一种基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒及其制备方法

摘要

本发明公开了一种基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒，其制备方法，包括以下步骤：(1)纳米荧光碳点的制备；(2)荧光碳点表面巯基化修饰；(3)精氨酸‑赖氨酸接枝的二代肽类树状分子的制备；(4)荧光碳点表面修饰二代肽类树状分子；(5)两性离子聚合物聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的制备；(6)载药碳点的制备；(7)载药纳米粒的制备。该方法制备出的载药纳米粒具有碳点特有的荧光性质，对肿瘤部位酸性环境及高浓度的谷胱甘肽双重高敏感响应性，可以实现在肿瘤细胞内高选择性的快速释药，抗肿瘤效率高，安全性好，且有望实现肿瘤的诊疗一体化。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒及其制备方法。

背景技术

据世界卫生组织统计，肿瘤目前已经成为威胁人类健康的主要疾病之一。化学治疗仍是当前临床最常用且最有效而的手段之一，但由于化疗药物对肿瘤细胞没有明显的选择性，导致其在治疗过程中一部分作用于正常的细胞，产生严重的毒副作用。纳米载药系统的出现很好的解决了这些问题。一定粒径范围内的载药纳米粒子利用肿瘤部位增强的渗透与滞留效应(EPR效应)，可以通过被动靶向作用实现肿瘤部位的富集，同时对纳米载体进行一些功能化修饰，可以赋予载体系统一定的性质，以提高了化疗药物的抗肿瘤效果，这些特性使纳米载体在临床上有巨大的应用潜力。

随着纳米载体的不断发展，有研究表明纳米粒子在血液循环过程中会被蛋白质或者细胞粘附，导致人体网状内皮系统将其清除，不能发挥应有的作用。若纳米载体经过稳定长循环后经被动靶向作用富集于肿瘤部位，但能否被肿瘤细胞摄取，以及进入细胞之后能否快速的将药物释放出来发挥药效，是载药纳米胶束发挥抗肿瘤效果的重要前提。目前研究者们通过利用肿瘤部位与正常组织的差异，使纳米粒子实现对肿瘤部位特异性的响应性，如利用肿瘤部位相对较低的pH值、较高浓度的谷胱甘肽、较高浓度的某些蛋白酶等设计成pH敏感、氧化还原敏感、酶敏感的纳米粒子等。但大部分纳米材料中仅有一个敏感键，纳米粒子在肿瘤微环境中不能高敏感的快速响应，实现药物突释，难以达到药物治疗浓度，实现抗肿瘤作用。

因此，抵抗生物分子的吸附作用，提高纳米粒子在循环中的稳定性，加快纳米粒子释放药物速度，提高抗肿瘤效果和安全性是一项急需解决的难题。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的是提供一种基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒及其制备方法，可有效解决现有抗肿瘤过程中蛋白吸附多，载药纳米粒子释放药物速度慢，抗肿瘤效果和安全性差等问题。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)纳米荧光碳点的制备

将葡萄糖溶于水中，制成质量浓度为3-5g/mL的葡萄糖水溶液，加入PEG200，搅拌均匀后置于微波炉中，于800W条件下微波加热3-5min，冷却至室温，用水稀释，透析过夜，再过0.45μm滤膜，用去离子水稀释，得到浓度为2.5-3.5g/mL的纳米荧光碳点溶液；其中葡萄糖溶液和PEG200的体积比为2-5:8-20；

(2)荧光碳点表面巯基化修饰

将纳米荧光碳点溶液、EDC、和NHS混合，搅拌活化30-40min，接着加入胱胺避光反应过夜，反应结束后，将所得溶液透析24h，每4h换一次透析液，收集透析后的溶液，加入DTT搅拌过夜，将反应所得液再次透析48h，每4h换一次透析液，收集透析液，冷冻干燥后得巯基化的纳米荧光碳点；其中纳米荧光碳点、EDC、NHS、胱胺和DTT的摩尔比为8-10:1.8-2.2:1.8-2.2:0.8-1.2:3-7；

