猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗

摘要

本发明涉及一种用于预防O型口蹄疫病毒的融合蛋白及该融合蛋白的制备方法及其应用。具体而言，本发明涉及一种融合蛋白，该融合蛋白包含分子佐剂IL‑2多肽，T细胞辅助抗原表位多肽，7段与O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫毒株主要结构蛋白VP1、VP2和VP3相关的抗原表位多肽以及杀伤性T细胞表位多肽。本发明还涉及该融合蛋白的制备方法及其应用。本疫苗生产制备工艺稳定，适合大规模生产，试验表明本疫苗使用安全，能够有效预防不同O型口蹄疫流行毒株的感染。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于预防O型口蹄疫病毒的融合蛋白及该融合蛋白的制备方法及其应用。具体地，利用基因重组技术，将T细胞辅助抗原表位多肽，7段与O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫毒株主要结构蛋白VP1、VP2和VP3相关的抗原表位多肽以及杀伤性T细胞表位多肽与分子佐剂IL-2 多肽串联，连入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、乳化工艺制备，得到猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗及该疫苗在预防O型口蹄疫病毒感染中的应用。

背景技术

口蹄疫(Foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease Virus，FMDV) 感染引起的偶蹄动物共患的急性、热性、高度接触性传染病，被国际兽医局(OIE)列为A类传染病。牛、羊、猪对该病毒都非常敏感，患病动物在消化道皮状黏膜、口、舌、唇、蹄间隙和蹄冠缘、乳房及皮肤的其他无毛发部位发生水泡和溃烂，且该病传染性极强，传播速度快，流行范围广，感染率高，死亡率可高达50％-70％，对畜牧养殖业造成巨大的经济损失。随着经济的发展，贸易的全球化，国际贸易也加剧了口蹄疫疾病的扩散，中国是畜牧养殖大国，做好口蹄疫预防工作更是至关重要。

口蹄疫病毒属小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，包含O、A、C型(称欧洲型)，SAT1、SAT2、SAT3(称非洲型)和Asia I(称亚洲型)7种血清型，而每一血清型又分为多种亚型，各血清型间几乎无交叉免疫力。不同血清型口蹄疫病毒的分布区域不同，O型和A型口蹄疫病毒主要流行于非洲、南美洲、南亚和远东，而在我国流行的口蹄疫病毒主要是O型和Asia I型，其中O型口蹄疫Mya-98毒株(缅甸98谱系)自2011年初在我国被发现以来，已陆续在13省市相继发生多次疫情，引起广泛关注。而泛亚毒株于1990年在印度首次分离获得，随后传入沙特阿拉伯，并于1994年传入临近周边国家，我国于1999年在台湾发现，该谱系病毒传染性强、宿主范围广、传播速度快，给畜牧养殖带来严重的经济损失。目前，免疫接种仍是预防口蹄疫的主要手段。理想的疫苗必须同时具备安全有效、价廉方便等特点。传统灭活苗虽具有良好的免疫原性，但存在批量生产灭活不彻底、散毒等风险，在生产、运输和使用上存在生物安全隐患，且保护期较短。化学合成肽疫苗安全有效，但昂贵的生产成本限制了其推广。基因工程苗具有安全性高、生产成本低、使用方便且可同时针对多种血清型等优点，成为 FMD疫苗研究的热点。口蹄疫病毒颗粒编码四种结构蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4，各含有60个拷贝，VP1、 VP2和VP3位于衣壳表面，VP4位于衣壳内部。其中VP1的G-H环和C端氨基酸残基是FMDV主要的抗原位点，可诱导机体产生保护性免疫应答(Brown F，1995)，也是目前研究较多的。

一般而言，作为理想的免疫原，需要同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表位，可诱导出高特异性的体液或细胞免疫反应(Nardin EH et al，2001)。FMDV感染机体产生中和抗体需要B细胞和T细胞共同参与，T细胞在FMDV的抗原构成和免疫应答中起重要作用。FMDV的VP1G-H环有诱导生成B 细胞的位点，也有激发产生Th细胞的位点，试验发现，其41-209位氨基酸上至少存在11个不同的T细胞表位。混合Th表位能够激发有效地T细胞辅助作用，能够与本身免疫原性弱的B细胞表位结合形成有效的肽免疫原。这种混合Th能通过有效病毒或细菌源免疫原特异性序列衍生而来，包括麻疹病毒F蛋白，乙型肝炎病毒表面抗原，沙眼衣原体外膜蛋白等。许多已知的Th已表现出有效地增强弱免疫原(U.S.pat.No.5759551)。强效的Th表位大小范围为15-50个氨基酸残基(U.S.pat.No.5759551)，通常具有共同的结构特征，可能包含特异的标志性序列。

