一种低功率白光驱动的线粒体靶向荧光探针光敏剂及其合成方法及应用

摘要

一种低功率白光驱动的线粒体靶向荧光探针光敏剂及其合成方法及应用，该光敏剂分子式为：简称为AIE‑FR‑TPP。本发明的优点是：其具有聚集诱导发光特性和斑马鱼线粒体靶向性的特点，在低功率白光照射下产生活性氧进行光动力治疗，并且可以实时监测斑马鱼线粒体对活性氧损伤的形态变化，作为有利的研究工具用于斑马鱼线粒体的荧光成像和光动力学治疗效果的实时监测。该探针光敏剂不仅具有斑马鱼线粒体特异性成像能力，还具有光动力学治疗性能，也可原位实时监测线粒体的活性氧损伤。

说明书

技术领域

本发明涉及基于荧光光敏剂的成像和光动力治疗技术，是一种低功率白光驱动，可用于诱发和实时监测斑马鱼线粒体活性氧损伤的荧光探针的制备方法。

背景技术

将成像和治疗试剂结合到单个探针中，实现对癌症进行可视化治疗的技术是目前迫切需要的。目前，各种诊疗手段中，光动力治疗由于其具有高的选择性，对正常细胞伤害小，非侵入性治疗等特点而受到广泛关注。光动力治疗方法主要依靠在光照条件下，光敏剂可以产生活性氧，从而诱导癌症细胞凋亡和组织破坏。深红/近红外发光(650-900nm)的荧光标记材料具有高的穿透性，并可有效避免生物组织自发荧光的干扰，体内血红蛋白、水、脂质对近红区荧光的吸收系数也最低，这有助于提高荧光成像的灵敏度，受到研究人员的青睐，但目前对于能够在深红/近红外发光的光敏剂的研究仍然是一项极大的挑战。与肿瘤传统手术、化疗和放疗方法相比，光动力治疗的优点是能选择性地消灭局部的原发和复发肿瘤，而不伤及正常组织；可与化疗和放疗同时进行，且均具有一定的协同作用；可缩小手术的范围和改善患者的愈后。光动力治疗已成为肿瘤防治研究中的一个十分活跃的领域。

聚集诱导发光(aggregation-induced emission,AIE)现象是生色团聚集时发生的一种独特的光学现象。2001年，唐本忠院士课题组首先发现了该现象(Chem.Commun.2001,1740)。他们发现1-甲基-1,2,3,4,5-五苯基噻咯(MPPS)在完全溶于溶液中时，基本没有荧光发射，而聚集态或固态表现出非常强的荧光发射，因此提出了“聚集诱导发光”的概念。AIE分子在聚集态或固态条件下优异的发光性质，为彻底解决传统有机荧光材料的荧光自淬灭问题提供了一个全新的途径。此后，国内外众多研究者对于AIE现象进行了深入的研究探索，利用AIE分子构筑新型化学/生物荧光探针的研究已成为研究热点，并且取得一些颇有意义的研究成果。在荧光生物成像方面，利用AIE分子构筑的荧光标记材料不仅解决了传统荧光分子的聚集荧光淬灭问题，并且通过增加荧光分子负载浓度的方法，可以极大地提高荧光标记材料的荧光强度和抗光漂白能力。在光动力治疗方面，发展新型近红外发光，荧光量子效率高的AIE分子，并将其用于恶性肿瘤的光动力学治疗，能够减小生物组织的背景干扰，提高荧光成像的信号强度和信噪比，增强活性氧产生，提高光动力治疗效果。因此，开发新型多功能荧光光敏剂，并将其用于光动力学治疗方面的技术是具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种深红/近红外荧光发射，斑马鱼线粒体靶向的荧光探针光敏剂及其合成方法，同时公开了该荧光探针光敏剂的用途，其具有聚集诱导发光特性和斑马鱼线粒体靶向性的特点，在低功率白光照射下产生活性氧进行光动力治疗，并且可以实时监测斑马鱼线粒体对活性氧损伤的形态变化，作为有利的研究工具用于斑马鱼线粒体的荧光成像和光动力学治疗效果的实时监测。该探针光敏剂不仅具有斑马鱼线粒体特异性成像能力，还具有光动力学治疗性能，也可原位实时监测线粒体的活性氧损伤。

