抗H7N9禽流感病毒中和抗体S28H及其应用

摘要

本发明提供了一种活性更强、特异性更强的抗H7N9禽流感病毒中和抗体及其应用。本发明抗体S28H与中和抗体A6进行比较，其特异性结合病毒血凝素蛋白(haemagglutinin，HA)的能力提高了30倍，并且中和H7N9禽流感病毒的活性也提高了接近10倍。本发明S28H抗体能够广泛用于实验室鉴定、诊断H7N9病毒感染；并具有应用于临床预防和治疗H7N9感染的前景。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及抗H7N9禽流感病毒中和抗体S28H及其编码基因，以及其在预防或治疗由H7N9禽流感病毒引起的疾病的药物中的应用。

(二)背景技术

H7N9禽流感是由禽流感病毒H7N9引起的急性呼吸道传染病。自213年2月以来，禽流感病毒H7N9的爆发严重威胁了公众健康，造成了较大的经济损失。目前，亟需一种针对H7N9感染有效的抗病毒治疗手段。

前期研究通过噬菌体展示技术，筛选得到了人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体A6(人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体A6、其制备方法及应用。专利授权号CN 104045709 B)，给各种病毒性传染病的特异性预防和治疗开辟了新思路，并在抗病毒感染生物医药领域中逐渐开发出一类新的抗病毒药物。

(三)发明内容

本发明目的是对现有人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗体A6进行改造，提供一种活性更强、特异性更强的抗H7N9禽流感病毒中和抗体及其应用。

本发明采用的技术方案是：

抗H7N9禽流感病毒中和抗体S28H，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.1：

LESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSISSGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAGGSTGDRHYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTS

SEQ ID No.2：

ELTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIHSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPAFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

本发明通过基因定点突变技术对A6进行改造，得到了新的中和抗体S28H，该抗体特异性结合病毒血凝素蛋白(haemagglutinin，HA)的能力和中和H7N9禽流感病毒的活性大为提高，具有较好应用前景。

本发明还涉及编码所述中和抗体S28H的基因。

具体的，编码重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。

SEQ ID No.3：

CTCGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTATTACAGTGGGAGCACCGACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGGGAGGATCCACTGGGGATCGGCACTACTACTACTACGGAATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCAGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTAGT

SEQ ID No.4：

GAGCTCACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTCACAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCCCCGGCGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA

本发明还涉及含有所述基因的载体，以及含有所述基因的宿主细胞。

本发明还涉及所述中和抗体在制备预防或治疗由H7N9禽流感病毒引起的疾病的药物中的应用。

本发明的有益效果主要体现在：本发明通过基因定点突变技术对A6进行改造，得到了新的中和抗体S28H，该抗体与中和抗体A6进行比较，其特异性结合病毒血凝素蛋白(haemagglutinin，HA)的能力提高了30倍，并且中和H7N9禽流感病毒的活性也提高了接近10倍，可广泛用于实验室鉴定、诊断H7N9病毒感染；并具有较好应用于临床预防和治疗H7N9感染的前景。

(四)附图说明

图1为病毒HA蛋白与A6复合物的晶体结构；

图2为A6抗体能够特异性结合病毒HA蛋白；

图3为S28H抗体能够特异性结合病毒HA蛋白；

图4为S28H抗体高效中和H7N9禽流感病毒。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：28H的构建及制备

基于禽流感病毒H7N9血凝素蛋白(HA)及其中和抗体A6的晶体结构(图1)，通过分析分子间相互作用力和空间位阻等发现了位于抗体轻链可变区28位的丝氨酸(S28)对复合物结构起着重要的辅助作用。针对其氨基酸特性设计突变，将该位点突变为组氨酸(28H)，从而得到新的抗体，命名为S28H。具体实验方法如下：

以原有的抗体A6为模版，利用突变引物进行PCR扩增。

扩增条件为：94℃，30s；55℃，30s；72℃，10min，共扩增35个循环。

突变引物序列为：

正向引物：

5’-CCGGGCAAGTCAGAGCATTCACAGCTATTTAAATTGGTATC-3’；

反向引物:

5’-GATACCAATTTAAATAGCTGTGAATGCTCTGACTTGCCCGG-3’。

扩增得到的产物即为S28H。利用S28H质粒转染人胚肾细胞HEK293F细胞，培养6天。收集培养细胞，10000rpm离心60min，转移上清至无菌瓶用于抗体蛋白纯化。取上清转移至层析柱中(含Protein A珠子)，让液体自然流出。再用PBS缓冲液冲洗三次，以便充分洗去杂蛋白。最后用甘氨酸-盐酸溶液(pH2.0)洗脱，用1.5mL离心管收集洗脱液，直至A280<0.1。用100KDa浓缩管将洗脱液浓缩至1mL，上样至Superdex 200 10/300分子筛层析柱，以得到更纯的抗体蛋白。

实施例2：S28H高特异性结合病毒血凝素蛋白(HA)

将纯化好的病毒HA蛋白进行连续梯度稀释，至0.078,0.156,0.3125,0.625,1.25和2.5nM。在室温(25℃)下，使用CM5芯片(GE Healthcare)在BIAcore 3000机器上进行表面等离子体共振测量(surface plasmon resonance，SPR)。用BIAcore 3000分析软件(BIAevaluation 4.1版)分析两种抗体A6、S28H与HA蛋白的结合动力学曲线，对二者与病毒蛋白的结合能力进行检测。

结果如图2～3所示，结果显示，A6与病毒HA高效结合，KD＝1.74e-11M(图2)；与之对比，S28H同样能够特异性结合病毒HA蛋白，且结合能力更强，KD＝5.48e-12M，约为A6的30倍(图3)。

实施例3：S28H高效中和H7N9禽流感病毒

将梯度稀释的A6和S28H抗体与100×TCID50H7N9病毒粒子相互混合(抗体终浓度分别为0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.60，3.10，6.25，12.50，25.00，50.00，100.00，200.00ng/ml)，于37℃孵育1小时。将混合液加入狗肾传代细胞(MDCK细胞)中，继续培养48小时后，对病毒感染情况进行检测，判断不同浓度抗体对H7N9病毒的中和作用效果。

结果如图4所示，两种抗体均能中和H7N9病毒；二者的半数抑制浓度(IC50)分别为4.38ng/ml和41.66ng/ml，S28H抗体的中和活性约为A6的10倍。

由以上实验可知，本发明抗体相比于中和抗体A6，够特异性结合病毒HA蛋白的能力和中和H7N9病毒的能力大为提高，提示其能够广泛用于实验室鉴定、诊断H7N9病毒感染，在抗病毒感染生物医药领域具有较好应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国医学科学院病原生物学研究所

<120> 抗H7N9禽流感病毒中和抗体S28H及其应用

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 228

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

Leu Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu

1 5 1015

Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Tyr Trp

202530

Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

354045

Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg

505560

Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu

65707580

Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly

859095

Ser Thr Gly Asp Arg His Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

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Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ala Phe

859095

Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser

100 105 110

Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala

115 120 125

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val

130 135 140

Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser

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Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr

165 170 175

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys

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aagggcctgg agtggattgg gtacatctat tacagtggga gcaccgacta caacccgtcc 180

ctcaagagtc gagttaccat atcagtagac acgtctaaga accagttctc cctgaagctg 240

agctctgtga ctgccgcgga cacggccgtg tattactgtg cgggaggatc cactggggat 300

cggcactact actactacgg aatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360

tcagcctcca ccaagggccc atcagtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

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cccaaatctt gtgacaaaac tagt 684

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