用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测的B细胞抗原表位肽及其试剂盒

摘要

本发明提供了一种用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测的B细胞抗原表位肽及其试剂盒，所述的B细胞抗原表位肽的核心氨基酸序列为：SVSQNPNDPHLG、ATKNTDTYNA或PWDTELSIQDADS。本发明的技术方案的B细胞抗原表位肽，用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测，具有良好的免疫原性，且具有良好的SA特异性，可作为筛选患者血清的诊断试剂，其能用于血流

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗原表位肽，尤其涉及一种用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测的B细胞抗原表位肽及其试剂盒。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是临床分离的重要致病菌和定植菌之一，可导致大量的严重的、甚至危及生命的感染性疾病。2008-2015年Mohnarin资料显示，综合医院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)分离株占S.aureus67.6％、ICU中高达84.8％；S.aureus居肺部感染G+球菌第一位，其中MRSA分离率26.3％；医院的败血症血培养阳性结果中S.aureus约占3-5％。而S.aureus泛耐药株的出现，大大增加了S.aureus菌感染治疗的难度，增加患者住院的时间。约5-10％的住院患者会产生院内感染，医院的病人越多，则感染的几率越大。MRSA是导致院内感染的常见病原菌。MRSA对大多数抗生素耐药的特性，给感染的治疗带来了巨大的挑战，特别是对糖肽类抗生素中介耐药的S.aureus的出现。MRSA感染成为了一个全球性的问题。世界各地区均有一些MRSA感染的大型疫情的报告。MRSA已经造成了包括败血症、心内膜炎和脑膜炎等严重的感染。MRSA引起的感染因其抗生素的治疗、隔离设施和材料和住院时间的延长而花费巨大，快速筛查S.aureus携带状况和检测致病菌是预防S.aureus感染及时治疗的关键。

S.aureus在自然环境中普遍存在，多定植于人的腹股沟、腋下、鼻腔及会阴部。葡萄球菌感染可导致脓肿(葡萄球菌和白细胞)。S.aureus能够产生蛋白水解酶(如lytm和staphopain B等)，促进了脓肿扩散过程。葡萄球菌感染可导致肺炎、心内膜炎、骨髓炎和关节腔感染等。约25％～35％免疫缺陷患者(如肿瘤、使用免疫抑制剂、AIDS等)会发生严重并发症(甚至败血症)。半胱氨酸蛋白酶Staphopain B是已知的金葡致病蛋白，且在金葡菌中的表达丰富，在体外，Staphopain B将LL-37降解成较短的肽片段，LL-37显着抑制金黄色葡萄球菌的生物膜形成，而降解产物没有观察到这样的作用。Staphopain B是葡萄球菌蛋白酶激活级联中的最终酶，小鼠模型中，staphopain B敲除菌株的毒力减弱。另外，Staphopain B能破坏结缔组织，造成凝血和激肽系统的紊乱，同时能直接与宿主免疫细胞作用，在金黄色葡萄球菌的存活和/或致病性中具重要性。

对于金葡感染的检测手段，传统培养检测方法主要有选择性增菌培养和生化鉴定，如免疫胶乳凝胶试验、耐热核酸酶试验、血浆凝固酶试验，其缺点在于耗时长、操作繁琐复杂。此外，血流感染方面，基于培养的方法还有其缺点主要在于血培养的阳性率较低(20％-25％)，且培养过长同样耗时过长。因此，脱离培养，直接或者间接性检测“生物标志物”也是早期诊断开发研究的重要方向。如分子杂交(FISH)、QPCR等分子标志物靶向方法，尽管可以做到直接检测金葡的分子标志物，但成本高，如QPCR，大约100元/样本，且存在污染的可能性较高且操作同样繁琐等缺点限制了其临床广泛应用。

发明内容

针对以上技术问题，本发明公开了一种用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测的B细胞抗原表位肽及其试剂盒，结合酶联免疫分析法，可用于血流S.aureus感染的早期诊断。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测的B细胞抗原表位肽，其核心氨基酸序列为：SVSQNPNDPHLG(如SEQ ID No.1所示)、ATKNTDTYNA(如SEQ ID No.2所示)或PWDTELSIQDADS(如SEQ ID No.3所示)。

在体外免疫学实验研究中，应用ELISA方法检测的动物学实验、特异性实验和血清学结合实验中发现，含有上述核心氨基酸序列的合成肽具有良好的免疫原性、特异性和结合性。

优选的，所述用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测的B细胞抗原表位肽的核心氨基酸序列为：SVSQNPNDPHLG(如SEQ ID No.1所示)、ATKNTDTYNA(如SEQ ID No.2所示)。