(3)精氨酸-赖氨酸接枝的二代肽类树状分子的制备

将甲酯保护的赖氨酸、N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸、EDC·HCl和HOBT加入反应容器中，抽真空-氮气循环三次，然后加入二氯甲烷搅拌溶解，接着在冰浴条件下加入DIEA，在室温下反应24h，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，再依次用HCl、NaOH水溶液和饱和NaCl溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁，干燥，旋蒸浓缩，纯化，得甲酯和N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)保护的肽类二代树状分子；其中甲酯保护的赖氨酸、N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸、EDC·HCl、HOBT和DIEA的摩尔比为1:2-3:2-3:2-3:6-9；

脱甲酯保护：将上述产物溶解于NaOH/MeOH溶液中，室温下搅拌反应6-7h后，旋蒸除去混合物中的MeOH，加入CHCl₃溶解残余物，在搅拌状态下滴加HCl调节溶液pH值至2-3，收集有机相，加入无水硫酸镁，干燥过夜，过滤后旋蒸除去溶剂，减压浓缩后得脱甲酯后的二代树状分子；

连接胱胺：将脱甲酯后的二代树状分子、胱胺、HBTu和HOBT置于反应容器中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入DIEA，在室温下反应20-24h，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入氯仿溶解产物，然后依次用HCl、NaOH水溶液和饱和NaCl溶液洗涤，收集有机相，加入无水硫酸镁，干燥过夜，旋蒸浓缩出固体产物；其中脱甲酯后的二代树状分子，胱胺，HBTu，HOBT，DIEA的摩尔比为2-3:1-1.5:2-4:2-4:6-9；

脱保护：取上述产物置于反应容器中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下加入三氟乙酸，之后在室温下搅拌反应6-8h，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得脱保护后的精氨酸-赖氨酸接枝的二代肽类树状分子；

(4)荧光碳点表面修饰二代肽类树状分子

将巯基化的纳米荧光碳点和步骤(3)所得物混合，加入0.01M，pH＝8的硼酸缓冲液溶解，封口后在室温下反应4-6h，收集反应液，透析48h，再过0.45μm滤膜，收集滤液，冷冻干燥得到产物；其中巯基化的纳米荧光碳点和步骤(3)所得物的质量比为1:1.5-2.5；

(5)两性离子聚合物聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的制备

以羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯作为反应单体，2-溴代异丁酸乙酯为引发剂，1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺为配体，置于反应容器中，真空-氮气循环三次后将甲醇：N,N-二甲基甲酰胺以体积比为1：1的混合物注入反应体系中，然后加入溴化亚铜，将反应体系密封，于60℃反应24-24h，然后透析，冻干后得产物；其中单体、引发剂、配体和溴化亚铜的摩尔比为40-50:1-1.5:2-2.5:1-1.5；

(6)载药碳点的制备

将步骤(4)所得产物和抗肿瘤药物溶于水中，避光反应4-8h，然后透析24h，每4h换一次透析液，收集透析后的溶液，冷冻干燥后得到包载药物的荧光碳点；其中抗肿瘤药物和步骤(4)所得产物的质量比为1:3-5；

(7)载药纳米粒的制备

将步骤(5)制得的产物与步骤(6)制得的产物以质量比1:2-3混合，在去离子水中搅拌过夜，将得到的混合液过0.45μm滤膜，收集滤液，冷冻干燥得到载药纳米粒。

进一步地，步骤(2)中纳米荧光碳点、EDC、NHS、胱胺和DTT的摩尔比为9:2:2:1:6.7。

进一步地，步骤(3)中甲酯保护的赖氨酸、N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸、EDC·HCl、HOBT和DIEA的摩尔比为1:2.4:2.4:2.4:7.2。