本发明的技术方案：

一种低功率白光驱动的线粒体靶向荧光探针光敏剂，化合物名称为(((((2,5-双((Z)-2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)-2-氰基乙烯基)-1,4-亚苯基)双(苯胺基))双(4,1-亚苯基))双(氧基))双(丁烷-4,1-二基))双(三苯基膦)溴化物(简称AIE-FR-TPP)，在波长为488nm的紫外灯照射下发出红色荧光，该化合物AIE-FR-TPP的分子结构式为：

一种所述低功率白光驱动的线粒体靶向荧光探针光敏剂的合成方法，步骤如下：

1)将化合物1、碳酸钾、1,4-二溴丁烷与无水丙酮均匀混合，得到混合液；

2)将混合液加入圆底烧瓶中，加热回流48小时；

3)反应结束后，过滤除去未反应的碳酸钾得到滤液，然后浓缩旋干得到粗产物；

4)粗产物通过硅胶层析柱进行纯化，洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯(v/v＝10/1)，得到化合物2；

5)将化合物2、三苯基膦与乙腈均匀混合，得到混合液；

6)将混合液加入圆底烧瓶中，加热回流12小时；

7)反应结束后，除去溶剂，粗产物通过硅胶层析柱进行提纯，己烷/乙酸乙酯重结晶，得到AIE-FR-TPP。

步骤1)中所述化合物1、碳酸钾、1,4-二溴丁烷与无水丙酮的用量比为0.1mmol：0.15mmol：2.0mmol：1mL。

步骤5)中所述化合物2、三苯基膦与乙腈的用量比为0.09mmol：0.27mmol：10mL。

一种低功率白光驱动的线粒体靶向荧光探针光敏剂的应用，AIE-FR-TPP能在低功率白光照射下产生活性氧，用于杀死肿瘤细胞，方法是：

1)将AIE-FR-TPP溶解于二甲基亚砜中形成均一溶液，AIE-FR-TPP与二甲基亚砜的用量比为0.005mmol：1mL；

2)将步骤1)中所得二甲基亚砜溶液缓慢滴加至水中，得到AIE-FR-TPP溶液用于做后续实验；

3)AIE-FR-TPP对细胞毒性实验：

实验采用MTT法来评价AIE-FR-TPP对肺腺癌上皮细胞A549细胞的毒性作用，在含有不同浓度的AIE-FR-TPP培养基中培养A549细胞5小时，然后在白光(10mW>-2)下照射40分钟，测得A549细胞的存活率。

4)AIE-FR-TPP对斑马鱼的荧光成像实验：

斑马鱼的共聚焦成像实验在NikonA1型荧光共聚焦显微镜上进行，选取3天大的斑马鱼进行实验，先后用商用线粒体荧光探针MTG和探针光敏剂AIE-FR-TPP孵育斑马鱼2小时，在荧光共聚焦显微镜下观察，商用荧光探针MTG激发波长为488nm，在500-530nm范围收集图像，探针光敏剂AIE-FR-TPP激发波长为488nm，在662-737nm范围收集图像；

5)AIE-FR-TPP在活斑马鱼线粒体中活性氧产生情况实验：

斑马鱼的共聚焦成像实验在NikonA1型荧光共聚焦显微镜上进行，选取3天大的斑马鱼进行实验，先用1μMAIE-FR-TPP孵育2小时，再用10μM商用活性氧荧光探针DCF-DA孵育15分钟，用卵液洗三次，用4mW>-2的白光照射斑马鱼10分钟，荧光探针DCF-DA激发波长为488nm，在500-530nm范围收集图像；

