一种评估SLE患儿总体疾病活动度和肾脏疾病活动度的检测方法及其应用

摘要

本发明属于生物医学检验领域，具体涉及一种评估SLE患儿总体疾病活动度和肾脏疾病活动度的检测方法及其应用。本发明首次在SLE患儿血浆中筛选出IP‑10这一细胞因子，通过检测血浆中IP‑10水平，不仅能很好的区分疾病活动性SLE患儿和非活动性SLE患儿，敏感性和特异性分别为81％和74％，而且可以很好的区分SLE患儿中肾脏疾病活动者和肾脏疾病非活动者，灵敏度为72.2％，特异度为60.7％。本发明的方法提高了诊断SLE患儿中总体疾病活动者和肾脏疾病活动者的灵敏度和特异性，并且操作简单，易于推广。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学检测领域，具体地说，是一种评估SLE患儿总体疾病活动度和肾脏疾病活动度的检测方法及其应用。

背景技术

系统性红斑狼疮(SLE)是一种以慢性免疫性炎症为突出表现的系统性自身免疫病。其可以累及多个组织器官，全身各个系统包括皮肤粘膜、关节、泌尿系统、呼吸系统、心血管系统乃至神经系统均可受累。尽管我国SLE患病率不高，约为70/10万，然而总病例数也有100万人以上，且大概20％SLE患者在儿童时期发病。与成人SLE相比，儿童SLE患者中狼疮性肾炎(LN)的发病率明显增高，且预后不良，是导致SLE患儿死亡的主要原因之一。其中10％的合并狼疮性肾炎的患儿在5年之内会进展为终末期肾脏疾病，对儿童的健康造成很大的危害。

目前临床上主要依据临床表现和血清学结果来诊断并评估SLE疾病活动度，血清学指标包括补体和抗ds-DNA抗体。目前抗ds-DNA抗体有两种检测方法，一种是放射免疫法，一种是酶联免疫法。放射免疫法检测的特异性虽然较高，但敏感性较低，且步骤繁琐、具有放射性；酶联免疫法虽然敏感性较高，但特异性较低，容易受到抗单链DNA等其它蛋白抗原的污染。此外，最新的研究表明，与疾病活动度密切相关的是抗ds-DNA抗体的类型而非滴度。IgG型或IgA型抗ds-DNA抗体，与SLE的病情活动度密切相关；而IgM型抗ds-DNA抗体则与病情活动和狼疮肾炎呈负相关。而目前临床检测的是抗ds-DNA抗体的总滴度，尚未区分其具体类型，因此其并不能准确地反映SLE患者的疾病活动度。此外，有研究报道，也存在部分血清学活动而临床稳定类型的狼疮(即6个月到2年无临床病情活动，但有抗dsDNA抗体滴度升高和/或低补体血症所提示的持续血清学活动)，约占患者总数的6％～9％。因此，单纯采用抗ds-DNA抗体或补体有时并不能准确评估狼疮病情是否活动。故寻找能够反映总体疾病活动度尤其是狼疮性肾炎活动度的有效生物标志物具有十分重要的意义，这将有助于对SLE患儿病情进行实时监测，进行个体化治疗而改善预后。

