基于银聚集体‑聚合物和金纳米线阵列的癌症标志物检测体系的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了基于银聚集体‑聚合物和金纳米线阵列的癌症标志物检测体系的制备方法及其应用，特点是包括以下步骤：（1）银聚集体‑聚合物SERS免疫探针的制备；（2）金纳米线阵列免疫基底的制备；（3）癌症标志物检测体系组装；其应用为将基于银聚集体‑聚合物和金纳米线阵列的癌症标志物检测体系利用拉曼光谱仪进行光谱测量，根据光谱强度与抗原浓度之间的定量关系，即可计算获得含待测抗原的磷酸盐缓冲溶液中抗原的浓度，优点是在获得较低检测极限的同时，提高检测结果的特异性和可重复性的基于银聚集体‑聚合物和金纳米线阵列的癌症标志物检测体系的制备方法及其应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种癌症标志物的检测方法，尤其是涉及一种基于银聚集体-聚合物和金纳米线阵列的癌症标志物检测体系的制备方法及其应用。

背景技术

近年来，随着人类生产生活节奏的不断加快，全球气候变暖，生物多样性锐减，区域性大气复合污染等环境破坏所导致的疾病问题愈发严重。研究表明70％以上的致癌和促癌因素与环境污染有着密切关系。随着光电子科学与技术的进步，特别是将微纳米制备技术、先进光电检测技术与现代生物技术相结合，人们已经开发出基于抗原抗体之间的高特异性免疫反应检测癌症特异性抗原的生物芯片。目前，表面增强拉曼散射(SERS)基免疫检测领域的一个研究热点和难点是如何获得进一步获得强度极高的信号输出，进而获得较低的免疫检测极限。研究表明，要获得较低的SERS基免疫检测极限，需在免疫基底中存在一些具有特别高电磁场强度的热点区域。因此，如何运用先进的微纳米材料制备技术，可控及简便地合成具有高SERS增强因子的热点，进一步促进SERS基免疫检测技术的发展成熟仍需较大努力。特别是通过设计制作均匀度较高，信号强度较大及寿命较长的免疫探针和基底对癌症病人的临床血清样本进行免疫测定，在获得较低检测极限的同时，提高检测结果的特异性和可重复性，以期提高癌症病患的康复和生存几率仍然是SERS基免疫检测领域的难点和重点工作。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种在获得较低检测极限的同时，提高检测结果的特异性和可重复性的基于银聚集体-聚合物和金纳米线阵列的癌症标志物检测体系的制备方法及其应用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于银聚集体-聚合物和金纳米线阵列的癌症标志物检测体系的制备方法，包括以下步骤：

(1)银聚集体-聚合物SERS免疫探针的制备

A.将1.47-4.41毫克柠檬酸钠和1.97-5.91毫克氯金酸溶于20-60毫升水制成混合溶液，于室温下边剧烈搅拌边加入0.6-1.8毫升新鲜配制的浓度为4毫克/毫升的硼氢化钠水溶液，得到金种子溶液；

B.取3-9毫升金种子溶液加入到50-150毫升含有硝酸银和柠檬酸钠的水溶液中，之后向其中逐滴加入10-30毫升浓度为2毫克/毫升的抗坏血酸水溶液，反应1小时得到银纳米颗粒水溶液；

C.取1-3毫升银纳米颗粒水溶液离心浓缩为10-30微升，向其中逐次加入820-2460微升二甲基甲酰胺，5-15微升含2-萘硫酚的二甲基甲酰胺溶液和20-60微升水，然后置于60℃烘箱中培养3小时之后，向其中加入80-240微升含有聚苯乙烯聚丙烯酸双嵌段共聚物的二甲基甲酰胺溶液和180-540微升水，然后置于110℃烘箱中培养2小时后离心，得到的沉淀物即为银聚集体-聚合物，将沉淀物重溶于的磷酸盐缓冲溶液中得到银聚集体-聚合物的缓冲溶液；

