玉米PILNCR1及其在调控和检测玉米耐低磷胁迫中的应用

摘要

本发明公开了玉米PILNCR1及其在调控和检测玉米耐低磷胁迫中的应用。本发明公开的玉米PILNCR1，是如下a1)至a4)中的任一种：a1)序列表中序列1的第1‑649位所示的RNA；a2)序列表中序列1所示的RNA；a3)与a1)或a2)限定的RNA具有75％或75％以上同一性的RNA；a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的RNA杂交的RNA。实验证明，PILNCR1可通过与miR399结合，从而抑制miR399对靶基因PHO2的剪切，进而通过降低PHO2的表达量调控植物的耐低磷胁迫能力，PILNCR1在植物适应低磷胁迫中起重要作用，可用于调控和检测植物适应低磷胁迫能力。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，玉米PILNCR1及其在调控和检测玉米耐低磷胁迫中的应用。

背景技术

磷是植物生长发育所必需的矿质元素之一，以多种形式参与光合作用、呼吸作用、酶促反应等植物体内重要的生理生化过程。尽管土壤中总的磷含量很高，但是磷常与土壤中的阳离子形成不溶性的化合物被固定于土壤中，这导致土壤中磷的生物有效性非常低。植物会通过复杂的形态变化、生理生化反应来减轻低磷胁迫造成的伤害。植物在遭受到低磷胁迫时植株会变得矮小，株高可作为评估植物耐受低磷胁迫能力的指标。目前在拟南芥和水稻中的研究表明miR399可以在转录后水平对其靶基因PHO2进行剪切，抑制了PHO2对下游底物PHT1的泛素化降解，促进磷酸盐的吸收和转运，从而参与植物适应低磷胁迫过程。

LncRNA(long non-coding RNA)是一类长度大于200nt，没有蛋白编码能力的RNA。lncRNA可从染色质重塑、转录调控及转录后加工等多个方面对基因进行调控。随着高通量测序技术的发展，在拟南芥、水稻、玉米、棉花等植物中发现了大量的lncRNA，但是这些lncRNA的功能尚不清楚。玉米是全球种植面积最广泛的粮食和饲料作物，关于玉米中lncRNA的研究目前多集中于通过转录组分析发现新的lncRNA，这些lncRNA的调控机制和相关生物学功能还有待于进一步深入研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控和检测玉米的耐低磷胁迫能力。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种LncRNA，其名称为PILNCR1，是如下a1)至a4)中的任一种：

a1)序列表中序列1的第1-649位所示的RNA；

a2)序列表中序列1所示的RNA；

a3)与a1)或a2)限定的RNA具有75％或75％以上同一性的RNA；

a4)在严格条件下与a1)或a2)限定的RNA杂交的RNA。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的PILNCR1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的PILNCR1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要具有PILNCR1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本发明还提供了与PILNCR1相关的生物材料，为下述B1)至B5)中的任一种：

B1)编码PILNCR1的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)：

b1)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码PILNCR1的cDNA分子或基因组DNA分子；

b3)在严格条件下与b1)限定的核苷酸序列杂交，且编码PILNCR1的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的PILNCR1。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码PILNCR1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的编码PILNCR1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码PILNCR1且具有PILNCR1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

B2)所述的含有编码PILNCR1的核酸分子的表达盒(PILNCR1表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达PILNCR1的DNA，该DNA不但可包括启动PILNCR1转录的启动子，还可包括终止PILNCR1转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

可用现有的表达载体构建含有PILNCR1表达盒的重组载体。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为CPB载体。

B3)所述重组载体可含有序列2的DNA序列。进一步B3)所述重组载体具体可为CPB-PILNCR1。所述CPB-PILNCR1为通过BamH I向pCPB载体中插入序列2所示的DNA片段得到的表达序列1所示的RNA的重组载体。

所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌GV3101。

所述转基因细胞系可为转基因植物细胞系。所述转基因细胞系不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，本发明还提供了PILNCR1或所述生物材料的下述任一应用：

