适量微量元素进行改良的，配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，七水硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾3.0g，维生素B₁>

(7)TJ-3菌株的分子生物学鉴定：

把改良PDA固体平板培养基上长势良好的菌株，用封口膜封好，外送至北京信诺金达生物科技有限公司进行ITS序列鉴定。具体步骤为：提取TJ-3菌株的ITS序列进行PCR扩增，两个通用引物为ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTGGTAACAAGG-3′)，PCR结束后，通过凝胶电泳检测扩增产物，然后进行基因序列测定，菌株TJ-3的基因序列通过NCBI的Blast检索系统进行序列同源性分析，使用Mega5软件采用相邻连接方法获得系统进化树(见图7)。其序列与Fusarium Proliferatum同源性≧99％，结合形态观察等指标，确定菌株TJ-3为镰孢菌属。命名为层出镰刀菌(Fusariu mProliferatum)TJ-3。

所述的层出镰刀菌(Fusarium Proliferatum)TJ-3的ITS序列(548bp)如SEQ IDNO.1所示。

TJ-3的宏观和微观形态如图2所示，可知，该菌株在改良PDA固体培养基上的最适生长温度为28℃，周期为7天，生长速度慢，菌丝浓密，菌落呈同心环状，内部为紫红色，边缘白色，蓬松，中心部分凸起；培养基为紫红色偏黑，在光学显微镜下和看到镰刀状的游离孢子；在液体培养基中的温度为28℃，转速为160rpm，生长周期为7天，发酵液呈深紫红色，有淡淡葡萄酒香味。

实施例2

TJ-3发酵产物的制备，包括如下步骤：

(1)扩大培养：将在改良PDA固体斜面培养基上培养好的真菌菌落，用无菌水冲洗，轻轻刮取菌丝，按10％的接种量接种至液体发酵培养基中，28℃，160rpm培养7天，得到TJ-3发酵液；

(2)菌丝菌液分离：在漏斗中用8层纱布过滤发酵液，得到TJ-3菌丝和TJ-3菌液，其中菌丝放入70℃烘箱烘干，菌液放置在水浴锅上浓缩；

(3)活性测试的供试液：菌丝用适量甲醇浸泡提取3次，得到TJ-3菌丝的甲醇浸泡液；浓缩后的菌液用等体积的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取3次，得到各部位的萃取液，即发酵液二氯甲烷部位、发酵液乙酸乙酯部位、发酵液正丁醇部位；蒸干备用；

优选地，步骤(1)中所述的液体发酵培养基配方为：碳源：MgSO₄·7H₂O(0.5g/L)，KH₂PO₄(1.0g/L)，Glucose(38.5g/L)，VB₁(50mg/L)，调pH>

实施例3

TJ-3次级代谢产物的化学成分分析，包括如下步骤：

对得到的菌丝甲醇浸泡液、发酵液乙酸乙酯部位，进行紫外全波长扫描，以竹叶兰乙酸乙酯萃取部位，判定发酵产物中可能含有的活性成分结构，结果见图3；

发酵液乙酸乙酯部位的紫外最大吸收峰为262nm；菌丝甲醇浸泡液的紫外最大吸收峰为215nm、261nm；竹叶兰乙酸乙酯部位的紫外最大吸收峰为276nm；发酵液乙酸乙酯部位和菌丝甲醇浸泡液在260nm附近均有吸收，在相同的波长范围有紫外吸收，说明各部位所含的化合物具有相同或相似的基团，如在化合物中具有酚类、醌类、吡啶类基团化合物在230nm、257nm波长有紫外吸收峰；由于竹叶兰乙酸乙酯部位的成分较复杂，虽然紫外吸收的峰值出现在276nm，但实际上在200～300nm范围内都有吸收，说明发酵液的各部位的成分与竹叶兰乙酸乙酯部位成分也具有相似性。

