法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-04-07
授权
授权
2018-03-06
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K31/197 申请日:20170112
实质审查的生效
2018-02-02
公开
公开
技术领域
本发明属于生物医药领域。本发明提供了恩利卡生(Emricasan)的新用途和给药方式,包括对脑缺血/再灌注的保护作用(缺血性脑卒中),减轻缺血/再灌注损伤,扩大了恩利卡生适应症范围。
背景技术
缺血性脑卒中是严重危害人类健康的常见和多发病,在全球已成为第一致残和第三致死的原因,缺血性脑卒中的发病率约占脑血管病的70-80%。
缺血性脑卒中涉及钙超载、兴奋性氨基酸毒性、氧化应激等多种机制,这些机制相互交集最终引起神经细胞死亡。其中凋亡是缺血性脑卒中神经细胞死亡的主要方式之一。细胞凋亡主要包括内源性细胞凋亡通路(线粒体介导的凋亡通路)和外源性细胞凋亡通路(死亡受体介导的凋亡通路)。
Caspase家族是一大类凋亡的调控因子,是细胞凋亡的启动者和最后的执行者。凋亡启动因子由caspase-2、caspase-8、caspase-9和caspase-10组成,凋亡执行因子由caspase-3、caspase-6和caspase-7组成。研究表明,在caspase家族中,caspase-3是caspase级联“瀑布”下游最关键的凋亡执行蛋白酶,它在正常细胞中是以酶原形式存在,受凋亡刺激因素(缺血、细胞内钙超载等)作用后激活,活化的caspase-3可以激活核因子、细胞骨架蛋白及DNA裂解酶等,引起细胞形态的变化如出现细胞皱缩、DNA裂解、染色质浓缩和凋亡小体的形成等,最终导致细胞凋亡,caspase-3在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用。脑缺血时,死亡受体介导的凋亡通路激活的caspase-8,进一步激活其下游效应蛋白酶caspase-3及活线粒体凋亡通路导致细胞凋亡。研究表明,抑制caspase酶活性,够阻止神经凋亡的发展,可减轻脑缺血损伤的程度,缩小梗死范围。
半胱天冬酶抑制剂恩利卡生能特异性抑制caspase-3/7,但未见恩利卡生治疗缺血性脑卒中的报道,尤其是用于减轻缺血/再灌注损伤。
发明内容
本发明所述恩利卡生的结构式如式Ⅰ所示:
化学名为:(S)-3-((s)-2-(2-(2-叔丁基苯基氨基)-2-氧代乙酰氨基)丙酰胺)-4-氧代-5-(2,3,5,6-四氟苯氧基)戊酸;分子式为:C26H27F4N3O7;分子量为:569.5。
本发明通过实验表明,恩利卡生通过抑制半胱天冬酶(caspases)8,3,减少神经细胞凋亡,显著降低脑缺血梗死体积,减轻脑缺血/再灌注损伤的作用优于目前常用的脑血管药物。恩利卡生可以降低脑组织的caspase-3的活性。因此,恩利卡生可应用于制备治疗缺血和/或再灌注损伤药物(本文中,以下“/”均表示“和/或”)。优选地,所述缺血/再灌注损伤包括脑缺血/再灌注损伤、心肌缺血/再灌注损伤、肝缺血/再灌注损伤和肾缺血/再灌注损伤。更优选地,所述脑缺血/再灌注损伤包括缺血性脑卒中。给药方式为皮下注射、静脉注射、肌肉注射或口服给药,优选为口服给药。
本发明扩大了恩利卡生的适应症,可适用于脑缺血/再灌注损伤;与注射给药方式相比,本发明采用口服给药,操作简单,刺激性小,增强病人的依从性。
本发明证实恩利卡生能特异性抑制caspase-8,降低缺血性脑卒中大鼠神经细胞的凋亡率,缩小脑梗死体积,改善神经学功能,说明恩利卡生有可能用于治疗缺血性脑卒中,扩大其适应症范围。
总之,恩利卡生是一种半胱天冬酶抑制剂,通过抑制半胱天冬酶活性减少肝疾病中细胞凋亡。本发明将恩利卡生用于治疗缺血/再灌注损伤,尤其是脑组织神经病,更尤其是治疗缺血性脑卒中,能显著减轻脑缺血/再灌注损伤。
附图说明
图1:手术前15分钟给药,A-大鼠脑组织TTC染色及梗死体积测定,B-大鼠神经学功能评分;
图2:缺血2h再灌1h后给药,A-大鼠脑组织TTC染色及梗死体积测定,B-大鼠神经学功能评分。
