基于微通道反应器的含水微藻生物质直接转酯化方法

摘要

基于微通道反应器的含水微藻生物质直接转酯化方法，是利用悬浮剂悬浮含水率不高于95％的新鲜微藻生物质，之后注入微通道反应器中，使用硫酸或盐酸做催化剂，进行短链醇(C1‑C4)与细胞内油脂的转酯化反应，制备脂肪酸醇酯(fatty acid alkyl esters)。本发明的优点是，使用微通道反应器进行含水微藻生物质的转酯化反应，不需要对样品进行干燥和油脂提取处理，大大简化了样品前处理过程，且具有反应快速易于实现高通量的特点。这对微藻培养过程中脂肪酸成分快速分析检测与产油藻株筛选具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明涉及一种转酯化的方法，具体地说是使用微通道反应器酸催化下进行含水微藻生物质直接转酯化的方法。

背景技术

转酯化反应是基于气相色谱的油脂脂肪酸分析过程中不可缺少的过程。本实验室建立了酸催化含水微藻生物质直接转酯化技术，反应时间为1小时(BioresourceTechnology,176(0),284-287.)；Im等建立了一种使用共溶剂氯仿的方法进行含水微藻生物质直接转酯化，95℃下需反应1.5小时，达到91.1％的产率(Bioresource Technology,152,534-537.)。然而，以上技术虽然缩短了转酯化反应时间，却仍不能满足微藻培养过程中快速测定脂肪酸成分变化的要求。对于目前基于气相色谱的微藻油脂脂肪酸分析技术而言，由于转酯化反应本身的传质限制，含水微藻生物质直接转酯化仍是整个分析过程中的限速步骤。

微通道反应器由于其微型化的特征尺寸，使其较传统反应器相比具有比表面积大、传质传热效率高以及易于平行放大实现高通量的优势。常规酸催化转酯化反应的反应速率主要受两相反应物之间传质速率的限制，需要延长反应时间来提高转化效率，因此使用具有比表面积大、传质效率高的微通道反应器进行转酯化可以解决常规酸催化转酯化效率低的问题，缩短反应所需时间。在公开的中国专利CN 101148409 A和CN 1861751 A，以及不同研究团队发表的学术文献中，已使用微通道反应器进行转酯化反应，缩短了转酯化时间，(Chemical Engineering Science,104,610-618；Industrial&Engineering ChemistryResearch,47(5),1398-1403；Industrial&Engineering Chemistry Research,53(22),9325-9330)。但以上技术均使用液体油脂为原料，应用至微藻样品的脂肪酸成分分析中，仍需进行油脂提取过程，并未解决微藻脂肪酸成分分析耗时长的问题。

综上所述，现有的含水微藻生物质直接转酯化技术和基于微通道反应器的转酯化技术均各有优缺点，若能结合二者优势，将极大的提高含水微藻生物质转酯化操作效率，进而提高微藻生物质检测的时效性和后续加工的效率。然而，现有技术体系中，微通道反应器通道尺寸小，含水生物质在醇溶液中分布不均匀，导致反应通道堵塞或样品反应不均匀等问题的产生，使得直接微反应器含水微藻生物质转酯化一直未有成功报道。通过对上述难点进行分析，其突破核心是解决含水微藻生物质在反应体系的均匀分布。本发明首次引入了具有一定粘度和密度的“惰性”介质聚乙二醇作为悬浮剂，成功实现了含水微藻生物质在液体体系中的均匀稳定分散，进而完成后续的转酯化反应。

通常微藻培养液经不同收获如离心等处理初步除水后获得的微藻细胞称为藻泥(食品工业科技，36(4)，199-203)，不同微藻藻泥由于收获方式的不同含水量也会有些差异。微藻藻落通常指在固体培养基上生长的肉眼可见的微藻细胞群落(水生生物学报，37(3)，547-552)。

本发明通过使用特定的悬浮剂，使含水微藻生物质均匀分散在反应体系中，从而解决了应用微通道反应器进行含水微藻生物质的直接转酯化过程中管道堵塞问题，省略样品干燥和油脂提取步骤。并且，通过引入微通道反应器技术，大大加快了反应过程的传质效率，加速了转酯化反应速率，简化了微藻脂肪酸成分分析过程。可以预见的是，通过对微通道反应器快速转酯化技术的适当改造，即可应用至不同生物油脂样品脂肪酸成分分析，例如产油酵母等，这对复杂生物样品形成过程中的脂肪酸成分分析采用微量样品检测提供可行的方法，对与此相关的生产和研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用微通道反应器进行含水微藻生物质快速转酯化的方法，以解决现有脂肪酸成分分析过程繁琐、转酯化技术反应效率低、耗时长等问题。