D.取1-3毫升银聚集体-聚合物的缓冲溶液，加入20-60微升含抗体的缓冲溶液，于4℃下反应2小时，离心去除多余未反应的抗体后，再加入10-30微升含牛血清白蛋白的缓冲溶液，于室温下反应1小时，以封闭银聚集体-聚合物未被抗体附着的位点，离心去除多余未反应的牛血清白蛋白后，即得到银聚集体-聚合物SERS免疫探针，并置于4℃下储存待用；

(2)金纳米线阵列免疫基底的制备

A.将亲水化的硅片置于浓度为1.1-3.3毫克/毫升的3-氨丙基三乙氧基硅烷水溶液中1小时使其表面修饰上氨基；将修饰有氨基的硅片置于粒径为3-5纳米的金纳米颗粒水溶液中2小时，使其表面吸附上金纳米颗粒；将吸附有金纳米颗粒的硅片置于含有4-巯基苯甲酸、氯金酸和抗坏血酸的水溶液中反应15分钟之后，即在硅片表面得到金纳米线阵列；

B.在金纳米线阵列上滴加20-60微升含抗体的缓冲溶液(浓度为2-6毫克/毫升)于4℃下反应2小时，清洗去除多余未反应的抗体后，再滴加10-30微升含牛血清白蛋白的缓冲溶液于室温下反应1小时，以封闭金纳米线阵列上未被抗体附着的位点，清洗去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到金纳米线阵列免疫基底，并置于4℃下储存待用；

(3)癌症标志物检测体系组装

将含待测抗原的磷酸盐缓冲溶液滴加到金纳米线阵列免疫基底上，将其置于37℃下静置2 小时，使抗原和抗体之间的免疫反应充分进行，清洗去除多余未反应的待测抗原；再将15 微升银聚集体-聚合物SERS免疫探针滴加到吸附有待测抗原的金纳米线阵列免疫基底上，于37℃下反应2小时，清洗去除多余未反应的银聚集体-聚合物SERS免疫探针，即得到基于银聚集体-聚合物和金纳米线阵列的癌症标志物检测体系。

步骤(1)B中所述的含有硝酸银和柠檬酸钠的水溶液中硝酸银浓度为0.2毫克/毫升以及柠檬酸钠浓度为0.6毫克/毫升；

步骤(1)C中所述的含2-萘硫酚的二甲基甲酰胺溶液中2-萘硫酚的浓度为10毫克/毫升；所述的含有聚苯乙烯聚丙烯酸双嵌段共聚物的二甲基甲酰胺溶液中聚苯乙烯聚丙烯酸双嵌段共聚物的浓度为8毫克/毫升；

步骤(1)D中所述的含抗体的缓冲溶液中抗体的浓度为2毫克/毫升，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液；所述的含牛血清白蛋白的缓冲溶液中牛血清白蛋白的质量浓度为3％，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液；

步骤(1)C和D中离心速度为5000-15000转/分钟，离心时间为5-30分钟。

步骤(2)A中所述的含有4-巯基苯甲酸、氯金酸和抗坏血酸的水溶液中4-巯基苯甲酸的浓度为0.85-2.55毫克/毫升，氯金酸的浓度为0.07-0.21毫克/毫升和抗坏血酸的浓度为 0.7-2.1毫克/毫升。

步骤(2)B中所述的含抗体的缓冲溶液中抗体的浓度为2-6毫克/毫升，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液；所述的含牛血清白蛋白的缓冲溶液中牛血清白蛋白的质量浓度为3％，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。

上述基于银聚集体-聚合物和金纳米线阵列的癌症标志物检测体系的应用，将所述的基于银聚集体-聚合物和金纳米线阵列的癌症标志物检测体系利用拉曼光谱仪进行光谱测量，根据光谱强度与抗原浓度之间的定量关系，即可计算获得含待测抗原的磷酸盐缓冲溶液中抗原的浓度。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了基于银聚集体-聚合物SERS 免疫探针和金纳米线阵列免疫基底的对癌症标志物具有较低检测极限的SERS基免疫检测体系及其应用，其通过抗原和对应抗体之间的高特异性免疫反应，形成银聚集体-聚合物SERS 免疫探针/待测抗原/金纳米线阵列免疫基底三层结构，利用表面增强拉曼散射效应，检测免疫探针表面拉曼标记物的特征指纹谱实现对待测癌症标志物抗原的检测，具有如下优点：

