完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法

摘要

本发明公开了一种完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法，该方法首先获取初级细胞样本并将初级细胞样本离心沉淀得到二级细胞样本，二级细胞样本固定后垂直等分放置在组织脱水盒内依次进行脱水、透明和浸蜡处理得到细胞固定样本，细胞固定样本以切面为底面垂直放入组织包埋盒内进行包埋并最终形成切片。本发明制作的每张切片均能呈现相同的细胞层次结构，使得恶性肿瘤细胞在每张切片的相同位置出现，避免了在连续的切片中存在恶性肿瘤细胞定位不可靠，甚至消失的现象，便于免疫细胞化学多项抗体标记时的比较分析，有效地协助细胞病理医生判断恶性肿瘤的来源及类型，提高细胞病理诊断的准确率，经临床应用效果好，实用价值高。

说明书

技术领域

本发明属于细胞病理学技术领域，具体涉及一种完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法。

背景技术

细胞病理学是以观察细胞的结构和形态变化来诊断和研究临床疾病的一门学科。在临床病理诊断中，常见的细胞学样本包括浆膜腔积液、痰液、尿液、各种灌洗液、宫颈细胞及细针穿刺标本等，由于取材方便、诊断快速、应用范围广泛、阳性结果的准确率高而使细胞病理学检查成为进行疾病筛查和肿瘤诊断的一种重要手段。在临床诊断过程中，细胞病理学普通涂片的制备方法是将细胞直接涂抹于载玻片上或离心后涂片，经固定、巴氏染色或苏木素-伊红染色后置于显微镜下观察。普通涂片有时会存在细胞较少、涂片质量不高或因细胞形态不典型、肿瘤细胞分化较好等情况，导致仅凭涂片上的细胞形态做出诊断具有一定的困难，而且细胞学样本不能长期保存，在一定程度上限制了其发展，细胞块石蜡切片的应用弥补了普通涂片的不足。细胞块石蜡切片的基本原理是将普通涂片制备完成后所有的残留物(细胞、微小组织块、凝血块及组织片段等)高度浓缩后固定，按照组织病理中组织块的处理方法，经过脱水、透明、浸蜡、包埋后制备成细胞蜡块，可实现连续切片和永久保存标本的目的。细胞块石蜡切片中常常包含有价值的诊断证据和不能被普通涂片所处理的组织碎片，细胞块石蜡切片作为普通涂片技术的补充，为细胞病理医师提供了全面评估样本的机会。对细胞蜡块做连续切片，拓宽了免疫细胞化学染色技术在细胞病理学中的应用。免疫细胞化学是利用已标记的特异性抗体与组织或细胞内的未知抗原发生抗原抗体反应的一种方法，该方法把结构与功能代谢相结合，有效地分析细胞的化学成分，细胞学用于对肿瘤原发及转移性的鉴别、原发部位的确定、未分化肿瘤特征的识别、功能分类及预后评估等，使细胞形态学诊断得到了更大的延伸和拓展。但是，采用传统的石蜡包埋切片制作方法中，将细胞蜡块水平放置在组织包埋盒内进行包埋，这种包埋方法制作的细胞块石蜡切片在连续切片后，有些切片中显示的细胞成分不同，当需要观察某种特定细胞时，在连续的切片中会存在该种特定细胞定位不可靠，甚至消失的现象。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供了一种能够完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法，该方法将细胞固定样本垂直等分切开，将多个细胞蜡块均以切面为底面垂直放置在组织包埋盒内进行石蜡包埋，可以实现反复切片，每张切片均能呈现相同的细胞层次结构，使得肿瘤细胞在每张切片的相同位置出现，避免了现有连续的切片中存在肿瘤细胞定位不可靠，甚至消失的现象，便于免疫细胞化学多项抗体标记时的比较分析，协助细胞病理医生判断恶性肿瘤的来源及类型，提高细胞病理诊断的准确率，经临床应用效果好，实用价值高，便于推广使用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、获取初级细胞样本：将收集的细胞液放入透明、平底的容器内，对所述细胞液进行前处理，得到初级细胞样本，将所述初级细胞样本放置在离心管中；