一种利用微通道反应器进行含水微藻生物质快速转酯化的方法，首先使用预先配制醇溶液I(酸-短链醇溶液)重悬含水微藻生物质，再加入溶液II(悬浮剂-短链醇)，加入量为1-4倍溶液I体积，混合均匀。使用计量泵将上述混匀后的样品注入微通道反应器内开始反应，同时控制反应温度与反应时间。

其中，所述的微通道反应器为耐腐蚀的内径在0.2mm–1.0mm的毛细管微通道反应器。所述的短链醇通常应当理解为碳原子数为1～4的醇类，包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或异丁醇，其中优选甲醇或乙醇。所述的酸是硫酸或盐酸，其用量是短链醇体积的1％～10％，所述酸购自市售商品，常用规格为硫酸95％～98％，盐酸36％～38％。所述的转酯化反应温度50～120℃，反应时间在5-30min。所述悬浮剂应当具有较大的密度或粘度，并且能与短链醇具有相容性，同时在转酯化体系中不与其他物质发生反应的聚乙二醇系列化合物，其平均分子量在1000-10000之间；所述的含水微藻生物质为微藻培养液经离心或过滤除水后获得的含水量不高于95％的新鲜微藻生物质，也可以是经平板培养获得的微藻藻落。

本发明首次实现了含水微藻生物质在微通道反应器内的直接转酯化，与传统间歇式转酯化方法相比，省略了原料干燥和油脂提取步骤，由于微通道反应器传质传热效率高的特点，极大的加强了非均相反应物间的混合程度，从而具有更高的反应效率。其次，本方法与传统方法相比除了具有步骤简单，反应速度快、样品用量低的优点，还便于与气相色谱分析进行整合和偶联，实现微藻生物质脂肪酸成分的一步式分析，这对实现微量生物样品脂肪酸成分在线分析具有重要意义，尤其在微藻培养过程中，对微藻细胞内脂肪酸代谢分析等方面具有重要应用价值，也是传统间歇式转酯化方法无法实现的。

附图说明

图1是不同反应温度下含水微藻生物质微通道反应器内直接转酯化效率的薄层色谱检测结果图，其中(A)、(B)、(C)和(D)分别是标准品、实施例1、2、3所获得产物的薄层色谱结果。

具体实施方式

本发明首先提供一种基于微通道反应器的含水微藻生物质直接转酯化的方法，使用含水量在不高于95％的含水微藻生物质在微通道反应器内进行直接转酯化，省略了原料干燥和油脂提取步骤，并加快了转酯化反应速度。

下面通过具体实施例对本发明方法和结果进行说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明测的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明中的微通道反应器可直接购买商业产品，或通过与常规产品相同的加工方法加工而得，此处不再赘述。

表1、2、3、4分别是实施例1、2、3、4所获得的湛江等边金藻、微拟球藻和小球藻通过微通道反应器转酯化与传统烧瓶转酯化方法获得的脂肪酸成分对比表，表中BR，MR分别是传统烧瓶转酯化和微通道反应器内转酯化获得脂肪酸成分结果，-10％，+10％是基于传统烧瓶转酯化后获得结果±10％变异范围。对于通过微反应器转酯化获得的相对含量在10％以上的脂肪酸组分，其脂肪酸相对含量位于传统烧瓶转酯化结果±10％变异范围内，即认为微反应器转酯化方法获得的脂肪酸成分结果与传统烧瓶转酯化结果一致。

实施例1：

使用1mL预先配置的体积浓度6％的硫酸-甲醇溶液将离心湛江等边金藻培养液获得的30mg含水微藻生物质(质量含水量90％)重悬，加入2mL 0.8g/mL的聚乙二醇甲醇溶液，聚乙二醇平均分子量为4000，混匀后，使用注射泵注入到微通道反应器中，保留时间20min，反应温度90℃。反应结束后，收集出口样品，处理后样品使用气相色谱进行产物分析(采用标准品对比或质谱定性)，所获得脂肪酸的组成成分见表1。通过对比微通道反应器直接转酯化所得结果与传统烧瓶转酯化结果，本发明所获得的脂肪酸成分及相对含量均落在基于传统烧瓶转酯化结果±10％的可信变异范围内。且传统烧瓶转酯化方法至少需要1h，而本发明仅需反应20min，大大加快了微藻脂肪酸分析速度。另外，通过薄层色谱结果图1(90℃)可知，微藻生物质中含有的主要脂类物质(磷脂PC，甘油三酯TAG)经过微通道反应器反应后已转化成脂肪酸甲酯(FAME)，说明此方法获得的转化率较高。

实施例2：

使用1mL预先配置的6％的硫酸-甲醇溶液将离心微拟球藻培养液获得的100mg含水微藻生物质(质量含水量80％)重悬，加入3mL0.8g/mL的聚乙二醇甲醇溶液，聚乙二醇平均分子量为4000，混匀后，使用注射泵注入到微通道反应器中，保留时间15min，反应温度100℃。反应结束后，经出口处理样品使用气相色谱进行产物分析，所获得脂肪酸的组成成分见表2。薄层色谱结果见图1(100℃)可知，样品中主要反应物成分(磷脂PC，甘油三酯TAG)经过微通道反应器反应后全部转化成脂肪酸甲酯(FAME)，转化率接近100％。