X1)在调控植物耐低磷胁迫能力中的应用；

X2)在制备调控植物耐低磷胁迫能力产品中的应用；

X3)在调控植物miR399含量中的应用；

X4)在制备调控植物miR399含量产品中的应用；

X5)在调控植物PHO2表达量中的应用；

X6)在制备调控植物PHO2表达量产品中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供了调控植物耐低磷胁迫能力产品，所述产品包括PILNCR1或所述生物材料。

其中，所述产品具体可以PILNCR1或所述生物材料为其活性成分，还可以将PILNCR1或所述生物材料与其他具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

为解决上述技术问题，本发明还提供了检测或辅助检测植物耐低磷胁迫能力的方法，所述方法包括：检测待测植物A和待测植物B中PILNCR1的含量，如所述待测植物A中PILNCR1的含量大于所述待测植物B，所述待测植物A耐低磷胁迫能力低于后候选低于所述待测植物B；如所述待测植物A中PILNCR1的含量小于所述待测植物B，所述待测植物A耐低磷胁迫能力高于后候选高于所述待测植物B。

上述方法中，所述检测待测植物A和待测植物B中PILNCR1的含量可通过定量PCR进行。

上述方法中，所述检测待测植物A和待测植物B中PILNCR1的含量可利用名称为P1的引物对进行，所述P1由序列2的第378-397位所示的单链DNA和与序列表中序列2的第553-576位核苷酸反向互补的单链DNA组成。

本发明中，所述植物或所述待测植物A或所述待测植物B可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物具体可为玉米。

实验证明，低磷胁迫会诱导本发明的PILNCR1表达，原位杂交结果表明PILNCR1和miR399表达部位一致，并且PILNCR1序列中存在一段与miR399互补的序列，烟草和玉米原生质体瞬时表达结果表明PILNCR1可通过与miR399结合，从而抑制miR399对靶基因PHO2的剪切，进而通过降低PHO2的表达量调控植物的耐低磷胁迫能力。在低磷胁迫下，PILNCR1在不同植株中的表达量不同,在低磷敏感植株中的表达量均高于耐低磷植株，说明PILNCR1的表达量与植株对低磷胁迫的耐受性存在相关性。说明，PILNCR1在植物适应低磷胁迫中起重要作用，可用于调控和检测植物适应低磷胁迫能力，对于植物耐逆性研究和育种具有重要意义。

附图说明

图1为PILNCR1与ZmmiR399的互补区。

图2为PILNCR1可以抑制ZmmiR399对ZmPHO2的剪切实验结果。

图3为原位杂交检测miR399与PILNCR1的表达部位。

图4为PILNCR1在不同耐低磷特性玉米自交系中的表达情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的pCPB载体(Liu W,Sun Q,Wang K,et al.Nitrogen LimitationAdaptation(NLA)is involved in source-to-sink remobilization of nitrate bymediating the degradation of NRT1.7in Arabidopsis[J].New Phytologist,2016,214(2).)公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的低磷敏感玉米自交系(31778、FR19、1538、JI419)和耐低磷玉米自交系(CCM454、XI14、HAI9-21、Q1261)均记载在文献(Du Q,Kai W,Cheng X,et al.Strand-specific RNA-Seq transcriptome analysis of genotypes with and without low-phosphorus tolerance provides novel insights into phosphorus-use efficiencyin maize[J].Bmc Plant Biology,2016,16(1):222.)中，公众可从申请人处获得这些生物材料，这些生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、玉米PILNCR1抑制miR399对PHO2的剪切

本实施例提供了一个来源于低磷敏感自交系31778的LncRNA，其名称为PILNCR1，PILNCR1的序列为序列表中序列1的第1-649位，序列1的第1位为PILNCR1的5′末端。PILNCR15′端的第404-428bp处存在一段与miR399成熟序列互补的序列，并且PILNCR1在miR399的第10、11位碱基之间存在3bp的突起，如图1所示。

为了研究玉米中PILNCR1对miR399和及miR399靶基因PHO2的作用，发明人将PILNCR1全长、PILNCR1_del(去除与miR399互补的序列)、miR399及PHO2全长分别连接到pCPB载体，并转化烟草和玉米原生质体，检测PHO2的表达情况。具体操作方法如下：

