利用二氧化碳加富和内生菌互作提高植物提取效率的方法

摘要

本发明涉及重金属污染植物提取领域，旨在提供一种利用二氧化碳加富和内生菌互作提高植物提取效率的方法。包括：以自来水预培养超积累植物东南景天，选取根系长度为1‑2cm的幼苗，将其根系浸入内生菌复合菌液中接种，然后移栽至黑色塑料桶，其营养液中含镉；添加内生菌复合菌液后放入植物生长箱中培养，保持植物生长箱中二氧化碳的加富，每3天更换一次营养液，并维持菌体浓度；二氧化碳加富培养1个月后，收获植株。本发明利用二氧化碳富集技术提高光合作用和生物量，同时施加内生菌促进超积累植物对重金属镉的吸收和积累，解决了植物提取技术中植物生长缓慢，生物量小的缺陷，增强了超积累植物东南景天的环境适应性，显著提高了植物提取效率。

说明书

技术领域

本发明涉及重金属污染植物提取领域，尤其涉及一种利用二氧化碳加富技术和内生菌互作来提高植物提取效率的方法。

背景技术

植物提取修复是指利用重金属富集或超积累植物从环境中吸取一种或几种重金属，并将其转移、贮存到地上部分。与传统的物理、化学等修复工程措施相比，植物提取修复具有成本低，不破坏生态环境，不会造成二次污染等优势，具有广阔的应用前景。植物提取修复技术的应用有两个前提，一个是植物必须是重金属富集或超积累植物，能够积累高浓度的重金属元素，二是植物的生物量大，生长速率快。然而目前发现的大多数超积累植物生物量小，生长速率较慢，限制了植物提取修复技术的大面积推广应用，因此，创建新型高效的植物提取修复强化技术体系，非常迫切。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术中的不足，提供一种利用二氧化碳加富和复合内生菌互作提高植物提取效率的方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种利用二氧化碳加富和内生菌互作提高植物提取效率的方法，包括以下步骤：

(1)以自来水预培养超积累植物东南景天，选取根系长度为1-2cm的幼苗，将其根系浸入内生菌复合菌液中接种2h；

所述内生菌复合菌液中包括四种内生菌：红球菌属(Rhodococcus)、布丘氏菌属(Buttiauxella)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)和草螺菌属(Herbaspirillum)，其中红球菌属和布丘氏菌属的内生菌来源于超积累植物东南景天的根系，寡养单胞菌属和草螺菌属的内生菌来源于茎；内生菌复合菌液由四种内生菌的菌液按体积比1∶1∶1∶1混合而成，各菌液中的菌体含量为10⁹CFU>-1；

(2)将接菌处理后的东南景天幼苗移栽至装有营养液的黑色塑料桶，营养液中的镉浓度为50μM，向营养液中添加内生菌复合菌液，使菌体浓度为10⁶CFU/ml；将黑色塑料桶放入植物生长箱中培养，培养过程中保持植物生长箱中二氧化碳的加富浓度为800μL·L^-1，每3天更换一次营养液，并使营养液中菌体浓度维持在10⁶CFU/ml；

(3)二氧化碳加富培养1个月后，收获超积累植物东南景天，分析生物量及镉提取量。

本发明中，步骤(1)中所述预培养是指：将超积累植物东南景天放置于人工气候室中，用自来水预培养1周；培养时控制光照周期为14小时光照，昼夜温度为25/20℃，人工气候室的相对湿度维持在白天70％和晚上85％。

本发明中，四种内生菌的菌体通过下述方式获得：取超积累植物东南景天的茎和根系分别进行研磨，然后利用DF-ACC-Cd固体培养基对研磨液分别培养；挑选菌落进行划线，分别经纯化得到所述四种内生菌；