IL-2即白细胞介素-2(interleukin-2，IL-2)，又名T细胞生长因子，主要由活化的CD4+T细胞和 CD8+T细胞产生。IL-2在体外能促进T细胞分化成熟和扩增，促进THC的增长，刺激NK细胞生长并增强其溶细胞功能，增强B细胞和巨噬细胞的作用，是一种具有广泛生物活性的细胞因子。IL-2在特异性免疫应答反应中发挥重要作用，将IL-2与保护性抗原基因连接构成融合蛋白，可以增强亚单位疫苗的抗体产生和细胞免疫水平，免疫效力很有优势。

发明内容

本发明根据不同结构蛋白在病毒感染中的作用，利用相关生物信息学软件对缅甸98和泛亚谱系O型口蹄疫病毒主要结构蛋白VP1、VP2、VP3的亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和Garnier-Robson的二级结构进行分析，根据表位B细胞与CTL表位位置和氨基酸序列的保守性设计寡核苷酸片段，同时引入有效的通用性Th细胞表位和IL-2作为疫苗架构。串联后克隆入pRSETA载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防O型口蹄疫病毒的感染。

在第一个方面，本发明提供了一种用于预防O型口蹄疫病毒感染的融合蛋白，其含有7段对缅甸98 和泛亚谱系O型口蹄疫病毒主要结构蛋白VP1、VP2、VP3筛选得到的抗原表位，T细胞辅助抗原表位多肽，分子佐剂IL-2多肽以及杀伤性T细胞表位多肽。所述“O型口蹄疫病毒主要结构蛋白VP1、VP2、VP3的抗原表位”指的是具有免疫原性的O型口蹄疫病毒主要结构蛋白VP1、VP2、VP3中的一部分多肽或其具有基本相同免疫原性的功能等价物，优选是选自SEQ ID No.8、10、12、14、16、18和20的氨基酸序列或其功能等价物。所述的融合蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及表达抗原表位所需要的载体。载体也可以包括单独编码各抗原表位的序列，串联可以通过遗传工程方法进行。所述疫苗也包括非免疫活性物质，即为各多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。

在第二个方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一方面所述的猪O/Mya98和O/PanAsia 型口蹄疫基因工程灭活疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式、DNA形式，通过人工合成方式合成抗原表位串联序列，然后通过基因工程操作连接后克隆入载体，转化入大肠杆菌，经过筛选、发酵、纯化等工艺获得猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗多肽。在本发明中可以对该核酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切、连接等。优选本发明中的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在第三个方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二方面所述的核酸分子。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”，有时仅称为“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其他各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可以使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His、Leu、Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。在一优选实施方式中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码融合蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以获得所需要的融合蛋白。

在第四个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述的细胞已用本发明第三方面所述的核酸分子转化或转染。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。

在第五个方面，本发明提供了制备本发明第一个方面所述融合蛋白的方法，其包括以下步骤：用本发明第四个方面的宿主细胞表达本发明第一个方面的融合蛋白，并分离所述的融合蛋白。获得的工程细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需的融合蛋白，包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要，可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其他生物学特性，进行分离纯化。方法包括但不限于：裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属螯合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等点聚焦以及常规的变性、复性处理等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。

在第六个方面，本发明提供了一种猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗，其包括本发明第一方面所述的多肽以及药学上可接受的载体。所述口蹄疫疫苗能够预防O型口蹄疫流行毒株的侵染。本发明所述的药学上可接受的载体为免疫增强剂或免疫佐剂，优选免疫佐剂为进口白油佐剂。

在第七个方面，本发明提供了本发明第六个方面所述的猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗的应用。在本发明的一个优选实施方式中，通过对实验动物以特定剂量肌肉注射，有效地保护了实验动物。

另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其他具有实质性特点的方面对本领域的普通技术人来说是显而易见的。此外，本发明亦使用了公开文献，他们的全文内容均纳入本文进行参考。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1为含有融合蛋白编码基因的表达载体pRSETA-FMDV-IL-2的示意图。

图2显示了重组表达载体pRSETA-FMDV-IL-2用EcoR I+HindIII酶切后的电泳结果，其中M为DNA Marker，泳道1为质粒酶切图，泳道2为未酶切对照，泳道3为空质粒。

图3为融合蛋白编码基因表达产物SDS-PAGE鉴定结果，其中M为分子量Marker，从上至下依次为 116.0KDa、66.2KDa、45.0KDa、35.0KDa、25.0KDa、18.4KDa、14.4KDa，1泳道为诱导样品。