1、载体构建

(1)、pCPB-PILNCR1载体构建

利用限制性内切酶BamH I切割pCPB载体，通过In-Fusion(Clontech公司，产品目录号639648)将序列表中序列2所示的DNA片段(PILNCR1编码基因)插入至线性化的pCPB载体中，得到重组载体CPB-PILNCR1，CPB-PILNCR1中与PILNCR1基因相连的上下游序列均为BamH I的识别序列，CPB-PILNCR1能表达序列1的第1-649位所示的PILNCR1。

(2)、pCPB-PILNCR1_del载体构建

利用限制性内切酶BamH I切割pCPB载体，通过In-Fusion(Clontech公司，产品目录号639648)将序列表中序列2所示的DNA片段中缺失其第405-428位得到的DNA片段插入至线性化的pCPB载体中，得到重组载体CPB-PILNCR1_del，CPB-PILNCR1_del中与PILNCR1_del编码基因相连的上下游序列均为BamH>del能表达PILNCR1_del，与PILNCR1相比，PILNCR1_del缺失序列1的第1-649位所示PILNCR1的第405-428位。

(3)、pCPB-PHO2载体构建

利用限制性内切酶BamH I切割pCPB载体，通过In-Fusion(Clontech公司，产品目录号639648)将序列表中序列3所示的PHO2编码基因插入至线性化的pCPB载体中，得到重组载体CPB-PHO2，CPB-PHO2中与PHO2编码基因相连的上下游序列均为BamH I的识别序列，CPB-PHO2能表达序列4所示的PHO2的RNA。

(4)、pCPB-MIR399载体构建

利用限制性内切酶BamH I切割pCPB载体，通过In-Fusion(Clontech公司，产品目录号639648)将序列表中序列5所示的MIR399编码基因插入至线性化的pCPB载体中，得到重组载体CPB-MIR399，CPB-MIR399中与MIR399编码基因相连的上下游序列均为BamH I的识别序列，CPB-MIR399表达序列6所示的MIR399。

2、烟草中PILNCR1可以抑制miR399对PHO2的剪切

将pCPB空载体、pCPB-PHO2、pCPB-MIR399、pCPB-PILNCR1、pCPB-PILNCR1_del、p19(辅助质粒，记载在“Marillonnet,S.,Thoeringer,C.,Kandzia,R.,Klimyuk,V.,&Gleba,Y.(2005).Systemic>del和GV3101/p19。

将各重组菌接种于15ml含有50mg/L卡那霉素和25mg/L利福平抗性的LB液体培养基中，于28℃震荡培养至OD₆₀₀为1.0左右；4℃、4000rpm离心6min，去除上清，用悬浮液(10mMMES、10mM>2、200μM>600＝0.8-1.0，得到GV3101/pCPB菌液、GV3101/pCPB-PHO2菌液、GV3101/pCPB-MIR399菌液、GV3101/pCPB-PILNCR1菌液、GV3101/pCPB-PILNCR1_del菌液和GV3101/p19菌液。