具体实施方式
动物实验:恩利卡生对缺血性脑卒中大鼠模型的保护作用。
实施药品:羧甲基纤维素钠(CMC-Na)购于上海山浦化工有限公司。
将恩利卡生用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)作为溶媒制成混悬液。
实验动物:体重250~300g的健康雄性SD大鼠48只。将实验动物在温度25℃、相对湿度60%、自由饮水、定时定量的环境中饲养一周,然后按实验各分组要求口服给药。
缺血脑卒中建立方法:用脑中动脉阻塞(MCAO)法法制备大鼠脑缺血/再灌注模型。步骤如下:(1)分离颈外动脉(CCA),向上分离右颈外动脉(ECA)与颈内动脉(ICA);(2)用眼科镊暂时夹闭ECA和ICA,并结扎CCA近心端;(3)于CCA远心端放置一打好结的备用丝线,在此线下端剪一小口,将栓线插入至颈内动脉,收紧丝线,放开ECA和ICA上的动脉夹,顺ICA将栓线送至颅内;(4)遇阻力而止,从CCA分叉处算起,插入深度约为18~20mm;(5)缺血120min后,将栓线拔出,缝好皮肤,再灌注24h后处理动物。
模型成功评判标准采用Longa“5分法”对大鼠脑缺血/再灌注损伤模型的神经功能缺损进行评分。0分:无神经缺损症状;1分:右前肢不能完全伸直;2分:向右旋转;3分:行走向右侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。1~4分为有效模型。
大鼠脑TTC染色和梗死体积测定。大鼠麻醉后,迅速将脑取出,去掉嗅球及后脑,从额极开始切取4张冠状脑片,厚约2.0mm,立刻置于1%TTC溶液中,37℃避光孵育30min。然后用10%多聚甲醛溶液浸泡固定。梗死区呈现白色,非梗死区呈现红色。将每组脑片排列整齐后进行扫描。再应用ImageJ测出各脑片的梗塞面积,根据公式:梗死体积=[(各片正面梗死面积之和+各片反面梗死面积之和)/2]×每片厚度,同样方法计算出全脑体积。
实验分组:将实验动物随机分为6组,即:
对照组(control组):不做任何处理。
假手术组(sham组):将栓线插到脑中动脉分叉处即停。
脑缺血/再灌注组(I/R组):脑缺血2h,再灌注24h。
恩利卡生(Emricasan)+脑缺血/再灌注组(Emricasan+I/R)1:1.手术前15分钟灌胃(恩利卡生用0.5%羧甲基纤维素钠做成混悬液),恩利卡生用量:15mg/kg;
恩利卡生+脑缺血/再灌注组(Emricasan+I/R)2:缺血2h,再灌1h灌胃(恩利卡生用0.5%羧甲基纤维素钠做成混悬液),恩利卡生用量:15mg/kg。
溶媒+脑缺血/再灌注组(vehicle+I/R):手术前15分钟或缺血2h再灌1h后灌胃0.5%羧甲基纤维素钠(10ml/kg)。
收集脑组织并测定以下指标:大鼠神经功能评分和梗死体积测定。
实验结果:
恩利卡生对大鼠脑梗死体积及神经功能的影响
如图1中的A所示,I/R组有明显的白色梗死灶,手术前15分钟给予15mg/kg恩利卡生组大鼠脑梗死灶显著缩小,明显缓解脑缺血损伤。图B,脑缺血组(I/R)大鼠出现明显的神经运动功能障碍,恩利卡生可明显改善神经功能缺损症状(p<0.01)。
图2中的A所示,I/R组有明显的白色梗死灶,缺血2h再灌1h后给予15mg/kg恩利卡生组大鼠脑梗死灶显著缩小,明显缓解脑缺血损伤。图B,恩利卡生可明显改善神经功能缺损症状(p<0.01)。
上述实施例发现恩利卡生可减轻脑缺血/再灌注损伤,改善神经功能缺损症状,为治疗脑缺血/再灌注提供了新的药物。
但本专利不局限于脑缺血/再灌注损伤,因心、肝和肾缺血/再灌注损伤同样存在Caspase酶活性上调,故该药同样适用于治疗心、肝和肾缺血/再灌注损伤。
机译: 鸢尾素在制备预防心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用
机译: 包含减少的末端唾液酸残基的c1抑制剂在制备用于预防,减少或治疗缺血和/或再灌注损伤的药物组合物中的用途
机译: (S)-腺苷-L-蛋氨酸(相同)及其生理相容性盐在制备药物成分中治疗暂时性局部缺血引起的再灌注损伤的用途