一系列研究已表明，SLE疾病的发生发展与慢性炎症密切相关。(1)肿瘤坏死因子(TNF-α)是主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，具有强烈的促炎作用。(2)作为一种重要的免疫调节因子，IL-2具有多种生物学功能。T细胞经抗原激活后，在IL-2存在的条件下可以进入细胞周期的S期，促进和维持细胞的增殖；IL-2可以直接促进B细胞增殖分化和免疫球蛋白的分泌。(3)IFN-γ有着广泛的免疫调节作用，可以诱导巨噬细胞和B细胞表达MHC II类分子，从而提高其抗原提呈能力；增强CTL细胞和NK细胞杀伤靶细胞的能力；诱导细胞表达IL-2受体，从而促进T细胞增殖，进一步扩大免疫应答。(4)IP-10又称为γ-干扰素诱导蛋白-10，是各种细胞如T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞和内皮细胞在受到IFN-γ刺激后所分泌的一种细胞因子。其可以作用于T细胞表面的CXCR3受体，并协助T细胞趋化至炎症部位。(5)IL-1β在自身炎症反应综合症中发挥着关键的作用。IL-1β受体拮抗剂可以阻断IL-1β与其受体的结合而阻断下游信号通路并降低炎症反应。(6)IL-17是近来发现的一种炎症细胞因子。其可以促进T细胞的激活和并刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生多种细胞因子如IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)等，从而导致炎症的产生。此外，血小板衍生生长因子(PDGF)是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力。PDGF具有多种形式的二聚体结构，可以分为PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-AB、PDGF-CC和PDGF-DD。已有研究表明，PDGF-BB能刺激血管平滑肌细胞、成纤维细胞和系膜细胞的分裂增生。这提示PDGF-BB可能参与了包括狼疮性肾炎在内的以增殖为主要表现的多种肾脏疾病的发生发展。此外凋亡相关分子Fas和FasL也在免疫耐受和自身免疫性疾病中发挥关键作用。本发明研究检测了SLE患儿血浆中上述蛋白的水平，并从中筛选出对评估SLE患儿总体疾病活动度以及肾脏疾病活动度有诊断价值的分子。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新的用于评估SLE患儿总体疾病活动度和肾脏疾病活动度的方法。我们通过Luminex方法对SLE患儿和健康儿童血浆中多种细胞因子的水平进行了检测，发现SLE患儿血浆中IP-10的水平明显增高。此外，疾病活动SLE患儿血浆中IP-10的水平也明显高于非活动性SLE患儿，且灵敏度和特异度均明显高于实验室常规指标如抗ds-DNA抗体和补体C3、C4等。值得关注的是，我们还发现SLE患儿中肾脏疾病活动者的血浆IP-10的水平也明显高于SLE患儿中肾脏疾病非活动者，且SLE患儿血浆中IP-10的水平和其肾脏疾病活动指数之间存在明显的正相关性。因此血浆中IP-10水平，不仅能有效地区分疾病活动性SLE患儿而且能特异性区分SLE患儿中肾脏疾病活动者，并且操作简单，易于推广。

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供干扰素-γ诱导蛋白10或其检测试剂的用途。

本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于评估SLE患儿总体疾病活动度或肾脏疾病活动度的方法。

本发明的第三个目的是针对现有技术中的不足，提供一种用于评估SLE患儿总体疾病活动度或肾脏疾病活动度的试剂盒。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

第一方面，干扰素-γ诱导蛋白10在作为评估SLE疾病总体疾病活动度或肾脏疾病活动度的标志物中的应用。

第二方面，干扰素-γ诱导蛋白10在制备检测试剂或检测试剂盒中的应用，所述的检测试剂或检测试剂盒用于：

(a)用于评估个体是否患有SLE疾病；或

(b)用于评估个体SLE总体疾病活动度；或

(c)用于评估个体SLE肾脏疾病活动度。

第三方面，用于检测个体血浆中干扰素-γ诱导蛋白10表达量的试剂在制备检测试剂或检测试剂盒中的应用，所述检测试剂或检测试剂盒用于评估SLE疾病总体疾病活动度或肾脏疾病活动度。

作为本发明的一个优选实施方案，所述评估的个体是SLE患儿。

作为本发明的一个优选实施方案，所述检测个体血浆中干扰素-γ诱导蛋白10表达量的试剂为干扰素-γ诱导蛋白10的特异性抗体。

作为本发明的一个优选实施方案，所述评估具体为：区分健康儿童、非活动性SLE患儿、活动性SLE患儿、肾脏非活动性SLE患儿和肾脏活动性SLE患儿。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于评估SLE患儿总体疾病活动度或肾脏疾病活动度的方法，首先检测SLE患儿血浆中IP-10表达量，其次通过IP-10表达量评估SLE疾病总体疾病活动度或肾脏疾病活动度。