将上述各菌液按照如下组合等体积混合后室温静置3h，然后注射6-8叶期的本氏烟草叶片，黑暗放置过夜后，正常培养2天取烟草叶片样品分析基因表达量：

组合1：GV3101/pCPB+GV3101/p19；

组合2：GV3101/pCPB-PHO2+GV3101/p19；

组合3：GV3101/pCPB-PHO2+GV3101/pCPB-MIR399+GV3101/p19；

组合4：GV3101/pCPB-PHO2+GV3101/pCPB-MIR399+GV3101/pCPB-PILNCR1+GV3101/p19；

组合5：GV3101/pCPB-PHO2+GV3101/pCPB-MIR399+GV3101/pCPB-PILNCR1_del+GV3101/p19。

结果如图2中A所示。利用小RNA Northern Blotting检测miR399的表达情况，利用U6作为内参，发现注射含有miR399组合(组合3-组合5)的烟草与组合1和组合2相比，miR399的表达量显著增加，但这些组合之间miR399的表达量差异较小，表明PILNCR1不影响miR399的表达。对PHO2进行荧光定量分析，发现与单独注射GV3101/pCPB-PHO2(组合2)相比，GV3101/pCPB-miR399与GV3101/pCPB-PHO2共转化时(组合3)，PHO2下调表达；GV3101/pCPB-miR399、GV3101/pCPB-PHO2与GV3101/pCPB-PILNCR1共转化时(组合4)，PHO2表达量与单独注射GV3101/pCPB-PHO2(组合2)相比基本不变，但显著高于GV3101/pCPB-miR399与GV3101/pCPB-PHO2共转化(组合3)的表达量；将PILNCR1中与miR399互补的序列突变后的GV3101/pCPB-PILNCR1_del与GV3101/pCPB-miR399和GV3101/pCPB-PHO2共转化(组合5)，发现PHO2的表达量显著低于单独注射pCPB-PHO2(组合2)的表达量。

其中，检测PHO2的表达量所用引物为5’-TAGTTTCACATCGCTCTTCGG-3’和5’-GCAGCACACTTGACTGATAATG-3’；

PILNCR1的检测引物为：5’-GCGCCGAGTTTTACCTCTCT-3’和5’-AACGTACACATTAATAAGGAGCCG-3’；

选用18S作为内参，引物序列为：5’-TGGTCATGGCCGTTCTTAGT-3’和5’-TCGGCCAAGGCTATAAACTCGT-3’。

miR399的定量采用茎环法测定，具体方法见(Varkonyi-Gasic E,Wu R,Wood M,etal.Protocol:a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantificationof microRNAs[J].Plant methods,2007,3(1):12.)，检测引物为：5’-GCCCTGCCAAAGGAGAGCT-3’和5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

采用Applied Biosystems 7500Real Time PCR system(ABI,USA)进行实时荧光定量，一次平行试验设置3次重复。采用2^-ΔΔCT法计算相对表达量。

3、玉米原生质体中PILNCR1可以抑制miR399对PHO2的剪切

将步骤1的pCPB-MIR399以及pCPB-MIR399+pCPB-PILNCR1等摩尔组合、pCPB-MIR399+pCPB-PILNCR1_del等摩尔组合分别转化玉米原生质体，培养14个小时，提取原生质体总RNA，利用pCPB载体作为对照。具体实验方法为：

原生质体的制备：选取正常土培条件下生长的CCM454幼苗叶片，切成0.5mm的细条，浸没在15ml酶解液(1.5％Cellulase R10,0.5％Macerozyme R10,0.4M Mannitol,20mMKCl,20mM MES pH 5.7,10mM>2,0.1％BSA,5mMβ-Mercaptoethanol)中60rpm酶解4个小时。加入等体积的W5溶液(125mM>2,154mM NaCl,5mM KCl,5mM Glucose,0.03％MES pH5.7)稀释含有原生质体的酶液。用100目筛子过滤含有原生质体的酶解液4℃，100g，离心2分钟沉淀原生质体。去除上清后用10ml W5溶液轻柔重悬原生质体，冰上静至原生质体30分钟。室温100g，离心2分钟沉淀原生质体，去除上清。加入1ml MMG溶液(15mM>2,0.1％MES>6cells>-1。

原生质体的转化：吸取25μg质粒DNA、500μl原生质体、500μl PEG4000溶液(45％PEG4000,0.8M Mannitol,1M>2)混匀，诱导20min，加入1ml>

结果如图2中B所示，发现当仅将pCPB-miR399转化玉米原生质体时，PHO2的表达量与对照相比显著下降；而将pCPB-miR399与pCPB-PILNCR1共转化时，PHO2的表达量于对照相比基本不变；当pCPB-miR399与pCPB-PILNCR1_del共转化时，PHO2的表达量与对照相比显著下降。这表明PILNCR1抑制了miR399对靶基因PHO2的剪切。

4、miR399与PILNCR1的表达部位一致

选取低磷胁迫处理7天的低磷敏感自交系31778叶片和根系为材料，通过原位杂交进一步检测miR399与PILNCR1的表达部位，结果如图3所示，miR399和PILNCR1在根系和叶片中都能检测到，并且主要在维管组织中表达。这表明miR399和PILNCR1的空间表达部位是一致的。