图4显示了样品纯化Western Blot印迹结果，其中M为预染Marker，1为样品，2为阴性对照。

具体实施方式

实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐明本发明，但并不构成对本发明范围的限制，以下所述实验方法，没有具体说明的，均按照《分子克隆实验指南》(2002年，第三版，科学出版社)所述方法进行。

实施例一 融合蛋白基因的来源

本发明综合分析缅甸98和泛亚谱系O型口蹄疫病毒的基因序列、抗原结构、流行病学研究进展，根据其主要结构蛋白VP1、VP2、VP3的氨基酸序列，利用相关生物信息学软件对其亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和二级结构进行分析，预测可能的B细胞抗原表位及T细胞抗原表位，并综合相关报道，从而确定不同毒株VP1抗原表位4段，VP2抗原表位2段，VP3抗原表位1段，同时引入T细胞辅助抗原表位优势抗原表位以及杀伤性T细胞优势抗原表位。将所有表位用柔性Linker连接后再与分子佐剂IL-2串联，该疫苗总体结构为：

IL-2-The-VP1 Epitope1-VP1 Epitope2-VP1 Epitope3-VP1 Epitope4-VP2Epitope1-VP2 Epitope2 -VP3-Tce

实施例二 大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建

将实施例一中设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了 EcoR I(5’端)和HindIII(3’端)限制性酶切位点，将合成好的片段克隆到pMD18T载体上，序列测定证实插入基因片段与涉及序列一致(见序列表)。将重组质粒命名为pMD18T-FMDV-IL-2，用相应的限制性内切酶对质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用Invitrogen公司的pRSETA质粒，也使用相同的限制性内切酶处理，酶切条件：10μL反应体系，体系内加入质粒2μL，限制性内切酶5个活性单位(New England biolabs)，10×缓冲液1μL，去离子水补齐，37.0℃酶切1.5小时。酶切结束后加入1μL 200mM EDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中电泳30分钟。紫外灯下将pRSETA质粒和目的片段切下，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段为1∶2-3的比例将多表位核苷酸片段与表达载体混合，反应体系15μL，由T4 DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒命名为pRSETA-FMDV-IL-2 (见图1)，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

转化：将pRSETA-FMDV-IL-2置冰上融化，加入1mL连接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42℃30 秒钟，然后迅速放回冰水浴90秒钟，加入1mL LB培养液，37.0℃静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μL LB培养基重悬菌体，将菌液均匀涂布于含有100μL/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，倒置于37℃恒温箱中培养12-16小时，直至克隆形成。

鉴定：挑取平板上的单克隆至LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养12小时，提取质粒，使用限制性内切酶EcoR I和HindIII进行双酶切，可以切出相应大小片段的克隆为1100bp左右，可初步确定为阳性克隆(见图2)，阳性克隆进行DNA序列测定进一步验证其正确性(见序列表)。

诱导表达：将阳性克隆过夜培养，次日早上按照1∶100转接，37℃震荡培养3小时候，加入0.5mM IPTG 诱导，继续培养3小时，制备样品。常规SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况，可在41KD分子量处见到特异性条带为正确克隆(见图3)。取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，使用常规Western-blot 进一步证实其表达准确性(见图4)。最后筛选得到的高效分泌表达融合蛋白的工程菌，命名为pRSETA-FMDV-IL-2/BL21(DE3，PLys)。

实施例三 工程菌的发酵、纯化与乳化

发酵 将生产菌种接种到2mL含有100μL/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养12小时活化菌种。将活化好的菌种以1∶100的接种量接入摇瓶，37℃震荡培养至OD600＝3，可按10％比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素。校正溶氧和 pH值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37℃时，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0℃±0.1℃，溶氧控制在20％左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体 OD600＝1.0-1.2时流加补料500mL，补料后1小时加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导表达，连续诱导6个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检测表达情况。

纯化 将收集的菌体，用包涵体洗液I(1％Triton X-100，20Mm Tris-cl pH8.0)混悬后进行超声， 2000W超声裂解1小时。4℃，12000rpm离心收集包涵体，并用包涵体洗液II(1％DOC，4M尿素，20mM Tris-cl pH8.0)混悬二次超声洗涤包涵体，二次低温离心收集包涵体。包涵体沉淀用8M尿素，0.3％β-ME，20mM Tris-cl(pH＝8.0)混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30分钟，弃去沉淀。变性蛋白1∶100稀释，复性液用Tris(pH＝8.0)缓冲体系，加入0.3M精氨酸，4℃搅拌复性24小时。复性液用pH＝8.0的20mM 磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠， 0.5M咪唑洗脱。再用1.5M硫酸铵、100mM EDTA、pH＝8.5的10mM磷酸氢二钠平衡上疏水层析柱，再平衡，用pH＝8.5的10mM磷酸氢二钠洗脱，即得猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗半成品原液，进行SDS-PAGE以及Western-blot印记检定纯化产物是否为目的蛋白。