作为本发明的一个优选实施方案，所述检测IP-10表达量，可以是以常规方法制备抗IP-10的抗体，建立检测IP-10的定性或定量方法及配套的试剂或试剂盒，所述常规方法可以是指用外源表达的IP-10或化学合成的IP-10作为抗原免疫动物实验制备的抗体。所述通过IP-10表达量评估，可以是将待检测个体血浆中IP-10表达量与标准样本IP-10表达量作为比较，所述标准样本包括：健康儿童、非活动性SLE患儿、活动性SLE患儿、肾脏非活动性SLE患儿和肾脏活动性SLE患儿。通过比较，评估SLE患儿总体疾病活动度和肾脏疾病活动度。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

一种用于评估SLE患儿总体疾病活动度或肾脏疾病活动度的试剂盒，所述试剂盒包含检测个体血浆中干扰素-γ诱导蛋白10表达量的试剂。

作为本发明的一个优选实施方案，所述检测个体血浆中干扰素-γ诱导蛋白10表达量的试剂为干扰素-γ诱导蛋白10的特异性抗体。

具体地，本发明采用如下技术方案：当天收集健康儿童和SLE患儿的外周血后，立即离心分离血浆，保存于-80℃冰箱。待所有样本血浆收集好后以检测血浆中的IP-10。

1.根据生产商提供的说明书，配制标准品及洗涤液。

2.振荡混匀结合有各种抗体的磁珠，96孔板中各孔50ul混合磁珠。

3.每孔加入50ul标准品或样本血浆，室温避光在水平振荡器上孵育2小时，摇速为800±50rpm。

4.将96孔板固定于磁力板上，并静置2min，并用洗涤液重悬磁珠。

5.1min后，倒弃液体，并在吸水纸上拍干。

6.每孔加入100ul洗涤液，静置1min。倒弃液体，并吸干。重复3次。

7.每孔加入50ul混匀的生物素标记的检测抗体。

8.室温避光在水平振荡器上孵育1小时，摇速为800±50rpm。

9.将96孔板固定于磁力板上，并静置2min。倒弃液体，并在吸水纸上拍干。

10.每孔加入100ul洗涤液，静置1min。弃液体，并在吸水纸上拍干。重复3次。

11.每孔加入混匀的50ul Streptavidin-Conjugated-PE。室温避光在水平振荡器上孵育30min，摇速为800±50rpm。

12.将96孔板固定于磁力板上，并静置2min。倒弃液体，并在吸水纸上拍干。

13.每孔加入100ul洗涤液，静置1min。倒弃液体，并吸干。重复3次。

14.每孔加入100ul洗涤液，室温避光振荡孵育2min，摇速为800±50rpm。

15.在Luminex机器检测各磁珠荧光强度，根据标准曲线获得各样本数值。

通过IP-10的ELISA试剂盒检测血浆中其含量，以评估SLE患儿总体疾病活动度和肾脏疾病活动度。

本发明的临床样本来自于SLE患儿和健康儿童外周血，离心分离血浆。通过实验表明，血浆IP-10水平不仅能很好的区分疾病活动性SLE患儿和非活动性SLE患儿，敏感性和特异性分别为81％和74％，而且可以很好的区分SLE患儿中肾脏疾病活动者和肾脏疾病非活动者，灵敏度为72.2％，特异度为60.7％。

本发明通过检测血浆中IP-10水平，提高了诊断SLE患儿中总体疾病活动者和肾脏疾病活动者的灵敏度和特异性，并且操作简单，易于推广。

本发明首次在SLE患儿血浆中筛选出IP-10这一细胞因子，可以反映其总体疾病活动度和肾脏疾病活动度,并且敏感性和特异性都较常规实验室指标有所提高。

附图说明

附图1为本发明实施例1中健康儿童和SLE患儿血浆中9种细胞因子水平示意图。

附图2为血浆中IP-10水平区分SLE患儿总体疾病活动度示意图。其中2A为健康儿童、非活动性SLE患儿和活动性SLE患儿血浆中IP-10的水平；2B为血浆中IP-10区分SLE患儿总体疾病活动度的ROC曲线。