检测PILNCR1所用探针序列为：ACGCACGCAATGATCTACGTATCTAGCAGCAGCTTATCATGTCGTCATCATGCATGCATGGACGACGGCGGTCGTCATCTTATCTGGGAGCGCGCGTGTGTGTACATCTTGGCAATGGGAAGCTGCATGCGCCTCTCGGCCGGACGGCGCGTAGCTGTAGGGCGGCGTGCCATAGAGCTGCCTCCTGCCGCTCACCTTGCTGTTGAGGACGACTGATGGTGGCCATGGCCACTCGGCGTCGGTGGCGGCGGCGCCGAGTTTTACCTCTCTACTAAGGTAGGGCAACTTGTATCCTTTGGCAATTGTTCTCATATATCTGGGTCTGTCTGTTGGCTGCCCGGTGACGGTATACGGTGATGTTTAGTACTCAATTGGTCTTGGAGTTCATGCTACGGCTCCTCTGTTATATATTACACGGCTGACGGCT。

检测miR399所用探针序列为：GTGCAGCTCTCCTCTGGCATG。

实施例2、PILNCR1在不同耐低磷特性玉米自交系中的表达情况

采用绝对定量方法检测在正常磷和低磷胁迫条件下，低磷敏感玉米自交系(31778、FR19、1538、JI419)和耐低磷玉米自交系(CCM454、XI14、HAI9-21、Q1261)中PILNCR1的表达情况。

正常处理(正常磷条件)和低磷处理(低磷胁迫条件)方法如下：

挑选大小一致的、饱满的玉米种子，用3％NaClO浸泡20min，灭菌蒸馏水冲洗3-4次。蒸馏水室温浸泡种子6h，之后将种子埋入石英砂中(石英砂预先用盐酸浸泡过夜，蒸馏水冲洗2-3次)；28℃培养6-7天，当长出1叶1心时(约7天)，挑选大小一致的幼苗，切去胚乳，移入3L盆中进行正常处理或低磷处理，每盆3棵幼苗。正常处理移苗时使用1/2营养液，2天后换为全营养液；低磷处理移苗时使用1/2低磷营养液，2天后换为低磷营养液。每2天换一次营养液，共处理7天。培养条件为光照14h/10h、温度28℃/22℃。

全营养液配方为：0.75mM K₂SO₄、0.65mM>4·7H₂O、0.1mM>3)₂·4H₂O、0.2mM>3BO₃、1mM>4·H₂O、1mM>2O、0.1mM>4·5H₂O、0.005mM(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、150μM>2PO₄，利用2M>

低磷营养液配方为将全营养液中PO₄^3-的浓度由150μM改为5μM其他物质浓度均不变得到的营养液，为保证K⁺的浓度，以150μM>+为标准用KCl补齐，利用2M>

PILNCR1表达情况的具体检测方法如下：

将PILNCR1连接到pMD 18-T载体(TaKaRa)中得到重组载体T-PILNCR1。使用NANODROP 2000c(Thermo)测定浓度，将T-PILNCR1稀释成浓度分别为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸拷贝/μL的质粒溶液。

提取各玉米的总RNA并转录为cDNA，以各稀释后的质粒和反转录得到的cDNA作为模板，以PILNCR1的检测引物：5’-GCGCCGAGTTTTACCTCTCT-3’(序列2的第378-397位)和5’-AAAGTACACATTAATAAGGAGGAG-3’(与序列2的第553-576位互补)，采用Applied Biosystems7500Real Time PCR system(ABI,USA)进行荧光定量PCR反应，一次平行试验设置3次重复，反应完成后，得出质粒每个拷贝数所对应的C_T值。根据质粒浓度和C_T值，绘制标准曲线，结合样本的C_T值读数，计算得到每个样本中PILNCR1基因的表达情况。