利用LB液体培养基活化上述四种内生菌，每种菌在25～35℃的条件下培养1～2天；将获得的菌液10000rpm离心5min，弃上清液；沉淀用无菌磷酸缓冲液清洗离心，去上清液连续操作3次，沉淀部分即为菌体，加入适量无菌水使菌液中的菌体含量为10⁹CFU>-1；将四种菌液按体积比1∶1∶1∶1混合后，用0.85％无菌NaCl溶液调细菌悬浮液OD₆₀₀为1.0-1.2，即得到内生菌复合菌液，此时菌液浓度为10⁹CFU>-1。

本发明中，步骤(2)中所述营养液的配方为：K₂SO₄，0.7mmol/L；KCl，0.1mmol/L；Ca(NO₃)₂·4H₂O，2mmol/L；MgSO₄·7H₂O，0.5mmol/L；KH₂PO₄，0.1mmol/L；H₃BO₃，10μmol/L；MnSO₄·H₂O，0.5μmol/L；ZnSO₄·7H₂O，0.1μmol/L；(NH₄)₄MoO₂₄·4H₂O，0.01μmol/L；20μmol/LFe·EDTA溶液中；用NaOH或HCl调整营养液pH5.8。

本发明中，步骤(2)中植物生长箱的控制条件为：湿度70％，昼夜温度25℃和20℃，白天光照100μmol·m^-2·s^-1，每天光照14个小时。

发明原理描述：

超积累植物东南景天(Sedum alfredii Hance)为多年生草本植物，茎、叶肉质状；根状茎横走，叶互生，下部叶常脱落。与一般植物不同，超积累植物东南景天是一种镉超积累植物，对镉具有很强的忍耐、吸收和积累能力。水培条件下东南景天能够在50μM的镉浓度下正常生长，并且对镉具有很强的富集能力。因此，超积累植物东南景天在镉污染提取修复中具有重要的应用价值。

二氧化碳浓度升高能够增强植物光合作用，促进植物根系的生长，提高养分和水分的利用效率，从而提高植物生物量。因此二氧化碳经常作为一种肥料，用以提高作物的产量。同时，微生物强化植物提取修复被认为是一种经济、环保、安全、高效的可靠方法，植物内生菌可以定殖在植物体内但不危害植物生长，同时可以通过分泌植物生长激素、铁载体、缓解乙烯产生、固氮作用以及溶解矿物态营养元素等过程促进植物的生长，从而提高超积累植物体内重金属的积累。所以内生菌作为一种生物强化剂在提高植物提取修复方面具有广泛的应用前景。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明将传统的施加高浓度二氧化碳的农艺措施和内生菌生物强化技术的思路相结合，发明一种新型的农艺措施，即利用二氧化碳富集技术提高超积累植物的光合作用和生物量，同时施加内生菌促进超积累植物对重金属镉的吸收和积累，解决了植物提取技术中植物生长缓慢，生物量小的缺陷，增强了超积累植物东南景天的环境适应性，避免了其他农艺化学措施调控中添加化学土壤改良剂引起的二次污染，显著提高了植物提取效率，是一种高效、安全、经济，环保的新型农艺措施。

附图说明

图1二氧化碳加富技术和复合内生菌互作对超积累植物东南景天生物量的影响；

图2二氧化碳加富技术和复合内生菌互作对超积累植物东南景天镉浓度的影响。

图3二氧化碳加富技术和复合内生菌互作对超积累植物东南景天镉提取量的影响。

图中：CO₂+M代表二氧化碳加富条件下接种复合内生菌；CO₂代表仅二氧化碳加富；M代表仅接种复合内生菌；CK代表对照。

具体实施方式

下面通过具体示例将进一步说明本发明方法的可行性和应用效果。

(1)将超积累植物东南景天放置于人工气候室中，用自来水预培养1周让其生根，培养过程中光照周期为14小时光照，昼夜温度为25/20℃。人工气候室的相对湿度维持在白天70％和晚上85％。