(1)其银聚集体-聚合物SERS免疫探针中银聚集体中团聚的银纳米颗粒个数可达10个以上，相互之间具有大量尺寸小于10纳米的间隙。在外来光的激发下，这些纳米间隙中会形成大量的拉曼热点区域，相比于单独存在的相同尺寸银纳米颗粒，可以产生极高强度SERS 信号输出。并且本发明通过在聚集发生后的适当时间内采用聚合物包裹的方式使银纳米颗粒的聚集终止，是一种可控的制备银聚集体的方法，所得到的聚集体中银颗粒的个数基本为 10个左右(如图1所示)，使银聚集体聚合物内部颗粒数目比较均一。在获得强度极高的 SERS信号输出的同时，显著提升了信号的稳定性。此外，本方法将拉曼标记分子包裹于聚合物之内，聚合物的外表面并没有分子附着。在进行之后的免疫反应时，相比于之前报道的表面标记有拉曼分子的金银聚集体，抗原抗体更容易大量吸附于本发明获得的干净外表面上，也可以促使之后获得的免疫检测极限大幅度降低。

(2)本发明中金纳米线阵列中的金纳米线长度可达1微米左右，相互之间近于平行竖直排列，由于纳米线排列紧密，在阵列表面会形成大量的纳米间隙。同时，纳米线具有较大的表面积/体积比，且其尖端具有的避雷针效应。在外来激发光的作用下，金纳米线产生的表面等离子体会在纳米线阵列表面进行传播和耦合，并在纳米间隙中产生大量的拉曼热点区域，同样能够获得较高强度的SERS信号输出。特别是发生免疫反应后，银聚集体-聚合物SERS免疫探针会附着于金纳米线阵列免疫基底表面，二者之间同样会发生等离子体耦合，进一步增强SERS信号，有利于在免疫检测中获得对待测抗原极低的检测限。此外，由于金纳米线的长度十分统一，使得金纳米线阵列的表面十分平整，保证了在发生免疫反应后银聚集体-聚合物SERS免疫探针对其表面的均匀涂覆。这一点同银聚集体聚合物内部颗粒数目的均一性一起，使得所获得的SERS信号具有高度的一致性。因此，采用本方案进行免疫检测具有极高的重复性(15次重复测试得到的拉曼信号如图3所示，其1064和1381cm^-1的强度标准偏差仅为3.8％和3.2％)和极低的检测极限(对前列腺特异抗原(PSA)的检测限达到1飞克每毫升)。

(3)本发明所采用的工艺过程简单，周期短，成本低，易于推广应用于癌症的临床检测之中。

附图说明

图1为本发明实施例1中制备的银聚集体-聚合物SERS免疫探针的透射电子显微镜照片；

图2为本发明实施例1中制备的金纳米线阵列免疫基底的透射电子显微镜照片顶视图一；

图3为本发明实施例1中制备的金纳米线阵列免疫基底的透射电子显微镜照片顶视图二；

图4为本发明实施例1中制备的银聚集体-聚合物SERS免疫探针和金纳米线阵列免疫基底通过和待测抗原进行免疫反应之后对基底进行拉曼检测得到的拉曼光谱图；

图5为本发明实施例1中制备的癌症标志物检测体系含待测抗原(浓度为1毫克每毫升)和未含待测抗原的对比拉曼光谱图；

图6为本发明实施例1中制备的银聚集体-聚合物SERS免疫探针和金纳米线阵列免疫基底通过和不同浓度的待测抗原(浓度为1毫克每毫升至1飞克每毫升)进行免疫反应之后对基底进行拉曼检测得到的拉曼光谱图；

图7为本发明实施例1中制备的癌症标志物检测体系拉曼谱中频移为1381cm^-1的特征峰强度随待测抗原浓度的变化图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例中使用的拉曼光谱检测仪BWS415购自美国必达泰克公司(B&W Tek Inc.)。癌症标志物是指由肿瘤细胞直接产生或由非肿瘤细胞经肿瘤细胞诱导产生的物质，以下实施例以前列腺特异抗原(PSA)、甲胎蛋白抗原和糖类抗原CA125为例子进行说明。