结果如图4所示，在正常磷条件(正常处理)下，低磷敏感自交系和耐低磷自交系中PILNCR1的表达量均较低；在低磷胁迫处理7天后，PILNCR1的表达量均显著增高，并且在低磷敏感自交系中PILNCR1的平均表达量为每纳克RNA含有1.56E+06拷贝数，约为此时耐低磷自交系中的6倍。这表明在低磷胁迫条件下低磷敏感自交系产生更多的PILNCR1，这些PILNCR1会通过与miR399结合，抑制miR399对靶基因PHO2的剪切降解，PHO2会对下游底物PHT1的泛素化降解，从而降低了磷酸盐的吸收和转运，因此植株长的矮小。也进一步说明，在低磷条件下，玉米PILNCR1的表达量与其耐低磷胁迫能力相关，玉米耐低磷胁迫的能力越高，PILNCR1的表达量越低。

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 玉米PILNCR1及其在调控和检测玉米耐低磷胁迫中的应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 677

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221>

<400> 1

acauggggcc ccacgccccu cccccucuug auaagcccac gucggcggca gggggggcgg 60

ccgccaggcu ugcuauagcu gguccauggc accauacaug uaagcacgca cacaggcaca 120

cacacacacg cacgcaauga ucuacguauc uagcagcagc uuaucauguc gucaucaugc 180

augcauggac gacggcgguc gucaucuuau cugggagcgc gcgugugugu acaucuuggc 240

aaugggaagc ugcaugcgcc ucucggccgg acggcgcgua gcuguagggc ggcgugccau 300

agagcugccu ccugccgcuc accuugcugu ugaggacgac ugaugguggc cauggccacu 360

cggcgucggu ggcggcggcg ccgaguuuua ccucucuacu aagguagggc aacuuguauc 420

cuuuggcaau uguucucaua uaucuggguc ugucuguugg cugcccggug acgguauacg 480

gugauguuua guacucaauu ggucuuggag uucaugcuac ggcuccucug uuauauauua 540

cacggcugac ggcuccuccu uauuaaugug uacuuugaug augucauuaa uaauaugaau 600

cugaugauau ugaauaagug uuguccaaaa auguugguuu acuucaugca aaaaaaaaaa 660

aaaaaaaaaa aaaaagu 677

<210> 2

<211> 649

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>

<400> 2

acatggggcc ccacgcccct ccccctcttg ataagcccac gtcggcggca gggggggcgg 60

ccgccaggct tgctatagct ggtccatggc accatacatg taagcacgca cacaggcaca 120

cacacacacg cacgcaatga tctacgtatc tagcagcagc ttatcatgtc gtcatcatgc 180

atgcatggac gacggcggtc gtcatcttat ctgggagcgc gcgtgtgtgt acatcttggc 240

aatgggaagc tgcatgcgcc tctcggccgg acggcgcgta gctgtagggc ggcgtgccat 300

agagctgcct cctgccgctc accttgctgt tgaggacgac tgatggtggc catggccact 360

cggcgtcggt ggcggcggcg ccgagtttta cctctctact aaggtagggc aacttgtatc 420

ctttggcaat tgttctcata tatctgggtc tgtctgttgg ctgcccggtg acggtatacg 480

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cacggctgac ggctcctcct tattaatgtg tactttgatg atgtcattaa taatatgaat 600