乳化 将纯化的半成品原液用灭菌PBS稀释至200μg/mL。取进口白油矿物油佐剂DUOPRIME(医药级) 经121℃灭菌15分钟，备用。按油相∶水相＝50∶50的比例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以 80-100r/min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2分钟，然后以5500r/min高速循环乳化9 分钟，制成油包水单相疫苗。

实施例四 猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗安全性实验

材料

疫苗：猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗，批号20150406、20150408、20150410，由公司研发中心提供。

试验动物：8周龄BaIb/c小白鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。28日龄健康三元杂交断奶仔猪由广东永顺制药提供。

方法

疫苗对小白鼠的安全性

将40只8周龄BaIb/c小白鼠随机分为3个批次组和1个对照组，10只/组。批次组分别皮下注射3 个不同批次的猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗，0.5mL/只。对照组皮下注射生理盐水白油乳剂0.5mL/只。连续观察14天，观测小白鼠的健康状况。

疫苗对仔猪的安全性

将20头28日龄健康三元杂交断奶仔猪随机分为3个批次组和1个对照组，5头/组。批次组分别耳后肌肉注射3个不同批次的猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗，2mL/头。对照组注射生理盐水白油乳剂2mL/只。连续观察14天，观测仔猪的健康状况。

试验结果

疫苗对小白鼠的安全性试验

结果见表1，免疫后，所有试验小鼠均未出现任何过敏反应或中毒症状，精神状态良好，体温、采食、饮水等一切正常，未出现明显局部炎症等损伤性临床副反应，无死亡发生，与对照组一致，表明猪O/Mya98 和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗对小白鼠是安全的。

表1 疫苗对小白鼠的安全性试验结果

组别动物数量体温食欲精神健康状况死亡数量2015040610正常正常正常良好02015040810正常正常正常良好02015041010正常正常正常良好0对照组10正常正常正常良好0

疫苗对仔猪的安全性试验

结果如表2，整个观察期内，所有免疫的仔猪体温和食欲均正常，精神状态良好，未出现任何临床异常现象，免疫部位未发现过敏或炎症，无死亡发生，批次组与对照组一致，表明猪O/Mya98和O/PanAsia 型口蹄疫基因工程灭活疫苗对断奶仔猪是安全的。

表2 疫苗对仔猪的安全性试验结果

组别动物数量体温食欲精神健康状况死亡数量201504065正常正常正常良好0201504085正常正常正常良好0201504105正常正常正常良好0对照组5正常正常正常良好0

实施例五 攻毒保护试验

材料

疫苗：猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗，批号20150406、20150408、20150410，由公司研发中心提供。

试验动物：选用经乳鼠中和试验检测无O型口蹄疫抗体的35日龄健康猪38头。

毒株：攻毒用毒株为O/Mya/98和O/ZheJ/CHA/08均由广东永顺制药提供。

PBS(PH7.6-7.8，0.04M)将种毒稀释为10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，每滴度注2mL颈部肌肉注射架子猪4头，观察10日，发现发病猪后要及时隔离。试验结束后，计算种毒对猪的半数感染量ID₅₀。

方法

将38头猪随机分为两大组，O/Mya/98和O/ZheJ/CHA/08强毒组，每组再分5小组，3个免疫组、未免攻毒对照组和空白组，免疫组每组5头，未免攻毒对照组和空白组2头/组。免疫组分别注射3个批次的基因工程灭活苗，2mL/头，免疫后观察各组免疫靶动物是否出现采食异常、焦虑不安、呼吸急促、体温波动、口吐白沫等临床症状。免后28天，除空白组外，每头用1000ID₅₀O/Mya/98和O/ZheJ/CHA/08强毒耳后注射。攻毒14天后，观察靶动物的临床反应并记录。

试验结果

空白组受试动物均健康。3个疫苗免疫组免后未出现猪只发热、呼吸急促等现象，采食正常，与空白组无明显区别，攻毒后保护率均为100％。未免攻毒对照组全部发病，表现为典型的口蹄疫病毒感染症状，受试动物全部死亡，结果见表3。

表3 猪O/Mya98和O/PanAsia型口蹄疫基因工程灭活疫苗攻毒保护试验