实施例1

基于银聚集体-聚合物和金纳米线阵列的前列腺特异抗原(PSA)检测体系的制备方法，包括以下步骤：

1、银聚集体-聚合物SERS免疫探针的制备

将1.47毫克柠檬酸钠和1.97毫克氯金酸溶于20毫升水制成混合溶液，于室温下边剧烈搅拌边加入0.6毫升新鲜配制的硼氢化钠水溶液(浓度为4毫克/毫升)，得到金种子溶液；

取3毫升金种子溶液加入到50毫升含有硝酸银(浓度为0.2毫克/毫升)和柠檬酸钠(浓度为0.6毫克/毫升)的水溶液中，然后向其中逐滴加入10毫升抗坏血酸水溶液(浓度为2毫克/毫升)，反应1小时得到银纳米颗粒水溶液；取1毫升银纳米颗粒水溶液离心浓缩为10 微升，向其中逐次加入820微升二甲基甲酰胺、5微升含2-萘硫酚的二甲基甲酰胺溶液(其中2-萘硫酚浓度为10毫克/毫升)和20微升水，然后置于60℃烘箱中培养3小时之后向其中加入80微升含有聚苯乙烯聚丙烯酸双嵌段共聚物(浓度为8毫克/毫升)的二甲基甲酰胺溶液和180微升水，再置于110℃烘箱中培养2小时后离心，得到的沉淀物即为银聚集体-聚合物，将沉淀物重溶于的磷酸盐缓冲溶液中得到银聚集体-聚合物的缓冲溶液；取1毫升银聚集体-聚合物的缓冲溶液，向其中加入20微升含有前列腺特异抗体的缓冲溶液于4℃下反应2小时。离心去除多余未反应的抗体后，向其中加入10微升含有牛血清白蛋白的缓冲溶液，于室温下反应1小时，以封闭银聚集体-聚合物未被抗体附着的位点。离心去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到银聚集体-聚合物SERS免疫探针，并置于4℃下储存待用。其中含抗体的缓冲溶液中抗体的浓度为2毫克/毫升，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液；含牛血清白蛋白的缓冲溶液中牛血清白蛋白的质量浓度为3％，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液；离心速度为5000转/分钟，离心时间为30分钟。

图1显示出本实施例中制备的银聚集体-聚合物SERS免疫探针的透射电子显微镜照片。从图1中可以看出，所制备的免疫探针中为核壳结构，中心为大量银纳米颗粒的聚集体，外层为聚合物壳层。

2、金纳米线阵列免疫基底的制备

通过等离子体清洗对大小为1平方厘米的硅片表面做亲水化处理。将亲水化的硅片置于 APTES水溶液(浓度为1.1毫克/毫升)中1小时，使其表面修饰上氨基。将修饰有氨基的硅片置于粒径为3-5纳米的金纳米颗粒水溶液中2小时，使其表面吸附上金纳米颗粒。将吸附有金纳米颗粒的硅片置于含有4-巯基苯甲酸(浓度为0.85毫克/毫升)、氯金酸(浓度为 0.07毫克/毫升)和抗坏血酸(浓度为0.7毫克/毫升)的水溶液中反应15分钟之后即在硅片表面得到金纳米线阵列。向金纳米线阵列上滴加20微升含前列腺特异抗体的缓冲溶液于 4℃下反应2小时。清洗去除多余未反应的抗体后，向其上滴加10微升含牛血清白蛋白的缓冲溶液于室温下反应1小时，以封闭金纳米线阵列上未被抗体附着的位点。清洗去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到金纳米线阵列免疫基底，并置于4℃下储存待用。其中含抗体的缓冲溶液中抗体的浓度为2毫克/毫升，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液；含牛血清白蛋白的缓冲溶液中牛血清白蛋白的质量浓度为3％，缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。