进一步地，步骤(3)中脱甲酯后的二代树状分子，胱胺，HBTu，HOBT，DIEA的摩尔比为2.1:1:2.4:2.4:7.2。

进一步地，步骤(4)中巯基化的纳米荧光碳点和步骤(3)所得物的质量比为1:1.6。

进一步地，步骤(5)中单体、引发剂、配体和溴化亚铜摩尔比为40:1:2:1。

进一步地，步骤(7)中步骤(5)制得的产物与步骤(6)制得的产物以质量比1:2混合。

本发明提供的一种基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒及其制备方法，具有以下有益效果：

(1)本发明利用肿瘤组织(pH＝6.8)，肿瘤细胞内溶酶体(pH值为4.5-6.0)与正常体液(pH＝7.4)的酸度差异，使纳米粒实现与不同酸度的梯度响应；同时利用肿瘤细胞内相对较高的谷胱甘肽浓度(10mmol/L)，双重刺激响应使载药纳米粒可以对肿瘤环境更加敏感，在肿瘤细胞内实现药物突释，有效发挥药效。

(2)本发明将两性离子聚合物包裹于纳米粒的外围，使其具有抗非特异性蛋白吸附的效果，纳米粒在血液中循环的过程中，可以保持稳定，减少网状内皮系统的清除作用，增加通过EPR效应聚集在肿瘤部位的纳米粒。

(3)荧光碳点作为一种具有荧光特性及良好生物安全性的纳米材料，将其运用到纳米材料中，赋予纳米载体荧光成像的性能，有望实现对肿瘤的诊疗一体化。

(4)纳米粒富集于肿瘤部位，由于其相对较低的pH值，pH＝6.8，两性离子发生电荷翻转，纳米粒解体，释放出载药碳点；由于碳点表面修饰了二代肽类树状分子，树状肽中的精氨酸可以促进载药碳点的入胞，提高抗肿瘤效果。

(5)本发明以3nm左右的具有荧光性质的碳点作为主体材料，并修饰了二代肽类树状分子，负载抗肿瘤药物后，将两性离子聚合物对其进行包裹，形成粒径为183nm左右的载药纳米粒，这一粒径范围内的载体，更容易通过EPR效应富集于肿瘤部位，该纳米粒对高浓度的谷胱甘肽及酸性环境的双重高敏度响应性，可实现其在肿瘤细胞内高选择性的快速释药，因此制备出的载药纳米粒具有生物相容性好、生物可降解性、无免疫原性，可以提高抗肿瘤效果，减小毒副作用。

附图说明

图1为一种基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒的制备过程；

图2为制备过程中所得纳米荧光碳点的红外谱图；

图3为制备过程中所得纳米荧光碳点的粒径分布及TEM图；

图4为制备过程中所得中间产物的核磁图谱；其中，图4(a)为纳米荧光碳点的核磁图谱；图4(b)为巯基化荧光碳点的核磁图谱；图4(c)为荧光碳点表面修饰二代肽类树状分子的核磁图谱；

图5为实施例5所得产物的核磁图谱；

图6为基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒(载药纳米粒)的粒径分布及SEM图；

图7为制备过程中所得中间产物在PBS(0.01mol/L，pH7.4)中的电位图及两性离子聚合物在不同pH缓冲液中的电位图；

图8为基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒的荧光光谱图；

图9为基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒在不同pH及谷胱甘肽浓度下的药物释放曲线；

图10为基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒在不同时间点被细胞摄取的激光共聚焦照片。

图11为不同浓度纳米粒主要组分及载药纳米粒对4T1细胞的毒副作用图。

具体实施方式

一种基于肽类树形分子修饰荧光碳点的肿瘤微环境响应纳米粒的制备过程如图1所示，具体过程如下：

实施例1纳米荧光碳点的制备

采用微波加热法制备纳米荧光碳点：将4g葡萄糖溶于6mL水中混匀，在搅拌条件下加入20mL PEG200，搅拌混匀，然后将其置于微波炉中，在800W条件下微波加热3min，得到棕黑色的粘稠状液体，冷却至室温后，用少量水稀释，然后加入3500kD的透析袋中，用去离子水透析过夜，将得到的溶液过0.45μm滤膜，用去离子水稀释定容至100mL，得到浓度为3.0g/mL的纳米荧光碳点溶液。