6)AIE-FR-TPP在活斑马鱼线粒体中实时监测线粒体活性氧损伤情况实验：

在斑马鱼线粒体活性氧损伤的实验中，活斑马鱼用1μM的AIE-FR-TPP孵育2小时，然后暴露于4mWcm^-2的白光照射10-20分钟。

本发明的积极效果是：

该高聚集态深红/近红外荧光探针光敏剂具有聚集诱导发光特性和斑马鱼线粒体靶向性，不仅能进行线粒体荧光成像标记，而且能产生活性氧，杀死细胞。该荧光探针用低功率(4mW/cm^-2)白光作为激发光源，该光源具有易获得，对生物体光学损害低的优点。在荧光探针光敏剂表面修饰的靶向分子能够靶向细胞内的线粒体，将荧光探针高效地运送到细胞中的线粒体处，实现在线粒体中释放活性氧，引起线粒体损伤，导致细胞凋亡。该纳米粒子可用于肿瘤细胞的成像和治疗，具有操作简单、特异性好、疗效显著等优点，并且可以实时监测斑马鱼线粒体对活性氧损伤的形态变化，作为有利的研究工具用于斑马鱼线粒体的荧光成像和光动力学治疗效果的实时监测，为今后肿瘤的光动力学治疗提供新型材料。

附图说明

图1为荧光探针AIE-FR-TPP的紫外-可见吸收光谱图和荧光光谱图。

图2为荧光探针AIE-FR-TPP在不同比例的二甲基亚砜-水混合溶液中的荧光光谱图。

图3为AIE-FR-TPP在光照(10mW/cm^-2)下对A549细胞的毒性研究实验。

图4为AIE-FR-TPP对活斑马鱼线粒体成像的激光共聚焦图像。

图5为在白光照射(4mW/cm^-2)下，AIE-FR-TPP在活斑马鱼线粒体中活性氧产生情况的激光共聚焦图像。

图6为在白光照射(4mW/cm^-2)下，AIE-FR-TPP在活斑马鱼线粒体中实时监测线粒体活性氧损伤情况的激光共聚焦图像。

具体实施方式

下面通过实施例具体的说明本发明，但本发明不受下述实施例的限定。

实施例：

一种低功率白光驱动的线粒体靶向荧光探针，化合物名称为(((((2,5-双((Z)-2-(3,5-二(三氟甲基)苯基)-2-氰基乙烯基)-1,4-亚苯基)双(苯胺基))双(4,1-亚苯基))双(氧基))双(丁烷-4,1-二基))双(三苯基膦)溴化物(简称AIE-FR-TPP)，在波长为488nm的紫外灯照射下发出红色荧光，该化合物AIE-FR-TPP的分子结构式为：

其制备方法，步骤如下：

1)将化合物1(0.097g，0.1mmol)、碳酸钾(0.021g，0.15mmol)、1,4-二溴丁烷(0.432g，2.0mmol)和1mL无水丙酮均匀混合，得到混合液；

2)将混合液加入到10mL圆底烧瓶中，将混合液加热回流48小时；

3)反应结束后，过滤除去未反应的碳酸钾得到滤液，然后浓缩旋干得到粗产物；

4)粗产物通过硅胶层析柱进行纯化，洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯(v/v＝10/1)，得到化合物2；

5)将化合物2(0.112g，0.09mmol)和三苯基膦(0.071g，0.27mmol)与乙腈(0.9mL)均匀混合，得到混合液；

6)将混合液加入圆底烧瓶中，加热回流12小时；

7)反应结束后，除去溶剂，粗产物通过硅胶层析柱进行提纯，己烷/乙酸乙酯重结晶，得到AIE-FR-TPP。

所述荧光探针AIE-FR-TPP的合成路线表示如下：

该荧光探针的基本数据：

AIE-FR-TPP：¹H>6,TMS,ppm):δ8.12(s,4H),7.88-7.91(m,6H),7.74-7.83(m,28H),7.57(s,2H),7.20-7.24(t,J＝8.0Hz,4H),7.05-7.07(d,J＝8.8Hz,4H),6.92-6.94(d,J＝8.4Hz,4H),6.88-6.91(t,J＝8.0Hz,2H),6.78-6.80(d,J＝8.8Hz,4H),3.87-3.90(t,J＝6.0Hz,4H),3.62-3.69(m,4H),1.82-1.88(m,4H),1.64-1.67(m,4H)。

该荧光探针的光物理性质：

1)荧光探针AIE-FR-TPP的紫外-可见吸收光谱：

将荧光探针AIE-FR-TPP溶于二甲基亚砜/水(v:v＝2/98)的溶液中，至终浓度为500μΜ，如图1所示：测得其紫外-可见吸收光谱的最大吸收534nm左右，荧光发射在600-800范围内。