ctgatgatat tgaataagtg ttgtccaaaa atgttggttt acttcatgc 649

<210> 3

<211> 2324

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>

<400> 3

aggcttccat gttgttggaa tacggtattt ttgttggttt gaactgtctt ttttattctt 60

ttggtgtctt ggactatact tattatggtg tttgagaaat aaaatggtaa atgcaaaggc 120

aaaaaagaat ctgatatgtt tgagcatttt taaccaataa ttatttgttc ttagaatcat 180

atttctgatc tgccccattc atttttacgc aacaacttct aatttagagg gttttatctt 240

tttactgttc atatgcccaa caaacttcat taatggaatt agcctagtat attgagaaaa 300

ttaaggggat tttctactgt attcgtcctt gaaagcctca atttccttga tcagcatttt 360

ctatgaagca tgtaaatatt tttgtctctt tgtaggcttg catgttgcat gatattattt 420

tgtagtaaga tgcgaaagga cttctagttg agttggttat gtggtctgag tagcactcct 480

caggtcctgg gtttgactcc ccgtgtgagc gaatttcagg ttgtggttaa aaaaaatccc 540

ctcgtctgtc ccacgccaaa gcataggtct aagactcggt ccccatcgcg ggttttttga 600

cctgcgtgag aaggtcttct tcttaatata atgcctgtgt gctgtcttac ccccgtaggt 660

cgagtttttt tttattttgt agtaagatga ccatttgaac taatcttctc ttgctatggt 720

ttcagggtca gctgatccta gcaattggac ccgacagacc attttattct gtgatctcat 780

cataattgaa gcccccactg atgaaaagct gttaccttgg ttgctttctt gagtactggt 840

caccagatag tagcatgttc tcttctgtgt gattaggctt gattgtggac tgacactcct 900

ggtcacttat ctcttgtgat catccagagt atatcatctg tcagctgatc ttttctctat 960

ggaatcgctt ccctttatga aagtatcctt gttttagggc aaatctcctt tggcaaacat 1020

tgttcagggt gcatcacttt gctggttatc ctgagcatat tctcctcgtc gaatgaacta 1080

tcagcagcga agagacttcc aaatgatatc catcaggaaa ttctcattta gtttgatgga 1140

agtttcataa ggtttcgtac catctgattt gctgggcaaa tctcctttgg cagtacttat 1200

taatagctct tttgggggca aatctccttt ggcattagct ttaagatttc tcactgggca 1260

aatctccttt ggcactagtt ctacctttag tttcacatcg ctcttcgggc aaatctcctt 1320

tggcactaaa taccaattat atttactatt tttagtaaat ctccttccgc tgtgcgcact 1380

agcatctata tctgggtaat tctcctttgg cattatcagt caagtgtgct gcctgcctgc 1440

acataactta tacgagaata tcaagaagtg attctggaag gtaatacacc gatttccttc 1500

aatgcgacat ttgtggttcc tgcaagctat gatggccatt cattacttgt atcccaatga 1560

tccataacta gatgcactta aatgtaggac atgtaactaa aaagttagaa cacaaggata 1620

gagagaaacg cttatggctt atccaatcct cactcggtta atttgataat ggctgtgaga 1680

atgaaaacaa attgtgacat caacatcaat agaaggctat gaggccatac atttgtattt 1740

cagtggatag ataatatatt agcatattgc ataaggtgat aatggaaaag tctccacaag 1800

gtttctgtgc cactctccat gtggttgcta tagtcatggc agaatggaat ggaaaagaaa 1860

taaccatgtg gagcaacaca caatccaata gtcaatttta gaactagacg ataaacagat 1920

aaattttgag catgccaagt gttttaagaa tttaaaaggt ttttttgata aaaaacctgt 1980

aaattatcct taagatataa ggtttggatg tttggtattg ttaagggtac ctcccgctcc 2040

cagtacattg caaacaccat aaagagatat ggttctgttt atcttttctc gttacgatct 2100

ctgatcctct tatatttcca tcattttctg cagaaatact tggccagctg gtatattgac 2160

cttctggaca tcaatttgca tattgttcct tgttcttgag attaccacgt tacccaagca 2220

gccacacctt actaagaagg taggtaatta tggagtaaca tttcttaaca aggttgtctt 2280

atgccgtatc aataaccaag tgtgacgttg cagggtttga aatc 2324

<210> 4

<211> 2324

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221>

<400> 4

aggcuuccau guuguuggaa uacgguauuu uuguugguuu gaacugucuu uuuuauucuu 60