将上述制备得到的纳米荧光碳点做红外分析、粒径及TEM形貌分析；其中红外图谱如图2所示，粒径分布和TEM图如图3所示。

由图2可知，在3370cm^-1处的峰属于-OH的伸缩振动，在1644cm^-1处的峰是C＝O的伸缩振动，1100cm^-1处的峰属于C-O-C的对称伸缩振动。FTIR谱图结果表明利用此方法制得的碳点表面富含羧基和羟基，使该碳点具有良好的水溶性，同时大量的羧基也可以对碳点进行进一步修饰。

粒径分析结果表明，经过微波法制得的该纳米荧光碳点平均粒径为3nm。扫描电镜观测结果可知，碳点为类球形的纳米粒，粒径分布均一，分散性良好，且放大后可观察到明显的晶格条纹，晶格间距为0.208nm,这与类石墨碳(sp²杂化碳)晶面间距相吻合，其结构初步定为具有类石墨的晶形。

同时，将冻干后产物做¹H-NMR扫描，核磁图谱如图4(a)所示。

实施例2巯基化荧光碳点的制备

取制备得到的纳米荧光碳点溶液80mL，加入EDC(1.31g，6.84mmol)和NHS(0.78g，6.84mmol)，搅拌活化30min，接着加入胱胺(0.52g，3.42mmol)搅拌避光反应过夜，反应结束后，将所得溶液加入3500kD透析袋中透析24h，透析液为去离子水，每4h换一次透析液，收集透析后的溶液，加入DTT(3.52g，22.86mmol)搅拌过夜，将反应所得液继续加入透析袋中透析48h，每4h换一次透析液，收集透析液，冷冻干燥后得到棕色固体即为巯基化的纳米荧光碳点。

将所得产物做¹H-NMR扫描，核磁图谱如图4(b)所示。

实施例3精氨酸-赖氨酸接枝的二代肽类树状分子的制备

取甲酯保护的赖氨酸H-Lys-OMe(5.00g，21.51mmol)、N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸Boc-Arg(Pbf)-OH(27.18g，51.61mmol)、EDC·HCl(9.89g，51.61mmol)和HOBT(6.97g，51.61mmol)放入100mL支口瓶中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入30mL二氯甲烷搅拌溶解，然后在冰浴条件下缓慢加入DIEA(25.58mL，154.83mmol)，在室温下反应24h，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入60mL的氯仿溶解产物，将溶解的产物溶液依次用HCl水溶液(1mol/L)、NaOH水溶液(1mol/L)和饱和NaCl溶液洗涤数次，收集有机相的氯仿溶液，加入适量无水硫酸镁，干燥过夜，旋蒸浓缩出产物，通过硅胶色谱法纯化产物，收集产物除去溶剂，得到白色的固体即为甲酯和N-叔丁氧羰基-N'-(2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)保护的肽类二代树状分子；

脱甲酯保护：将上述产物(1.00g，0.85mmol)溶解于NaOH/MeOH(1mol/L，20.0mL)溶液中，室温下搅拌反应6h后，旋蒸除去混合物中的MeOH，加入60mL CHCl₃溶解残余物，在搅拌状态下缓慢滴加HCl(1mol/L)以调节溶液pH值至2-3，使脱甲酯后的二代树状分子可以溶解在CHCl₃中，收集有机相，加入适量无水硫酸镁，干燥过夜，过滤后旋蒸除去溶剂，减压浓缩后得到白色固体即为脱甲酯后的二代树状分子；