(2)另取古老铅锌矿山正常生长的超积累植物东南景天新鲜的茎和根系分别进行表面灭菌并研磨，然后利用DF-ACC-Cd固体培养基对研磨液分别培养；挑选菌落进行划线，分别经纯化得到四种内生菌的菌体：红球菌属SaSR1(Rhodococcus)、布丘氏菌属SaSR9(Buttiauxella)、寡养单胞菌属SaSS5(Stenotrophomonas)和草螺菌属SaSS13(Herbaspirillum)。其中，红球菌属SaSR1和布丘氏菌属SaSR9来源于根系，寡养单胞菌属SaSS5和草螺菌属SaSS13来源于茎。

需要特别说明的是：本发明所述四种内生菌的培养、筛选和鉴定方法均为现有公知技术，本领域技术人员依据本发明的试验条件完全能够重复再现四种内生菌的培养、筛选和纯化结果。四种内生菌的命名系根据业内通用命名法则确定，其编号可根据需要自行确定，本发明所用内生菌名称后的编号是申请人在筛菌时所用编号。

用LB液体培养基活化内生菌SaSR1、SaSR9、SaSS5和SaSS13，将获得的菌液10000rpm离心5min，弃上清液。沉淀用无菌磷酸缓冲液清洗离心，去上清液，连续操作3次，沉淀部分即为菌体，加入适量无菌水获得菌液，使菌液中的菌体含量为10⁹CFU>-1。将四种菌液按体积比1∶1∶1∶1混合后，用0.85％无菌NaCl溶液调细菌悬浮液OD₆₀₀为1.0-1.2，即得到内生菌复合菌液，此时菌浓度大致为10⁹CFU>-1。

选取健壮且长势一致且根系长度大约1-2cm的超积累植物东南景天接种复合菌液，将其根系浸没在配好的内生菌复合菌液中，接种2h。

(3)根据CO₂浓度不同和是否添加复合菌液的区别设置四个处理，分别为：350μL·L^-1CO₂，350μL·L^-1CO₂+复合菌液，800μL·L^-1CO₂，800μL·L^-1CO₂+复合菌液。将接菌处理后的东南景天幼苗移栽至黑色塑料桶，每个塑料桶种4株，所用营养液中的镉浓度为50μM，向营养液中添加内生菌复合菌液，使菌体浓度为10⁶CFU/ml。

营养液配方为：K₂SO₄，0.7mmol/L；KCl，0.1mmol/L；Ca(NO₃)₂·4H₂O，2mmol/L；MgSO₄·7H₂O，0.5mmol/L；KH₂PO₄，0.1mmol/L；H₃BO₃，10μmol/L；MnSO₄·H₂O，0.5μmol/L；ZnSO₄·7H₂O，0.1μmol/L；(NH₄)₄MoO₂₄·4H₂O，0.01μmol/L；20μmol/LFe·EDTA溶液中；用NaOH或HCl调整营养液pH5.8。

将黑色塑料桶移至植物生长箱中培养，培养过程保持植物生长箱中二氧化碳浓度为800μL·L^-1，每3天更换一次营养液，对于添加复合菌液的营养液，每次换营养液需要补充复合菌液保证营养液中菌体浓度维持在10⁶CFU/ml。植物生长箱的其他控制条件均为：湿度70％，昼夜温度25℃和20℃，白天光照100μmol·m^-2·s^-1，每天光照14个小时。生长一个月后，收获各植物生长箱中超积累植物东南景天，并检测其生物量和镉吸收积累量。

如图1-3所示，在二氧化碳加富条件下接种复合内生菌，植物生物量显著增加(图1)，根系和地上部分生物量分别提高了242.9％和121.6％，镉浓度和镉提取量也显著提高(图2，3)，地上部分和根系的镉浓度分别提高了57.4％和61.6％，地上部分和根系的镉提取量分别提高了287.8％和233.1％。对比实验表明，二氧化碳加富技术和复合内生菌互作对植物生长和重金属镉的提取积累有很好的促进作用，能够显著提高植物提取效率。