图2显示出本实施例中制备的金纳米线阵列免疫基底的透射电子显微镜照片顶视图，从图2可以看出，所制备的金纳米线阵列表面含有大量纳米间隙。

图3显示出本实施例中制备的金纳米线阵列免疫基底的透射电子显微镜照片顶视图，从图3可以看出，所制备的金纳米线阵列近乎垂直于硅片，排列致密。

3、癌症标志物检测体系组装

将含待测前列腺特异抗原的磷酸盐缓冲溶液滴加到金纳米线阵列免疫基底上，将其置于37℃下静置2小时，使抗原和抗体之间的免疫反应充分进行，清洗去除多余未反应的待测抗原；再将15微升银聚集体-聚合物SERS免疫探针滴加到吸附有待测抗原的金纳米线阵列免疫基底上，于37℃下反应2小时，清洗去除多余未反应的银聚集体-聚合物SERS免疫探针，即得到基于银聚集体-聚合物和金纳米线阵列的癌症标志物检测体系。

4、利用拉曼光谱仪对经上述步骤处理后得到的癌症标志物检测体系进行光谱测量可检测待测抗原。

图4为利用本实施例中制备的银聚集体-聚合物SERS免疫探针和金纳米线阵列免疫基底通过和待测抗原(浓度为10微克每毫升)进行免疫反应之后对基底进行拉曼检测得到的拉曼光谱图，从图4中可以计算得出15次重复测试得到的拉曼信号，其1064和1381cm^-1的强度标准偏差仅为3.8％和3.2％。

图5为利用本实施例中制备的银聚集体-聚合物SERS免疫探针和金纳米线阵列免疫基底通过和待测抗原(浓度为1毫克每毫升)进行免疫反应之后对基底进行拉曼检测得到的拉曼光谱图。从图5可以看出，当含有待测抗原时，可以检测到标记分子2-萘硫酚的较强拉曼特征谱，，其在1382cm^-1处的拉曼信号强度达到19957。前列腺特异抗原(PSA)的检测极限可达到1飞克每毫升。而当待测溶液中不含有待测抗原时，由于银聚集体-聚合物SERS>

图6为利用本实施例中制备的银聚集体-聚合物SERS免疫探针和金纳米线阵列免疫基底通过和不同浓度的待测抗原(浓度为1毫克每毫升至1飞克每毫升)进行免疫反应之后对基底进行拉曼检测得到的拉曼光谱图。从图6可以看出，当随着待测抗原浓度的降低，标记分子2-萘硫酚的拉曼特征谱强度逐渐降低，直到待测抗原的浓度降低到1飞克每毫升时，标记分子的拉曼特征峰相对于背景信号依然很明显，这一浓度即为本方案对待测抗原的检测极限。

图7为拉曼谱中频移为1381cm^-1的特征峰强度随待测抗原浓度的变化图，通过拟合可见，当待测抗原的浓度从1飞克每毫升变化到1毫克每毫升时，拉曼特征峰强度随浓度为线性变化。拟合结果显示，这一变化趋势符合Y＝2245.42+32865.44*LogX这一线性方程式，标准差为0.985，其中X为抗原的浓度，Y为拉曼特征峰强度。

实施例2

基于银聚集体-聚合物和金纳米线阵列的甲胎蛋白抗原检测体系的制备方法，包括以下步骤：

1、银聚集体-聚合物SERS免疫探针的制备：将2.94毫克柠檬酸钠和3.94毫克氯金酸溶于 40毫升水制成混合溶液，于室温下边剧烈搅拌边加入1.2毫升新鲜配制的硼氢化钠水溶液 (浓度为4毫克/毫升)，得到金种子溶液；取6毫升金种子溶液加入到100毫升含有硝酸银(浓度为0.2毫克/毫升)和柠檬酸钠(浓度为0.6毫克/毫升)的水溶液中，之后向其中逐滴加入20毫升抗坏血酸水溶液(浓度为2毫克/毫升)，反应1小时得到银纳米颗粒水溶液；