实施例3：

过程同实施例1，使用2mL预先配置的4％的硫酸-甲醇溶液将离心微拟球藻培养液获得的100mg含水微藻生物质(质量含水量80％)重悬，加入4mL 0.7g/mL的聚乙二醇甲醇溶液，聚乙二醇平均分子量为6000，混匀后，使用注射泵注入到微通道反应器中，保留时间30min，反应温度80℃。反应结束后，经出口处理样品使用气相色谱进行产物分析，所获得脂肪酸的组成成分见表3。薄层色谱结果见图1(80℃)可知，样品中主要反应物成分(磷脂PC，甘油三酯TAG)经过微通道反应器反应后大部分转化成脂肪酸甲酯(FAME)，还有部分反应物并未转化。

实施例4：

使用1mL预先配置的6％的硫酸-甲醇溶液将离心三角褐指藻培养液获得的100mg含水微藻生物质(质量含水量90％)重悬，加入4mL 0.6g/mL的聚乙二醇甲醇溶液，聚乙二醇平均分子量为8000，混匀后，使用注射泵注入到微通道反应器中，保留时间15min，反应温度100℃。反应结束后，经出口处理样品使用气相色谱进行产物分析，所获得脂肪酸的组成成分见表4。

实施例5：

过程同实施例1，使用1mL预先配置的6％的硫酸-甲醇溶液将从平板收集的50mg小球藻藻落(质量含水量75％)进行重悬，加入2mL 1g/mL的聚乙二醇甲醇溶液，聚乙二醇平均分子量为3500，混匀后，使用注射泵注入到微通道反应器中，保留时间30min，反应温度90℃。反应结束后，经出口处理样品使用气相色谱进行产物分析，所获得脂肪酸的组成成分见表5。

表1湛江等边金藻微通道反应器内转酯化获得的脂肪酸成分表

组分名BR-10％+10％MRC14∶013.3±011.914.613.2±0.2C16∶07.8±07.08.57.4±0.2C16:1n75.7±05.16.35.4±0C16:2n41.1±0.21.01.31.1±0C18:1n910.6±0.19.611.710±0.1C18:1n70.9±0.10.81.00.8±0.1C18:2n63.4±03.13.83.4±0C18:3n39.8±08.810.89.9±0C18:4n332.6±029.335.933.8±0.3C18:5n33.5±0.13.13.83.7±0C22:6n311.3±010.112.411.2±0

说明：组分名列为脂肪酸的简写符号。以C16:1n7为例，其中“C16”表示脂肪酸分子碳原子数为16，冒号(：)后“1”表示脂肪酸分子具有一个碳碳双键，n后数字“7”表示双键键合的两个碳原子号码(从甲基端开始计数，另一端为羧基端)中较低者。

表2微拟球藻微通道反应器内转酯化获得的脂肪酸成分表

组分名BR-10％+10％MRC14:07.2±06.58.07.4±0.2C16∶033.6±030.237.033.5±0.1C16:1n723.1±0.120.825.423.2±0.1C18:1n911±09.912.110.7±0C18:2n62.6±02.42.92.6±0.1C20:4n65.4±04.85.95.3±0C20:5n317.1±0.115.318.817.2±0

表3微拟球藻微通道反应器内转酯化获得的脂肪酸成分表

表4三角褐指藻微通道反应器内转酯化获得的脂肪酸成分表

组分名BR-10％+10％MRC14∶07.1±06.47.87.2±0.1C16∶015±0.113.516.515.2±0C16:1n733.3±029.936.633±0.1C16:2n44.1±03.74.54.2±0C16:3n45.7±0.15.16.36.1±0.1C18:1n95±0.14.55.54.7±0.1C18:1n71.2±0.11.11.31.3±0C20:4n61.7±0.11.51.81.7±0C20:5n327±0.124.329.726.8±0.1

表5小球藻平板克隆藻落微通道反应器内转酯化获得的脂肪酸

成分表

组分名BR-10％+10％MRC16∶023.521.125.824.6C16:1n90.80.80.90.9C16:1n72.52.22.72.6C16:1n34.84.35.34.7C16:3n411.310.212.510.4C18:01.31.21.41.5C18:1n94.03.64.44.1C18:1n71.11.01.21.2C18:2n626.223.528.826.4C18:3n324.522.127.023.6

本发明的优点是，使用微通道反应器进行含水微藻生物质的转酯化反应，不需要对样品进行干燥和油脂提取处理，大大简化了样品前处理过程，且具有反应快速易于实现高通量的特点。这对微藻培养过程中脂肪酸成分快速分析检测与产油藻株筛选具有重要意义。