进一步的，所述B细胞抗原表位肽的序列的至少一端连接有不超过5个氨基酸的保护肽。

进一步的，所述B细胞抗原表位肽的序列的N端连接有两个氨基酸HS。

进一步的，所述B细胞抗原表位肽的序列的C端连接有GG。

本发明还公开了一种用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测的抗原，其是通过采用如上所述的用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测的B细胞抗原表位肽与载体蛋白偶联制备而成的。

进一步的，所述载体蛋白为KLH。

本发明还公开了一种用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测的试剂盒，其含有如上所述的用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测的B细胞抗原表位肽的包被物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明的技术方案的B细胞抗原表位肽用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测，具有良好的免疫原性，且具有良好的SA特异性，可作为筛选患者血清的诊断试剂，其能用于血流S.aureus感染的早期诊断，具有很大的临床价值。

附图说明

图1是本发明免疫前后间接ELISA法检测的合成肽P1与小鼠血清反应的OD值变化图。

图2是本发明免疫前后间接ELISA法检测的合成肽P2与小鼠血清反应的OD值变化图。

图3是本发明免疫前后间接ELISA法检测的合成肽P3与小鼠血清反应的OD值变化图。

图4是本发明间接ELISA法检测合成肽P1与小鼠感染血清、多抗腹水及正常血清的反应对比图。

图5是本发明间接ELISA法检测合成肽P2与小鼠感染血清、多抗腹水及正常血清的反应对比图。

图6是本发明间接ELISA法检测合成肽P3与小鼠感染血清、多抗腹水及正常血清的反应对比图。

图7是本发明正常人血清与合成肽P1的ELISA结果。

图8是本发明恢复期患者血清与合成肽P1的ELISA结果。

图9是本发明正常人血清与合成肽P2的ELISA结果。

图10是本发明恢复期患者血清与合成肽P2的ELISA结果。

图11是本发明正常人血清与合成肽P3的ELISA结果。

图12是本发明恢复期患者血清与合成肽P3的ELISA结果。

具体实施方式

下面对本发明的较优的具体实施方式作进一步的详细说明。

实施例1

采用固相合成法按照以下步骤制备合成肽P1，所述合成肽P1的氨基酸序列为：

合成肽P1：SVSQNPNDPHLG(如SEQ ID No.1所示)

步骤S1：Fmoc-氨基酸与树脂相连

取2-氯三苯基氯树脂CTC树脂1.0g(取代度为1.08mmol/g)加入到固相合成反应管中，用N，N'-二环己基碳二亚胺DCM 30ml浸泡30min使CTC树脂充分溶胀，活化待用。随后加入1.5mmol的Fmoc-氨基酸-OH、二氯甲烷15ml、N，N-二异丙基乙基胺DIPEA 0.42ml，震荡反应3h。反应结束后，将液体滤去，依次用甲醇、二氯甲烷洗涤树脂各3次，抽干待用。

步骤S2：氨基酸的逐步连接

在步骤S1反应得到的树脂中加入20％哌啶-DMF溶液15ml，震荡反应30min。将称量好的Fmoc-氨基酸(2eq)与1-羟基苯并三氮唑HOBt(3eq)混溶于5ml N，N-二甲基甲酰胺DMF溶液中，再加入N，N'-二环己基碳二亚胺DCC(3eq)、二氯甲烷15ml，震荡反应30min。并用20％哌啶-DMF溶液15ml脱去Fmoc，然后将下一个Fmoc-氨基酸活化，将活化液过滤至固相反应管中，震荡反应2h，反应完毕后用DMF、二氯甲烷各洗涤3次。根据如SEQ ID No.1所示的序列如此重复脱保护→缩合→脱保护，直到所有氨基酸连接完毕，得到反应后树脂。

步骤S3：采用稀酸体系将多肽从树脂上进行游离

在上述步骤S2反应后树脂中加入乙酸∶三氟乙醇∶二氯甲烷＝1∶1∶8(体积比)的溶剂共30ml，振荡反应1h，过滤，树脂再用二氯甲烷洗涤3次，浓缩滤液(期间加入甲苯除去残留乙酸)得带保护的多肽粗品。并且在粗品中加入三氟乙酸TFA∶DCM＝1∶3(体积比)的溶剂共20ml，搅拌反应30min，浓缩得目标多肽粗品，再用制备型高效液相进行纯化得纯品合成肽P1。经过检测，经合成纯化后，合成肽P1的纯度为94.9％。

实施例2

采用固相合成法按照以下步骤制备合成肽P2，所述合成肽P2的氨基酸序列为：

合成肽P2：ATKNTDTYNA(如SEQ ID No.2所示)

步骤S1：Fmoc-氨基酸与树脂相连

取2-氯三苯基氯树脂CTC树脂1.0g(取代度为1.08mmol/g)加入到固相合成反应管中，用N，N'-二环己基碳二亚胺DCM 30ml浸泡30min使CTC树脂充分溶胀，活化待用。随后加入1.5mmol的Fmoc-氨基酸-OH、二氯甲烷15ml、N，N-二异丙基乙基胺DIPEA 0.42ml，震荡反应3h。反应结束后，将液体滤去，依次用甲醇、二氯甲烷洗涤树脂各3次，抽干待用。