步骤二、获取二级细胞样本：将步骤一中装有初级细胞样本的离心管放置在离心机中进行离心处理，采用吸管吸去离心管中的上层清液后得到沉淀物，所述沉淀物为二级细胞样本；

步骤三、获取细胞固定样本：向步骤二中装有二级细胞样本的离心管中加入固定剂，对所述二级细胞样本固定6h～8h，当所述二级细胞样本的表面凝结成块时，得到细胞固定样本初样；当所述二级细胞样本的表面未凝结成块时，重复执行步骤二中的离心处理至步骤三中的固定，直至所述二级细胞样本的表面凝结成块，得到细胞固定样本初样；采用取样器将所述细胞固定样本初样从离心管中取出，采用一次性切片刀切去所述细胞固定样本初样的底部，得到圆饼状细胞固定样本；

步骤四、细胞蜡块的形成：以步骤三中得到的圆饼状细胞固定样本的圆面为底面，将所述圆饼状细胞固定样本水平放置在吸水纸上，再采用一次性切片刀将所述圆饼状细胞固定样本从其圆面垂直等分切开，获得多个等分细胞固定样本，采用拭镜纸将多个等分细胞固定样本一并包裹后放入组织脱水盒中，将组织脱水盒放入组织处理机中依次进行脱水、透明和浸蜡处理,得到多个等分细胞蜡块；

步骤五、石蜡包埋细胞块的形成：以步骤四中垂直等分切开的切面为底面，将多个等分细胞蜡块放置在组织包埋盒内进行石蜡包埋，形成石蜡包埋细胞块；

步骤六、细胞块切片的形成：采用切片机对所述石蜡包埋细胞块进行切片，得到M张细胞块石蜡切片，采用烤片机对M张细胞块石蜡切片中的m张细胞块石蜡切片进行烘烤，然后对烘烤后的m张细胞块石蜡切片进行脱蜡至水处理，采用自动载玻片染色机对脱蜡至水处理后的细胞块石蜡切片进行HE染色，得到HE染色细胞块切片，对HE染色细胞块切片进行镜检，当HE染色细胞块切片中存在肿瘤细胞时，另外选取M张细胞块石蜡切片中的n张细胞块石蜡切片，采用烤片机对n张所述细胞块石蜡切片进行烘烤，然后对烘烤后的n张细胞块石蜡切片进行脱蜡至水处理，采用全自动免疫组化染色机对脱蜡至水处理后的细胞块石蜡切片进行免疫细胞化学染色，得到免疫组化染色细胞块切片，该免疫组化染色细胞块切片为能够完整呈现恶性肿瘤细胞位置的免疫组化细胞块染色切片，其中，M≥3，n≥m，m+n＝M。

上述的完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法，其特征在于：步骤一中所述细胞液为浆膜腔积液，所述浆膜腔积液的前处理的过程如下：将浆膜腔积液放入透明、平底的容器中，然后将装有浆膜腔积液的容器放置在4℃的冰箱中静置15h～24h后，采用吸管吸取所述容器底部的灰白色层沉淀物作为初级细胞样本。

上述的完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法，其特征在于：步骤一中所述细胞液为血性液体，所述血性液体的前处理的过程如下：将血性液体放入透明、平底的容器中，然后将装有血性液体的容器放置在4℃的冰箱中静置15h～24h后，采用吸管从所述容器底部红细胞沉淀的表面灰白层沉淀物作为初级细胞样本。

上述的完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法，其特征在于：步骤一中所述细胞液为采用液基细胞保存液保存的呼吸道样本，所述细胞液的前处理的过程如下：将液基制片完成后所剩余的采用液基细胞保存液保存的呼吸道样本作为初级细胞样本。

上述的完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法，其特征在于：所述呼吸道样本为肺泡灌洗液、支气管粘膜刷取物和痰液中的一种。

上述的完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法，其特征在于：步骤二中所述离心机的转速为1800r/min～2000r/min，离心时间为10min～15min。