取2毫升银纳米颗粒水溶液离心浓缩为20微升，向其中逐次加入1640微升二甲基甲酰胺， 10微升含2-萘硫酚(浓度为10毫克/毫升)的二甲基甲酰胺溶液和40微升水，然后置于 60℃烘箱中培养3小时之后向其中加入160微升含有聚苯乙烯聚丙烯酸双嵌段共聚物(浓度为8毫克/毫升)的二甲基甲酰胺溶液和360微升水，然后置于110℃烘箱中培养2小时后离心将沉淀物(即银聚集体-聚合物)重溶于的磷酸盐缓冲溶液中；取2毫升银聚集体-聚合物的缓冲溶液，向其中加入40微升含甲胎蛋白抗体(浓度为2毫克/毫升)的缓冲溶液于4℃下反应2小时，离心去除多余未反应的抗体后，向其中加入20微升牛血清白蛋白的缓冲溶液(质量百分比为3％)，于室温下反应1小时，以封闭银聚集体-聚合物未被抗体附着的位点，离心去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到银聚集体-聚合物SERS免疫探针，并置于4℃下储存待用。其中离心速度为10000转/分钟，离心时间为20分钟。

2、金纳米线阵列免疫基底的制备

通过等离子体清洗对大小为1平方厘米的硅片表面做亲水化处理。将亲水化的硅片置于 APTES水溶液(浓度为1.1-3.3毫克/毫升)中1小时，使其表面修饰上氨基。将修饰有氨基的硅片置于尺寸为3-5纳米的金纳米颗粒水溶液中2小时，使其表面吸附上金纳米颗粒。将吸附有金纳米颗粒的硅片置于含有4-巯基苯甲酸(浓度为1.7毫克/毫升)、氯金酸(浓度为 0.14毫克/毫升)和抗坏血酸(浓度为0.14毫克/毫升)的水溶液中反应15分钟之后即在硅片表面得到金纳米线阵列，向金纳米线阵列上滴加40微升含甲胎蛋白抗体(浓度为4毫克/ 毫升)的缓冲溶液于4℃下反应2小时，清洗去除多余未反应的抗体后，向其上滴加20微升牛血清白蛋白的缓冲溶液(质量百分比为3％)于室温下反应1小时，以封闭金纳米线阵列上未被抗体附着的位点，清洗去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到金纳米线阵列免疫基底，并置于4℃下储存待用。

3、癌症标志物检测体系组装

将含待测甲胎蛋白抗原的磷酸盐缓冲溶液滴加到金纳米线阵列免疫基底上，将其置于37℃下静置2小时，使抗原和抗体之间的免疫反应充分进行，清洗去除多余未反应的待测抗原；再将15微升银聚集体-聚合物SERS免疫探针滴加到吸附有待测抗原的金纳米线阵列免疫基底上，于37℃下反应2小时，清洗去除多余未反应的银聚集体-聚合物SERS免疫探针，即得到基于银聚集体-聚合物和金纳米线阵列的癌症标志物检测体系。

4、利用拉曼光谱仪对经上述步骤处理后得到的癌症标志物检测体系进行光谱测量可检测待测抗原。

利用本实施例中制备的银聚集体-聚合物SERS免疫探针和金纳米线阵列免疫基底通过和待测抗原(浓度为1毫克每毫升)进行免疫反应之后对基底进行拉曼检测得到的拉曼光谱图可以看出，当含有待测抗原时，可以检测到标记分子2-萘硫酚的较强拉曼特征谱，其在 1382cm^-1处的拉曼信号强度达到17363。甲胎蛋白抗原的检测极限可达到2飞克每毫升。而当待测溶液中不含有待测抗原时，由于银聚集体-聚合物SERS免疫探针和金纳米线阵列免疫基底不能通过特异性免疫反应进行结合，而只发生少量非特异性吸附，因此，只测得很弱的拉曼光谱。

实施例3

基于银聚集体-聚合物和金纳米线阵列的对糖类抗原CA125检测体系的制备方法，包括以下步骤：

1、银聚集体-聚合物SERS免疫探针的制备

将4.41毫克柠檬酸钠和5.91毫克氯金酸溶于60毫升水制成混合溶液，于室温下边剧烈搅拌边加入1.8毫升新鲜配制的硼氢化钠水溶液(浓度为4毫克/毫升)，得到金种子溶液；