步骤S2：氨基酸的逐步连接

在步骤S1反应得到的树脂中加入20％哌啶-DMF溶液15ml，震荡反应30min。将称量好的Fmoc-氨基酸(2eq)与1-羟基苯并三氮唑HOBt(3eq)混溶于5ml N，N-二甲基甲酰胺DMF溶液中，再加入N，N'-二环己基碳二亚胺DCC(3eq)、二氯甲烷15ml，震荡反应30min。并用20％哌啶-DMF溶液15ml脱去Fmoc，然后将下一个Fmoc-氨基酸活化，将活化液过滤至固相反应管中，震荡反应2h，反应完毕后用DMF、二氯甲烷各洗涤3次。根据如SEQ ID No.2所示的序列如此重复脱保护→缩合→脱保护，直到所有氨基酸连接完毕，得到反应后树脂。

步骤S3：采用稀酸体系将多肽从树脂上进行游离

在上述步骤S2反应后树脂中加入乙酸∶三氟乙醇∶二氯甲烷＝1∶1∶8(体积比)的溶剂共30ml，振荡反应1h，过滤，树脂再用二氯甲烷洗涤3次，浓缩滤液(期间加入甲苯除去残留乙酸)得带保护的多肽粗品。并且在粗品中加入三氟乙酸TFA∶DCM＝1∶3(体积比)的溶剂共20ml，搅拌反应30min，浓缩得目标多肽粗品，再用制备型高效液相进行纯化得纯品合成肽P2。经过检测，经合成纯化后，合成肽P2的纯度为96.7％。

实施例3

采用固相合成法按照以下步骤制备合成肽P3，所述合成肽P3的氨基酸序列为：

合成肽P3：PWDTELSIQDADS(如SEQ ID No.3所示)

步骤S1：Fmoc-氨基酸与树脂相连

取2-氯三苯基氯树脂CTC树脂1.0g(取代度为1.08mmol/g)加入到固相合成反应管中，用N，N'-二环己基碳二亚胺DCM 30ml浸泡30min使CTC树脂充分溶胀，活化待用。随后加入1.5mmol的Fmoc-氨基酸-OH、二氯甲烷15ml、N，N-二异丙基乙基胺DIPEA 0.42ml，震荡反应3h。反应结束后，将液体滤去，依次用甲醇、二氯甲烷洗涤树脂各3次，抽干待用。

步骤S2：氨基酸的逐步连接

在步骤S1反应得到的树脂中加入20％哌啶-DMF溶液15ml，震荡反应30min。将称量好的Fmoc-氨基酸(2eq)与1-羟基苯并三氮唑HOBt(3eq)混溶于5ml N，N-二甲基甲酰胺DMF溶液中，再加入N，N'-二环己基碳二亚胺DCC(3eq)、二氯甲烷15ml，震荡反应30min。并用20％哌啶-DMF溶液15ml脱去Fmoc，然后将下一个Fmoc-氨基酸活化，将活化液过滤至固相反应管中，震荡反应2h，反应完毕后用DMF、二氯甲烷各洗涤3次。根据如SEQ ID No:3所示的序列如此重复脱保护→缩合→脱保护，直到所有氨基酸连接完毕，得到反应后树脂。

步骤S3：采用稀酸体系将多肽从树脂上进行游离

在上述步骤S2反应后树脂中加入乙酸∶三氟乙醇∶二氯甲烷＝1∶1∶8(体积比)的溶剂共30ml，振荡反应1h，过滤，树脂再用二氯甲烷洗涤3次，浓缩滤液(期间加入甲苯除去残留乙酸)得带保护的多肽粗品。并且在粗品中加入三氟乙酸TFA∶DCM＝1∶3(体积比)的溶剂共20ml，搅拌反应30min，浓缩得目标多肽粗品，再用制备型高效液相进行纯化得纯品合成肽P3。经过检测，经合成纯化后，合成肽P3的纯度为95.2％。

实施例4

间接ELISA法检测抗体效价实验。

采用间接ELISA方法检测，合成肽P1、P2、P3分别与其相应组小鼠在免疫前、第2次免疫以及末次免疫后，随机抽取的8只小鼠的在一系列稀释度下测量OD450nm值，绘制免疫前、2次免疫及末次免疫后的曲线变化图，如图1、图2和图3所示。