上述的完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法，其特征在于：所述离心管的容量为12ml或者50ml，当所述离心管的容量为12ml时，步骤四中将所述圆饼状细胞固定样本从其圆面垂直两等分切开；当所述离心管的容量为50ml时，步骤四中将所述圆饼状细胞固定样本从其圆面垂直三等分切开。

上述的完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法，其特征在于：步骤三中所述固定剂为乙醇，乙醇的质量浓度为95％。

上述的完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法，其特征在于：步骤六中所述切片机为轮转式切片机。

上述的完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法，其特征在于：步骤六中采用烤片机对m张所述细胞块石蜡切片进行烘烤的时间为10min；步骤六中采用烤片机对n张所述细胞块石蜡切片进行烘烤的时间为60min；所述烘烤的温度为70℃。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明合理地利用细胞固定样本中不同比重的细胞成分垂直分布在不同层次的特点，通过将细胞固定样本垂直等分切开得到多个等分细胞固定样本，并且在石蜡包埋时将多个细胞蜡块均以切面为底面放置在组织包埋盒内进行包埋，保证后期每张切片均能呈现相同的细胞层次结构，使得恶性肿瘤细胞在每张切片的相同位置出现，避免了在免疫细胞化学多个抗体染色时连续的切片中会存在恶性肿瘤定位不可靠，甚至消失的现象，方便医生判断恶性肿瘤的来源及类型，提高了细胞病理诊断的准确率，经临床应用效果好，实用价值高，便于推广使用。

2、本发明通过从圆面垂直等分切开圆饼状细胞固定样本，避免细胞块碎裂且使得多个等分细胞固定样本在放入脱水盒中不会挤压变形，确保多个等分细胞固定样本均能够保持原有的细胞层次结构，操作简单，步骤设计合理。

3、本发明通过对不同类型细胞液进行不同的前处理，可以从细胞液中获取数目最多的特定细胞，本发明使用范围广，具有极高的临床应用价值。

4、本发明的制作方法步骤简单、易于实现，实用效果好。

综上所述，本发明所制作的每张切片均能呈现相同的细胞层次结构，使得恶性肿瘤细胞在每张切片的相同位置出现，避免了在连续的切片中会存在恶性肿瘤细胞定位不可靠，甚至消失的现象，提高了细胞病理诊断的准确率，经临床应用效果好，实用价值高，便于推广使用。

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。

附图说明

图1为本发明方法的流程框图。

图2为本发明等分细胞固定样本的照片。

图3为本发明石蜡包埋细胞块的照片。

图4为本发明细胞块切片的照片。

图5为本发明HE染色细胞块切片的显微图。

图6为本发明CA125免疫组化染色细胞块切片的显微图。

图7为本发明AE1/AE3免疫组化染色细胞块切片的显微图。

图8为本发明CK7免疫组化染色细胞块切片的显微图。

附图标记说明:

1—等分细胞固定样本； 2—石蜡包埋细胞块。

具体实施方式

如图1所示的完整呈现恶性肿瘤细胞位置的细胞块石蜡切片制作方法，其具体步骤如下：

步骤一、获取初级细胞样本：将收集的细胞液放入透明、平底的容器内，对所述细胞液进行前处理，得到初级细胞样本，将所述初级细胞样本放置在离心管中；

优选地，步骤一中所述细胞液为血性液体，所述血性液体的前处理的过程如下：将血性液体放入透明、平底的容器中，然后将装有血性液体的容器放置在4℃的冰箱中静置15h～24h后，采用吸管从所述容器底部红细胞沉淀的表面灰白层沉淀物作为初级细胞样本。

优选地，步骤一中所述细胞液为血性液体，所述血性液体的前处理的过程如下：将血性液体放入透明、平底的容器中，然后将装有血性液体的容器放置在4℃的冰箱中静置15h～24h后，采用吸管从所述容器底部红细胞沉淀的表面灰白层沉淀物作为初级细胞样本。