2)荧光探针AIE-FR-TPP在不同比例的二甲基亚砜-水混合溶液中的荧光光谱：

荧光探针AIE-FR-TPP在二甲基亚砜溶液中，几乎没有荧光，当溶液中水含量为70％时，荧光强度明显增强，并且荧光强度随着水含量的提高而逐渐增强。从图2中可以看出，当混合溶液中水含量小于70％时，溶液荧光微弱，这时的溶液是澄清的，没有聚集体产生；当水含量达到70％时，荧光探针AIE-FR-TPP开始聚集，荧光强度明显增强，当水含量为98％时，溶液的荧光强度是其纯二甲基亚砜溶液荧光强度的11倍。由此可见，荧光探针AIE-FR-TPP具有典型的AIE性能。

该荧光探针的应用：

3)光照下AIE-FR-TPP对A549细胞的毒性实验：

实验采用MTT法来评价AIE-FR-TPP对肺腺癌上皮细胞A549细胞的毒性作用。图3为光照条件下AIE-FR-TPP对A549细胞的毒性的研究实验，在含有不同浓度的AIE-FR-TPP培养基中培养A549细胞5小时，然后在白光(10mW>-2)下照射40分钟，测得A549细胞的存活率。如图3所示，当AIE-FR-TPP浓度为5μM时，细胞存活率在20％左右，说明在光照条件下，AIE-FR-TPP有明显的细胞毒性。因此，该材料可以作为肿瘤细胞光动力治疗的光敏剂使用。

4)AIE-FR-TPP对斑马鱼线粒体的荧光成像实验。

斑马鱼的共聚焦成像实验在NikonA1型荧光共聚焦显微镜上进行，选取3天大的斑马鱼进行实验。先后用商用线粒体荧光探针MTG和探针光敏剂AIE-FR-TPP孵育斑马鱼2小时，在荧光共聚焦显微镜下观察。商用荧光探针MTG激发波长为488nm，在500-530nm范围收集图像。探针光敏剂AIE-FR-TPP激发波长为488nm，在662-737nm范围收集图像。图4为AIE-FR-TPP对活斑马鱼线粒体成像的激光共聚焦图像，可以在斑马鱼线粒体中看到来自AIE-FR-TPP的红色荧光(大于660nm)与商用线粒体荧光探针MTG的绿色荧光完全重合，皮尔森相关系数为0.907，说明本专利中的荧光探针光敏剂AIE-FR-TPP具有斑马鱼体内线粒体深红/近红外荧光标记功能，可以作为一种新型的成像试剂应用于斑马鱼体内线粒体成像的研究中。

5)AIE-FR-TPP在活斑马鱼线粒体中活性氧产生情况实验

斑马鱼的共聚焦成像实验在NikonA1型荧光共聚焦显微镜上进行，选取3天大的斑马鱼进行实验。先用1μMAIE-FR-TPP孵育2小时，再用10μM商用活性氧荧光探针DCF-DA孵育15分钟，用卵液洗三次，用4mW>-2的白光照射斑马鱼10分钟。荧光探针DCF-DA激发波长为488nm，在500-530nm范围收集图像。如图5所示，用4mW>-2的白光照射后，活斑马鱼体内可见商用活性氧荧光探针DCF-DA的绿色荧光增强，说明探针光敏剂AIE-FR-TPP在斑马鱼线粒体内产生了活性氧，可用于线粒体的光损伤实验。

6)AIE-FR-TPP在活斑马鱼线粒体中实时监测线粒体活性氧损伤情况实验在斑马鱼线粒体活性氧损伤的实验中，活斑马鱼用1μM的AIE-FR-TPP孵育2小时，然后暴露于4mWcm^-2的白光照射10-20分钟。如图6所示，随着光照时间延长，斑马鱼线粒体内AIE-FR-TPP荧光逐渐变弱，由于AIE-FR-TPP具有AIE性质，即聚集在线粒体中会发出明亮的荧光，而分散后荧光消失，基于这一特性，此时的荧光减弱说明斑马鱼的线粒体被AIE-FR-TPP产生的活性氧所破坏。