通过图1、图2和图3可见，经过免疫后，小鼠血清抗体的效价明显提高。

实施例5

合成肽的特异性实验。

将合成肽P1分别与己感染SA的小鼠血清、小鼠多抗腹水及正常小鼠血清进行ELISA反应并检测其OD值，在血清和腹水最佳稀释度为l:100时结果见表1和图4。

表1合成肽P1与小鼠感染血清、多抗腹水及正常小鼠血清的OD值比较

*vs.小鼠感染血清，P<0.01；#vs.小鼠多抗腹水，P<0.01

从表1和图4可见，经单因素方差分析(One-Way ANOVA)，合成肽P1与已感染SA的小鼠血清、小鼠多抗腹水及正常小鼠血清进行ELISA反应的OD值之间的差异有统计学意义(F＝605.156，P＝0.000)。

将合成肽P2分别与已感染sa的小鼠血清、小鼠多抗腹水及正常小鼠血清进行ELISA反应并检测其OD值，在血清和腹水最佳稀释度为1：100时结果见表2和图5。

表2合成肽P2与小鼠感染血清、多抗腹水及正常小鼠血清的OD值比较

*vs.小鼠感染血清，P<0.01；#vs.小鼠多抗腹水，P<0.01

从表2和图5可见，经单因素方差分析(One-Way ANOVA)，合成肽P2与已感染SA的小鼠血清、小鼠多抗腹水及正常小鼠血清进行ELISA反应的OD值之间的差异有统计学意义(F＝767.312，P＝0.000)。

将合成肽P3分别与已感染SA的小鼠血清、小鼠多抗腹水及正常小鼠血清进行ELISA反应并检测其OD值，在血清和腹水最佳稀释度为1：100时结果见表3和图6。

表3合成肽P3与小鼠感染血清、多抗腹水及正常小鼠血清的OD值比较

*vs.小鼠感染血清，P<0.01；#vs.小鼠多抗腹水，P＝0.327

从表3和图6可见，经单因素方差分析(One-Way ANOVA)，合成肽P3与已感染SA的小鼠血清、小鼠多抗腹水及正常小鼠血清进行ELISA反应的OD值之间的差异有统计学意义(F＝563.092，P＝0.000)。

实施例6

合成肽的血清学实验。

将合成肽P1与10份正常人血清反应经间接ELISA方法检测，OD450nm值介于0.099～0.324之间，见图7所示。合成肽Pl与SA感染恢复期患者血清标本经间接ELISA方法检测，OD45nm值介于0.516～0.791之间，见图8所示。

如表4所示，统计学分析采用两样本t检验(Independent Samples T test)进行合成肽P1与恢复期患者血清及正常人血清得ELISA结果比较，差异有统计学意义(t＝14.395，P＝0.000)。

表4合成肽P1与恢复期患者血清及正常人血清得ELISA结果比较

同样，将合成肽P2与10份正常人血清反应经间接ELISA方法检测，OD450nm值介于0.050～0.300之间，见图9。合成肽Pl与SA感染恢复期患者血清标本经间接ELISA方法检测，OD45nm值介于0.413～0.570之间，见图10。

如表5所示，统计学分析采用两样本t检验(Independent Samples T test)进行合成肽P2与恢复期患者血清及正常人血清得ELISA结果比较，差异有统计学意义(t＝10.279，P＝0.000)。

表5合成肽P2与恢复期患者血清及正常人血清得ELISA结果比较

将合成肽P3与10份正常人血清反应经间接ELISA方法检测，OD450nm值介于0.052～0.297之间，见图11。合成肽P3与SA感染恢复期患者血清标本经间接ELISA方法检测，OD45nm值介于0.220～0.299之间，见图12。

如表6所示，统计学分析采用两样本t检验(Independent Samples T test)进行合成肽P3与恢复期患者血清及正常人血清得ELISA结果比较，差异无统计学意义(t＝2.421，P＝0.026)。

表6合成肽P3与恢复期患者血清及正常人血清得ELISA结果比较

通过上述实验可见，在体外免疫学实验研究中，应用ELISA方法检测的动物学实验、特异性实验和血清学结合实验中，合成肽P1、合成肽Pl、合成肽P2均具有良好的免疫原性、特异性和结合性。三者相对比而言，与合同肽P3相比，合成肽Pl、合成肽P2具有更好的免疫原性、特异性和结合性。而且对于合成肽Pl、合成肽P2，通过动物实验以及其后的血清学实验和特异性实验验证，运用ELISA方法并通过统计学分析表明这两条肽具有更好的免疫原性，且具有更好的SA特异性，可作为筛选患者血清的诊断试剂。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 深圳市南山区人民医院

<120> 用于金黄色葡萄球菌Staphopain B蛋白检测的B细胞抗原表位肽及其试剂盒

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Val Ser Gln Asn Pro Asn Asp Pro His Leu Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Thr Lys Asn Thr Asp Thr Tyr Asn Ala

1 5 10

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Pro Trp Asp Thr Glu Leu Ser Ile Gln Asp Ala Asp Ser

1 5 10