优选地，步骤一中所述细胞液为采用液基细胞保存液保存的呼吸道样本，所述细胞液的前处理的过程如下：将液基制片完成后所剩余的采用液基细胞保存液保存的呼吸道样本作为初级细胞样本；所述呼吸道样本为肺泡灌洗液、支气管粘膜刷取物和痰液中的一种。

需要说明的是，所述细胞液为浆膜腔积液、血性液体和呼吸道样本中的一种，其中，呼吸道样本为肺泡灌洗液、支气管粘膜刷取物和痰液中的一种，对不同的细胞液进行不同的前处理，可以从细胞液中获取数目最多的特定细胞，使用范围广，临床应用价值高。

本实施例中，采用浆膜腔积液为例，将浆膜腔积液放置在4℃的冰箱中静置24h后，以便获得数目最多的细胞，采用吸管吸取所述容器底部灰白色层沉淀物10ml放入容量为12ml的离心管中作为初级细胞样本；

步骤二、获取二级细胞样本：将步骤一中装有初级细胞样本的离心管放置在离心机中进行离心处理，采用吸管吸去离心管中的上层清液，得到沉淀物，所述沉淀物为二级细胞样本；

本实施例中，将带有初级细胞样本的离心管放置在低速离心机中离心，所述低速离心机的转速为1800r/min，离心时间为10min；具体实施时，所述离心机为安徽中科中佳科学仪器有限公司生产的低速离心机，所述离心机的型号为KDC-170，型号为KDC-170的低速离心机的离心半径为16cm；

步骤三、获取细胞固定样本：向步骤二中装有二级细胞样本的离心管中加入固定剂，对所述二级细胞样本固定6h～8h，当所述二级细胞样本的表面凝结成块时，得到细胞固定样本初样；当所述二级细胞样本的表面未凝结成块时，重复执行步骤二中的离心处理至步骤三中的固定，直至所述二级细胞样本的表面凝结成块，得到细胞固定样本初样；采用取样器将所述细胞固定样本初样从离心管中取出，采用一次性切片刀切去所述细胞固定样本初样的底部，得到圆饼状细胞固定样本；

本实施例中，所述固定剂为乙醇，乙醇的质量浓度为95％。

需要说明的是，在重力的作用下，所述细胞固定样本初样中比重最大的细胞成分分布在细胞固定样本的底层，比重最小的细胞成分分布在细胞固定样本的顶层，本实施例中，将带有二级细胞样本的离心管中加入质量浓度为95％的乙醇对所述二级细胞样本固定6h，人工观察到二级细胞样本的表面已经凝结成块，得到细胞固定样本初样，采用取样器将所述细胞固定样本初样从离心管中取出，采用一次性切片刀切去所述细胞固定样本初样的底部得到圆饼状细胞固定样本，所述圆饼状细胞固定样本自上而下依次为炎细胞与间皮细胞混合层I、恶性肿瘤细胞层II以及红细胞层III；

步骤四、细胞蜡块的形成：以步骤三中得到的圆饼状细胞固定样本的圆面为底面，将所述圆饼状细胞固定样本水平放置在吸水纸上，再采用一次性切片刀将所述圆饼状细胞固定样本从其圆面垂直等分切开，获得多个等分细胞固定样本1，采用拭镜纸将多个等分细胞固定样本1一并包裹后放入组织脱水盒中，将组织脱水盒放入组织处理机中依次进行脱水、透明和浸蜡处理,得到多个等分细胞蜡块；

本实施例中，所述离心管的容量为12ml或者50ml，当所述离心管的容量为12ml时，步骤四中将所述圆饼状细胞固定样本从圆面垂直两等分切开；当所述离心管的容量为50ml时，步骤四中将所述圆饼状细胞固定样本从圆面垂直三等分切开。