附图3为血浆中IP-10水平区分SLE患儿肾脏疾病活动度示意图。其中3A为健康儿童、肾脏非活动性SLE患儿和肾脏活动性SLE患儿血浆中IP-10的水平；3B为血浆中IP-10区分SLE患儿肾脏疾病活动度的ROC曲线。

附图4为SLE患儿血浆IP-10水平和肾脏疾病活动度相关性分析的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：

一、实验方法

Luminex多细胞因子(TNF-α、PDGF-BB、IP-10、IL-1β、IFN-γ、IL-17A、IL-2、Fas、FasL)检测

试剂为R&D公司的Magnetic Luminex Screening Assay Human Premixed Multi-Analyte Kit(货号为LXSAHM-12)。

1.根据生产商提供的说明书，配制标准品及洗涤液。

2.振荡混匀结合有各种抗体的磁珠，96孔板中各孔50ul混合磁珠。

3.每孔加入50ul标准品或样本血浆，室温避光在水平振荡器上孵育2小时，摇速为800±50rpm。

4.将96孔板固定于磁力板上，并静置2min，并用洗涤液重悬磁珠。

5.1min后，倒弃液体，并在吸水纸上拍干。

6.每孔加入100ul洗涤液，静置1min。倒弃液体，并吸干。重复3次。

7.每孔加入50ul混匀的生物素标记的检测抗体。

8.室温避光在水平振荡器上孵育1小时，摇速为800±50rpm。

9.将96孔板固定于磁力板上，并静置2min。倒弃液体，并在吸水纸上拍干。

10.每孔加入100ul洗涤液，静置1min。弃液体，并在吸水纸上拍干。重复3次。

11.每孔加入混匀的50ul Streptavidin-Conjugated-PE。室温避光在水平振荡器上孵育30min，摇速为800±50rpm。

12.将96孔板固定于磁力板上，并静置2min。倒弃液体，并在吸水纸上拍干。

13.每孔加入100ul洗涤液，静置1min。倒弃液体，并吸干。重复3次。

14.每孔加入100ul洗涤液，室温避光振荡孵育2min，摇速为800±50rpm。

15.在Luminex机器检测各磁珠荧光强度，根据标准曲线获得各样本数值。

二、检测结果

图1为本发明实施例1中健康儿童和SLE患儿血浆中9种细胞因子水平示意图。

图2为血浆中IP-10水平区分SLE患儿总体疾病活动度示意图。其中2A为健康儿童、非活动性SLE患儿和活动性SLE患儿血浆中IP-10的水平；2B为血浆中IP-10区分SLE患儿总体疾病活动度的ROC曲线。

图3为血浆中IP-10水平区分SLE患儿肾脏疾病活动度示意图。其中3A为健康儿童、肾脏非活动性SLE患儿和肾脏活动性SLE患儿血浆中IP-10的水平；3B为血浆中IP-10区分SLE患儿肾脏疾病活动度的ROC曲线。

图4为SLE患儿血浆IP-10水平和肾脏疾病活动度相关性分析的示意图。

表1为实验室常规检测指标抗双链DNA和补体C3、C4以及血浆IP-10在区分SLE总体疾病活动度方面的灵敏性和特异性分析表。

表1

通过Luminex方法对SLE患儿和健康儿童血浆中多种细胞因子的水平进行了检测，发现SLE患儿血浆中IP-10的水平明显增高。此外，疾病活动SLE患儿血浆中IP-10的水平也明显高于非活动性SLE患儿，且灵敏度和特异度均明显高于实验室常规指标如抗ds-DNA抗体和补体C3、C4等。值得关注的是，我们还发现SLE患儿中肾脏疾病活动者的血浆IP-10的水平也明显高于SLE患儿中肾脏疾病非活动者，且SLE患儿血浆中IP-10的水平和其肾脏疾病活动指数之间存在明显的正相关性。因此检测患者血浆中IP-10水平，不仅能有效地区分疾病活动性SLE患儿，而且能特异性区分SLE患儿中肾脏疾病活动者，并且操作简单，易于推广。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。