uuggugucuu ggacuauacu uauuauggug uuugagaaau aaaaugguaa augcaaaggc 120

aaaaaagaau cugauauguu ugagcauuuu uaaccaauaa uuauuuguuc uuagaaucau 180

auuucugauc ugccccauuc auuuuuacgc aacaacuucu aauuuagagg guuuuaucuu 240

uuuacuguuc auaugcccaa caaacuucau uaauggaauu agccuaguau auugagaaaa 300

uuaaggggau uuucuacugu auucguccuu gaaagccuca auuuccuuga ucagcauuuu 360

cuaugaagca uguaaauauu uuugucucuu uguaggcuug cauguugcau gauauuauuu 420

uguaguaaga ugcgaaagga cuucuaguug aguugguuau guggucugag uagcacuccu 480

cagguccugg guuugacucc ccgugugagc gaauuucagg uugugguuaa aaaaaauccc 540

cucgucuguc ccacgccaaa gcauaggucu aagacucggu ccccaucgcg gguuuuuuga 600

ccugcgugag aaggucuucu ucuuaauaua augccugugu gcugucuuac ccccguaggu 660

cgaguuuuuu uuuauuuugu aguaagauga ccauuugaac uaaucuucuc uugcuauggu 720

uucaggguca gcugauccua gcaauuggac ccgacagacc auuuuauucu gugaucucau 780

cauaauugaa gcccccacug augaaaagcu guuaccuugg uugcuuucuu gaguacuggu 840

caccagauag uagcauguuc ucuucugugu gauuaggcuu gauuguggac ugacacuccu 900

ggucacuuau cucuugugau cauccagagu auaucaucug ucagcugauc uuuucucuau 960

ggaaucgcuu cccuuuauga aaguauccuu guuuuagggc aaaucuccuu uggcaaacau 1020

uguucagggu gcaucacuuu gcugguuauc cugagcauau ucuccucguc gaaugaacua 1080

ucagcagcga agagacuucc aaaugauauc caucaggaaa uucucauuua guuugaugga 1140

aguuucauaa gguuucguac caucugauuu gcugggcaaa ucuccuuugg caguacuuau 1200

uaauagcucu uuugggggca aaucuccuuu ggcauuagcu uuaagauuuc ucacugggca 1260

aaucuccuuu ggcacuaguu cuaccuuuag uuucacaucg cucuucgggc aaaucuccuu 1320

uggcacuaaa uaccaauuau auuuacuauu uuuaguaaau cuccuuccgc ugugcgcacu 1380

agcaucuaua ucuggguaau ucuccuuugg cauuaucagu caagugugcu gccugccugc 1440

acauaacuua uacgagaaua ucaagaagug auucuggaag guaauacacc gauuuccuuc 1500

aaugcgacau uugugguucc ugcaagcuau gauggccauu cauuacuugu aucccaauga 1560

uccauaacua gaugcacuua aauguaggac auguaacuaa aaaguuagaa cacaaggaua 1620

gagagaaacg cuuauggcuu auccaauccu cacucgguua auuugauaau ggcugugaga 1680

augaaaacaa auugugacau caacaucaau agaaggcuau gaggccauac auuuguauuu 1740

caguggauag auaauauauu agcauauugc auaaggugau aauggaaaag ucuccacaag 1800

guuucugugc cacucuccau gugguugcua uagucauggc agaauggaau ggaaaagaaa 1860

uaaccaugug gagcaacaca caauccaaua gucaauuuua gaacuagacg auaaacagau 1920

aaauuuugag caugccaagu guuuuaagaa uuuaaaaggu uuuuuugaua aaaaaccugu 1980

aaauuauccu uaagauauaa gguuuggaug uuugguauug uuaaggguac cucccgcucc 2040

caguacauug caaacaccau aaagagauau gguucuguuu aucuuuucuc guuacgaucu 2100

cugauccucu uauauuucca ucauuuucug cagaaauacu uggccagcug guauauugac 2160

cuucuggaca ucaauuugca uauuguuccu uguucuugag auuaccacgu uacccaagca 2220

gccacaccuu acuaagaagg uagguaauua uggaguaaca uuucuuaaca agguugucuu 2280

augccguauc aauaaccaag ugugacguug caggguuuga aauc 2324

<210> 5

<211> 122

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221>

<400> 5

gtagctcagg gtgcgaatca cagtgcagct ctcctctggc atgaaggctg tgagagaggc 60

atgacaattt ctggccttgc cctgccaaag gagagctgtc ctgccattca ttagccctgc 120

aa 122

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<221>

<400> 6

ugccaaagga gagcuguccu g 21