需要说明的是，通常初级细胞样本放置在12ml或者50ml的离心管中，其中，12ml离心管的内径为1.5cm，50ml离心管的内径为2.2cm，在实际使用过程中，采用12ml离心管所形成的圆饼状细胞固定样本从圆面垂直两等分切开；采用50ml离心管所形成的圆饼状细胞固定样本从圆面垂直三等分切开，合理利用圆饼状细胞固定样本中不同比重的细胞垂直分布在不同层次的特点，使得在后期包埋过程中，当多个等分细胞固定样本均以等分切开的切面为底面放置时，既确保多个等分细胞固定样本的高度均不超过0.75cm，又避免多个等分细胞固定样本碎裂且放入组织包埋盒中不会挤压变形，同时，使得多个等分细胞固定样本均能够保持原有的层次放置在组织包埋盒中。由于切片的厚度通常为3um～5um，所述细胞固定样本能够满足几百张切片的需求，实现了连续切片；本实施例中，采用一次性切片刀将圆饼状细胞固定样本从圆面垂直两等分切开，获得如图2所示的两个等分细胞固定样本1，采用拭镜纸包裹两个等分细胞固定样本后放入组织脱水盒中，将组织脱水盒置入组织处理机中依次进行脱水、透明和浸蜡处理，其中，脱水处理为梯度脱水处理，其具体过程为：依次采用70％乙醇60min，85％乙醇60min，95％乙醇第一缸60min，95％乙醇第二缸40min，100％乙醇第一缸60min，100％乙醇第二缸40min；透明处理过程为：二甲苯第一缸透明60min，二甲苯第二缸透明40min；浸蜡处理过程为：石蜡第一缸浸蜡30min，石蜡第二缸浸蜡40min，石蜡第三缸浸蜡60min；具体实施时，所述组织处理机为Leica公司生产的型号为ASP 300S的组织处理机；

步骤五、石蜡包埋细胞块的形成：以步骤四中等分切开的切面为底面，将多个所述细胞蜡块放置在组织包埋盒内进行石蜡包埋，形成石蜡包埋细胞块2；

需要说明的是，多个所述细胞蜡块均以步骤四中等分切开的切面为底面放置在组织包埋盒内进行石蜡包埋，保证后期每张切片均能呈现相同的细胞层次结构，使得某种特定细胞在每张切片的相同位置出现，从而使得存在恶性肿瘤细胞的切片能够完整地呈现恶性肿瘤细胞的位置和层次，进而避免了在连续的切片中会存在恶性肿瘤细胞定位不可靠，甚至消失的现象，便于免疫细胞化学多项抗体标记时的比较分析，有效地协助医生判断恶性肿瘤的来源及类型，提高细胞病理诊断的准确率，经临床应用效果好，实用价值高，便于推广使用；本实施例中，待组织处理机处理完毕后从组织处理机中取出所述组织脱水盒，打开所述组织脱水盒后剥掉包裹在所述细胞蜡块上的拭镜纸，以等分切开的切面为底面，将两个等分细胞蜡块均放置在组织包埋盒内进行石蜡包埋，形成如图3所示的石蜡包埋细胞块2；具体实施时，所述组织包埋盒放置在石蜡组织包埋机中进行包埋，所述石蜡组织包埋机为Thermo公司生产的型号为Histocentre3的石蜡组织包埋机；

步骤六、细胞块切片的形成：采用切片机对所述石蜡包埋细胞块(2)进行切片，得到M张细胞块石蜡切片，采用烤片机对M张细胞块石蜡切片中的m张细胞块石蜡切片进行烘烤，然后对烘烤后的m张细胞块石蜡切片进行脱蜡至水处理，采用自动载玻片染色机对脱蜡至水处理后的细胞块石蜡切片进行HE染色，得到HE染色细胞块切片，对HE染色细胞块切片进行镜检，当HE染色细胞块切片中存在肿瘤细胞时，另外选取M张细胞块石蜡切片中的n张细胞块石蜡切片，采用烤片机对n张所述细胞块石蜡切片进行烘烤，然后对烘烤后的n张细胞块石蜡切片进行脱蜡至水处理，采用全自动免疫组化染色机对脱蜡至水处理后的细胞块石蜡切片进行免疫细胞化学染色，得到免疫组化染色细胞块切片，该免疫组化染色细胞块切片为能够完整呈现恶性肿瘤细胞位置的免疫组化细胞块染色切片，其中，M≥3，n≥m，m+n＝M。