取9毫升金种子溶液加入到150毫升含有硝酸银(浓度为0.2毫克/毫升)和柠檬酸钠(浓度为0.6毫克/毫升)的水溶液中，之后向其中逐滴加入30毫升抗坏血酸水溶液(浓度为2毫克/毫升)，反应1小时得到银纳米颗粒水溶液；取3毫升银纳米颗粒水溶液离心浓缩为30 微升，向其中逐次加入2460微升二甲基甲酰胺，15微升含2-萘硫酚(浓度为10毫克/毫升)的二甲基甲酰胺溶液和60微升水，然后置于60℃烘箱中培养3小时之后向其中加入 240微升聚苯乙烯聚丙烯酸双嵌段共聚物(浓度为8毫克/毫升)的二甲基甲酰胺溶液和540 微升水，再置于110℃烘箱中培养2小时后离心将沉淀物(即银聚集体-聚合物)重溶于的磷酸盐缓冲溶液中；取3毫升银聚集体-聚合物的缓冲溶液，向其中加入60微升含糖类抗体 (浓度为2毫克/毫升)的缓冲溶液于4℃下反应2小时。离心去除多余未反应的抗体后，向其中加入30微升牛血清白蛋白的缓冲溶液(质量百分比为3％)，于室温下反应1小时，以封闭银聚集体-聚合物未被抗体附着的位点。离心去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到银聚集体-聚合物SERS免疫探针，并置于4℃下储存待用。其中离心速度为15000转/分钟，离心时间为5分钟。

2、金纳米线阵列免疫基底的制备

通过等离子体清洗对大小为1平方厘米的硅片表面做亲水化处理。将亲水化的硅片置于 APTES水溶液(浓度为3.3毫克/毫升)中1小时，使其表面修饰上氨基。将修饰有氨基的硅片置于尺寸为3-5纳米的金纳米颗粒水溶液中2小时，使其表面吸附上金纳米颗粒。将吸附有金纳米颗粒的硅片置于含有4-巯基苯甲酸(浓度为2.55毫克/毫升)，氯金酸(浓度为 0.21毫克/毫升)和抗坏血酸(浓度为2.1毫克/毫升)的水溶液中反应15分钟之后即在硅片表面得到金纳米线阵列。向金纳米线阵列上滴加60微升含糖类抗体(浓度为6毫克/毫升) 的缓冲溶液于4℃下反应2小时。清洗去除多余未反应的抗体后，向其上滴加30微升牛血清白蛋白的缓冲溶液(质量百分比为3％)于室温下反应1小时，以封闭金纳米线阵列上未被抗体附着的位点。清洗去除多余未反应的牛血清白蛋白后即得到金纳米线阵列免疫基底，并置于4℃下储存待用。

3、癌症标志物检测体系组装

将含待测糖类抗原的磷酸盐缓冲溶液滴加到金纳米线阵列免疫基底上，将其置于37℃下静置2小时，使抗原和抗体之间的免疫反应充分进行，清洗去除多余未反应的待测抗原；再将 15微升银聚集体-聚合物SERS免疫探针滴加到吸附有待测抗原的金纳米线阵列免疫基底上，于37℃下反应2小时，清洗去除多余未反应的银聚集体-聚合物SERS免疫探针，即得到基于银聚集体-聚合物和金纳米线阵列的癌症标志物检测体系。

4、利用拉曼光谱仪对经上述步骤处理后得到的免疫基底进行光谱测量可检测待测抗原。

利用本实施例中制备的银聚集体-聚合物SERS免疫探针和金纳米线阵列免疫基底通过和待测抗原(浓度为1毫克每毫升)进行免疫反应之后对基底进行拉曼检测得到的拉曼光谱图可以看出，当含有待测抗原时，可以检测到标记分子2-萘硫酚的较强拉曼特征谱，其在 1382cm^-1处的拉曼信号强度达到15221。糖类抗原CA125的检测极限达到2飞克每毫升。而当待测溶液中不含有待测抗原时，由于银聚集体-聚合物SERS免疫探针和金纳米线阵列免疫基底不能通过特异性免疫反应进行结合，而只发生少量非特异性吸附，因此，只测得很弱的拉曼光谱。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。