连接胱胺：取上述制得的脱甲酯后的二代树状分子(0.45g，0.39mmol)、胱胺(28.88g，0.19mmol)、HBTu(0.18g，0.45mmol)和HOBT(0.07g，0.45mmol)放入100mL支口瓶中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入30mL二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下缓慢加入DIEA(0.23mL，1.35mmol)，在室温下反应24h，收集反应溶液，旋蒸除去溶剂，并加入60mL的氯仿溶解产物，将溶解的产物溶液依次用HCl水溶液(1mol/L)、NaOH水溶液(1mol/L)和饱和NaCl溶液洗涤数次，收集有机相的氯仿溶液，加入适量无水硫酸镁，干燥过夜，旋蒸浓缩出固体产物；

脱保护：取上述产物(0.40g，0.16mmol)放于支口瓶中，抽真空-氮气循环三次，在氮气状态下加入3mL二氯甲烷搅拌溶解，在冰浴条件下缓慢加入三氟乙酸(1.50mL，12.80mmol)，之后在室温下搅拌反应6h，减压除去溶剂及三氟乙酸，得到的产物在冰无水乙醚中沉淀，干燥后得到脱保护后的精氨酸-赖氨酸接枝的二代肽类树状分子。

实施例4荧光碳点表面修饰二代肽类树状分子

在圆底烧瓶中加入0.10g巯基化的纳米荧光碳点和实施例3所得物质(0.16g，0.15mmol)，再加入10mL的硼酸缓冲液(0.01M，pH＝8)溶解，封口后在室温下反应4h，收集反应后的溶液，放于3500kD透析袋中，用去离子水透析48h，将得到的透析液过0.45μm滤膜，收集滤液，冷冻干燥得到产物。

将所得产物做¹H-NMR扫描，核磁图谱如图4(c)所示。

实施例5两性离子聚合物聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯的制备

为获得聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯，我们采用ATRP法(原子转移自由基聚合法)进行制备：以羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯作为反应单体，以2-溴代异丁酸乙酯为引发剂，以1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺为配体，投入干燥的支口瓶中，真空-氮气循环三次以保证反应体系的无氧环境，以甲醇：N,N-二甲基甲酰胺按体积比为1：1混合的混合液为溶剂用注射器注入反应体系中，然后加入溴化亚铜，将反应体系密封，于60℃反应24h后将反应体系与空气连通，终止反应，得到反应初产物，然后用500-1000截留分子量的透析袋在中性水中透析除去未反应的单体、引发剂、配体、溴化亚铜、反应溶剂等小分析物质，冻干后得到产物聚羧酸甜菜碱甲基丙烯酸酯；其中单体、引发剂、配体和溴化亚铜摩尔比为40:1:2:1。

将所得产物做¹H-NMR扫描，核磁图谱如图5所示。

实施例6载药碳点的制备

取20mg实施例4制备得到的产物，加入5mg抗肿瘤药物盐酸阿霉素，在水中溶解并避光搅拌4h，使盐酸阿霉素充分吸附在碳点表面，反应结束之后将溶液置于3500kD透析袋中，用去离子水透析24h，每4h换一次水，除去未吸附的盐酸阿霉素，收集透析后的溶液，冷冻干燥后得到包载药物的荧光碳点。实施例7载药纳米粒的制备

将实施例5制得的产物与实施例6制得的产物以质量比1:2混合，在中性去离子水中搅拌过夜，将得到的混合液过0.45μm滤膜，收集滤液，冷冻干燥得到载药纳米粒。

用马尔文粒度仪检测上述载药纳米粒的粒径分布，如图6(a)所示，DLS结果表明纳米粒的粒径为d＝183±27nm。其次我们用SEM观测载药纳米粒的形貌，如图6(b)所示，该纳米粒为粒径均一，分散良好的纳米球体，其结果与DLS结果一致。