本实施例中，步骤六中采用烤片机对m张所述细胞块石蜡切片进行烘烤的时间为10min；步骤六中采用烤片机对n张所述细胞块石蜡切片进行烘烤的时间为60min；所述烘烤的温度为70℃。

本实施例中，所述切片形成的具体步骤如下：

步骤601、切片：采用切片机将石蜡包埋细胞块切成3um～5um厚的切片；需要说明的是，石蜡包埋细胞块2的切面与所述切片机刀片的刀面垂直，本实施例中，所述切片机为轮转式切片机，具体实施时，所述轮转式切片机为Leica公司生产的型号为RM2235的轮转式切片机。

步骤602、m张细胞块石蜡切片的烤片：采用烤片机对m张细胞块石蜡切片进行烘烤，所述烤片机的烤片温度为70℃，所述烤片机的烤片时间为10min；

步骤603、m张细胞块石蜡切片脱蜡至水：采用二甲苯进行第一级脱蜡10min，二甲苯第二级脱蜡10min，二甲苯第三级脱蜡10min，100％乙醇第一缸洗去二甲苯3min，100％乙醇第二缸3min，95％乙醇第一缸3min，95％乙醇第二缸3min，90％乙醇3min，85％乙醇3min，自来水浸洗3min；

步骤604、HE染色：采用自动载玻片染色机对脱蜡后的切片进行HE染色形成如图4所示的HE染色细胞块切片，采用显微镜观察所述HE染色细胞块切片，得到如图5所示的HE染色细胞块切片显微图，从图5中可以看出，HE染色细胞块切片显微图从左至右依次分布着炎细胞与间皮细胞混合层I、恶性肿瘤细胞层II和红细胞层III，能够完整呈现恶性肿瘤细胞的位置及层次，便于细胞病理医生进行诊断。显微镜下可见特定细胞，进一步执行步骤605至步骤607，当显微镜下未见到特定细胞时，则无需执行步骤605至步骤607，在实际应用中，所述特定细胞为需要鉴别诊断的细胞；

步骤605、n张细胞块石蜡切片的烤片：采用烤片机对n张所述切片进行烘烤，所述烘烤的温度为70℃，所述烘烤的时间为60min；

步骤606、n张细胞块石蜡切片脱蜡至水：采用二甲苯进行第一级脱蜡10min，二甲苯第二级脱蜡10min，二甲苯第三级脱蜡10min，100％乙醇第一缸洗去二甲苯3min，100％乙醇第二缸3min，95％乙醇第一缸3min，95％乙醇第二缸3min，90％乙醇3min，85％乙醇3min，自来水浸洗3min；

步骤607、免疫细胞化学染色：采用全自动免疫组化染色机进行免疫细胞化学染色，采用糖类抗原125(CA125)作为标记物并用显微镜观察得到如图6所示的CA125免疫组化染色细胞块切片的显微图，采用全角蛋白(AE1/AE3)作为标记物并用显微镜观察，得到如图7所示的AE1/AE3免疫组化染色细胞块切片的显微图，采用低分子角蛋白(CK7)作为标记物并用显微镜观察，得到如图8所示的CK7免疫组化染色细胞块切片的显微图。从图6、图7和图8可以看出，CA125、AE1/AE3和CK7免疫组化染色细胞块切片的显微图从左至右依次分布着炎细胞与间皮细胞混合层I、恶性肿瘤细胞层II和红细胞层III，需要说明的是，采用CA125、AE1/AE3和CK7作为标记物，红细胞层III不被标记，从图5、图6、图7和图8中可以看出，不同种类的细胞层层次明显，恶性肿瘤细胞层II分布在切片中同一个位置，避免了在连续的切片中会存在某种特定细胞定位不可靠，甚至消失的现象，细胞块的多张连续切片中，恶性肿瘤细胞位置相同，做免疫细胞化学染色时对比性强，便于多项抗体标记时的比较分析，对于疑难病例，可以反复切片，增加检测项目，有效地辅助细胞病理医师判断肿瘤来源及类型,提高诊断的准确性。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效结构变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。