实施例4

TJ-3发酵产物的抑细菌活性测试，包括如下步骤：

以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为供试菌，通过滤纸片法进行抑细菌活性测试：取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种于牛肉膏-蛋白胨液体培养基内活化12h，37℃，160rpm，然后用牛肉膏-蛋白胨液体培养基稀释100倍，使得细菌浓度为10⁵个/mL，取稀释好的菌液200μL，均匀涂布在牛肉膏-蛋白胨固体培养基上，表面稍微干燥后，均匀放置蘸取药液的无菌滤纸片，每种药液重复2次(样品液的浓度均为10mg/mL)，其中1-发酵液二氯甲烷部位；2-发酵液乙酸乙酯部位；3-发酵液正丁醇部位；4-菌丝甲醇浸泡液；5-竹叶兰乙酸乙酯部位；6-发酵液粗提物；7-氨苄青霉素钠(100μg/L，阳性对照)；8-水(阴性对照)，封口膜封口，37℃下，静置培养24h，观察抑菌圈大小，结果如下表及图4：

注：“——”表示无抑菌作用，抑菌圈单位：mm

实施例5

TJ-3菌株的抑真菌活性测试，包括如下步骤：

以菜心炭疽菌、稻瘟菌、柑橘白地霉、猕猴桃拟茎点霉、长柄链格孢菌等病原真菌为供试菌，通过平板对峙法，进行抑真菌活性测试：取长势良好的植物病原真菌，用灭菌后的打孔器在菌落边缘打取6mm菌饼，用接种针接种于改良PDA固体培养基上正中央，正面朝下，在距中心位置2cm处接种4块TJ-3菌饼，28℃培养4天，观察抑制效果，结果见图5，可以看出TJ-3对所有的植物病原真菌均有不同程度的抑制作用。

通过TJ-3对细菌和真菌的细菌性测试，可以发现，TJ-3具有广谱抑菌性，有很好的应用前景。

实施例6

TJ-3发酵产物的抗氧化测试，包括如下步骤：

以DPPH分析法测定TJ-3菌株的活性成分对DPPH自由基的清除作用，具体操作为：取19.72mg DPPH粉末，加入50mL甲醇溶解，定容至250mL，得到0.2mmol/L的DPPH溶液；取一定量的菌液浸膏，用蒸馏水溶解，一定量的菌丝甲醇浸泡液的浸膏，用甲醇溶解，稀释浓度为1、0.5、0.25、0.1、0.05mg/mL；取样品液2mL于5mL离心管中，加入2mL DPPH溶液，混匀后，25℃水浴30min，在517nm处测光吸收值A_i；以2mL溶剂代替DPPH溶液，加入2mL样品液，同样操作下测得试剂空白的光吸收值A_j；以2mL溶剂代替样品液，加入2mLDPPH溶液，同样操作下测得未加样品液的光吸收值A₀；每个操作设置3个重复，取平均值计算DPPH清除率，并绘制DPPH自由基清除率对待测液浓度曲线，计算公式如下；

实验结果见下表，图6：

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种竹叶兰内生真菌的分离纯化方法及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 548

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 层出镰刀菌（Fusarium Proliferatum）TJ-3的ITS序列

<400> 1

agggggcgta ggaacctacc tgatccgagg tcacattcag aagttggggt ttaacggcgt 60

ggccgcgacg attaccagta acgagggttt tactactacg ctatggaagc tcgacgtgac 120

cgccaatcaa tttggggaac gcgatttgac tcgcgagtcc caacaccaag ctgggcttga 180

gggttgaaat gacgctcgaa caggcatgcc cgccagaata ctggcgggcg caatgtgcgt 240

tcaaagattc gatgattcac tgaattctgc aattcacatt acttatcgca ttttgctgcg 300

ttcttcatcg atgccagaac caagagatcc gttgttgaaa gttttgattt atttatggtt 360

ttactcagaa gttacatata gaaacagagt ttaggggtcc tctggcgggc cgtcccgttt 420

taccgggagc gggctgatcc gccgaggcaa caattggtat gttcacaggg gtttgggagt 480

tgtaaactcg gtaatgatcc ctccgctggt tcaccaacgg agaccttgtt acgttttttt 540

accttcca 548

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ITS4

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> ITS5

<400> 3

ggaagtaaaa gtggtaacaa gg 22