实施例8各组成部分的电位表征

利用马尔文粒度仪对CD、CD-SH、CD-S-SD、CD/DOX在pH＝7.4缓冲液条件下的电位进行研究。结果如图7(a)所示，CD的Zeta电位为-11.3mV,是因为以葡萄糖和PEG在微波辐射法下制得的碳点表面富含羧基，使得碳点表面带负电荷；碳点表面巯基化修饰后，CD-SH的Zeta电位为-10.8mV，是由于碳点表面部分羧基被巯基取代，使其Zeta电位升高；当将二代树状肽修饰到碳点表面后，由于树状分子外围的胍基带正电荷，且肽分布在外围，故测得的表面电位为-0.8mV；当与盐酸阿霉素共混合之后，CD/DOX的电位为+7.8mV，是由于盐酸阿霉素带明显的正电荷，可以与负电荷的碳点电荷吸附，包裹在碳点表面。

同时，我们研究了两性离子聚合物pCBMA在不同pH缓冲液中的Zeta电位。如图7(b)所示，在pH＝7.4中，该聚合物带Zeta电位为-1.6mV；带轻微负电性的原因是因为在其结构中存在的羧基，在pH＝7.4缓冲液中，羧基产生部分电离，使其电位为负，也正是由于在生理条件的pH下,带负电荷的两性离子聚合物可以与带正电荷的CD/DOX产生电荷互相作用，该聚合物链可以将若干载药碳点包裹在其中，形成200nm左右的纳米粒；同时，在pH＝6.8条件下，聚合物发生点和翻转，变为+7.6mV，这是由于在轻微偏酸的环境中，羧基趋向于呈现羧酸根的形式存在，而结构中的叔胺呈现电正性，使整个分子带正电；在pH＝5.0条件下，这一电正性趋势更加明显，其Zeta电位为-13.4mV，由于在偏酸性的条件下，两性离子聚合物发生电荷翻转，从负电荷变为正电荷，而电正性的载药碳点与两性离子聚合物之间的作用力是由于电荷作用，电荷的翻转导致载药纳米粒的解体，也体现了该纳米粒的酸敏感性。

实施例9纳米粒的荧光性表征

纳米粒将碳点包裹在其中，为了验证包裹碳点后的纳米粒保留了碳点的荧光性能，我们对碳点的荧光性进行研究。结果如图8所示，随着激发波长从320nm增加到500nm，最大发射波长逐渐红移，且强度不断变化，当波长达到360nm处时，发射荧光强度最大，所以该纳米粒具有荧光特性。

实施例10纳米粒对阿霉素的包载量及不同环境条件下的药物释放曲线

将包载有盐酸阿霉素的纳米粒溶解在水中，并按适当比例稀释，检测溶液在480nm处的吸收强度，通过紫外光光谱法，利用盐酸阿霉素在水中已知浓度的标准曲线，计算载药纳米粒中阿霉素的含量。计算结果表明，纳米粒对盐酸阿霉素的包封率为96.9％，载药量为16.1％，说明该纳米粒实现了超高的包封率和较高的载药量。

我们在不同条件的两种缓冲液中研究阿霉素在载药纳米粒中的释放曲线：

1)PBS缓冲液(pH＝7.4，0.01M)；

2)PBS缓冲液(pH＝5.5，0.01M)+10Mm DTT。

将1mg包载有阿霉素的纳米粒重悬于1mL蒸馏水中，并转移至透析袋(MWCO 3000-5000)中。，将透析袋分别浸入20mL以上两种不同的缓冲溶液中，在摇床中37℃下振荡孵育。在孵育至预计的时间点时，取出1mL含有释放的阿霉素分子的透析液用于紫外测量，同时加入等体积的相应缓冲液以补充孵育缓冲液，使其保持总体积不变。使用紫外分光光度计检测释放DOX在480nm处的吸收强度，使用具有已知浓度的阿霉素溶液的标准校准曲线来获得的数据，所有测量设置3个平行。

结果如图9所示，在1h时，纳米粒在含10Mm的pH＝5.5缓冲液中共释放药物24.9％，在3h时，药物释放量达到56.4％，在4h时，药物绝大多数已经被释放，释放量达到73.2％，之后药物释放量有轻微增减，并不断趋于稳定，实验结束时，药物最终释放78.1％。证明在酸性与DTT存在的条件下，纳米粒可以迅速作出响应，发生降解。酸性使两性离子聚合物与载药碳点分离，纳米粒解体；同时因为电荷作用吸附在碳点表面的阿霉素也由于质子化作用逐渐从碳点表面释放下来；同时，DTT的存在使树状分子从碳点表面降解，促进了阿霉素的释放。与之相对比的是，在pH＝7.4的缓冲液中，纳米粒在1h时紧释放3.9％，4h时累计释放量到达8.7％，增长速度明显较慢，在之后的实验中累计释放量基本不变。这一结果表明，该纳米粒在生理条件下可以保持非常低的释放量，且一直保持稳定状态。而当利用EPR效应富集于肿瘤部位后，在肿瘤细胞偏酸和谷胱甘肽含量偏高的条件下，可以迅速发生降解，释放药物，发挥药效。

实施例11激光共聚焦显微镜

将4T1细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种在35mm玻璃底细胞培养皿中，在培养箱中孵育24h，之后除去培养基后，用PBS清洗两遍，将细胞与纳米粒(DOX浓度10μg/mL)的培养基共孵育2h，6h，16h，待孵育时间到达后，弃去培养基并用PBS清洗细胞3次，加入1mL>

如图10所示，在2h时，CD通道及DOX通过均有荧光，表明已有一些载药纳米粒进入了细胞，分布在细胞质中，随着共孵育时间的延长，DOX及CD信号均增多表明更多的载药胶束被摄取进入细胞，当时间增加到6h时，不仅有更多的药物被摄取进入细胞质，同时细胞核中也出现了药物信号，这说明载药胶束在进入细胞后，在肿瘤细胞的微环境中发生了降解，将药物释放出来，药物经过扩散进入了细胞核，从而发挥效应。当时间延长到16h时，细胞形态逐渐消失，趋向于死亡。

实施例12细胞毒性及肿瘤抑制效果

利用4T1细胞，以CCK-8测定法评价该纳米粒的体外抗肿瘤能力及纳米粒主要组成成分的细胞毒性。

将细胞接种在96孔板(每孔5×10³个细胞)中，在培养箱中培养24h后，弃去培养基，用PBS清洗两次，分别加入含有不同浓度的纳米荧光碳点、二代树状分子、盐酸阿霉素、纳米粒的培养基，每孔100μL，每个浓度设置5个重复孔。在培养箱中孵育48h之后，弃去培养基，用PBS清洗3遍，每孔加入10μL>

结果如图11所示，对于CD和树状分子，在其与4T1细胞共培养48h后，各组细胞均表现出100％的细胞存活率，表明这两者在实验浓度范围内均具有良好的生物相容性，值得注意的是，随着CD浓度的增加，细胞的存活率大于100％，4T1细胞的存活率在110％左右，证明CD具有一定的促进细胞增殖的能力，更加促进了碳点在生物领域的应用。

同时，我们用相同的方法研究了该纳米粒和盐酸阿霉素的体外肿瘤抑制率。对于4T1细胞，随着DOX浓度的增加，纳米粒和盐酸阿霉素的肿瘤抑制率都增加。当DOX浓度为0.01μg/mL时,阿霉素和纳米粒对细胞均没有抑制作用。当浓度增加到0.1μg/mL时，阿霉素组的细胞存活率为67.3％，纳米粒组为100％，这可能是由于盐酸阿霉素作为自由药很容易通过渗透作用进入细胞发挥作用，而纳米粒的结构限制了其进入细胞。随着DOX浓度增加，阿霉素和纳米粒都表现出非常明显的抑制肿瘤细胞的效果。当浓度增加到1μg/mL时，纳米粒表现出明显的抑制肿瘤细胞生长的效果，肿瘤抑制率达到99.0％。

这一结果表明，该纳米粒可以实现良好的抗肿瘤效果，且其主要组成部分CD和树状分子均具有良好的生物相容性。