一种螺旋藻藻种的超低温保存方法

摘要

本发明公开了一种螺旋藻藻种的超低温保存方法，通过将带有螺旋藻孢子的培养液进行冰冻保存的方式来保存螺旋藻藻种。本发明通过将螺旋藻藻种诱导为螺旋藻孢子后，对螺旋藻孢子进行超低温保存，需要螺旋藻藻种时，再将螺旋藻孢子解冻恢复为螺旋藻藻种，螺旋藻藻种的存活率在90％以上；螺旋藻藻种保存时间长、省时、省力、无污染、无遗传漂变，同时降低了保存成本。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种螺旋藻保存方法，特别是涉及一种螺旋藻藻种的超低温保存方法。

背景技术：

螺旋藻是原核生物，由一列细胞构成的丝状体个体，有或松或紧的螺旋(见图1)，所以称螺旋藻。

螺旋藻因为具有多种微量元素、多种维生素、多种寡聚糖和多种不饱和脂肪酸，而受到保健品商业的推崇，在世界范围内生产；同时螺旋藻是一种较好的遗传工程实验材料，因为螺旋藻相比大肠杆菌、病毒等的安全性好，是一种健康的原核生物。生产上需要保存纯正的藻种，螺旋藻的研究更需要无污染、无遗传漂变的纯正藻种。

目前，国内外在业内都公认为：螺旋藻无休眠孢子(或厚壁细胞)，为断裂的生殖方式，在螺旋藻的保存实践中，国内外使用的都是传统的继代培养法，而常规继代培养的保存不能保证无污染、无遗传漂变，在螺旋藻传统的继代培养保存过程中，存在遗传漂移，性状丢失等问题，而且还费时、费力、费人工，而关于螺旋藻超低温保存的研究鲜有报道。

发明内容：

为了解决螺旋藻传统的继代培养保存过程中，发生遗传漂移，性状丢失等问题，本发明提供一种无污染、无遗传漂变、省时、省力、低成本的螺旋藻的超低温保存方法。

本发明的目的由如下技术方案实施：一种螺旋藻藻种的超低温保存方法，通过将带有螺旋藻孢子的培养液进行冰冻保存的方式来保存螺旋藻藻种。

螺旋藻孢子进行冰冻保存的具体步骤为：首先将带有螺旋藻孢子的培养液进行初步冰冻，初步冰冻温度为-8～-20℃，初步冰冻时间为24～48h，然后在不高于-80℃温度下冻存至任意时间。

优选的，所述初步冰冻温度优选为-8～-12℃。

优选的，在带有螺旋藻孢子的培养液中加入保护剂，所述保护剂为糖类保护剂或无机物保护剂。

具体的，所述糖类保护剂为单糖、双糖或三糖中的任意一种或一种以上以任意比例的混合；所述糖类保护剂在所述培养液中的质量百分比浓度为5～10％。

具体的，所述无机物保护剂为甘油或二甲基亚砜；所述无机物保护剂在所述培养液中的质量百分比浓度为5～15％。

在我国北方地区，螺旋藻藻种能够在自然状态下转变为螺旋藻孢子。申请者还发现分布在内蒙古鄂尔多斯养殖大棚中的螺旋藻是以孢子的形式越冬(见图2)，而且通过分析图1与图2中的生物的16-23rDNA的比对，2者是一种生物，换言之：图2的生物是图1生物的孢子状态。

或者，螺旋藻藻种能够采用人工诱导方式转变为螺旋藻孢子，具体方法为：

A、获取带有螺旋藻藻种的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为14～18℃条件下，诱导2h；在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为18～24℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为14～18℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为12～14℃条件下，诱导14h；然后重复步骤A中的上述诱导条件再诱导24h；

B、将完成步骤A诱导的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为10～14℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为14～16℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为10～14℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为8～10℃条件下，诱导14h；然后重复步骤B中的上述诱导条件再诱导24h；

C、将完成步骤B诱导的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为4～6℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为6～8℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为4～6℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为0～3℃条件下，诱导14h；然后重复步骤C中的上述诱导条件再诱导24h；

D、将完成步骤C诱导的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为3～4℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为4℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为3～4℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为0～2℃，诱导14h；然后重复步骤D中的上述诱导条件再诱导24h，此时，如螺旋藻藻种转变为螺旋藻孢子，则结束诱导；如螺旋藻藻种未转变为螺旋藻孢子，则继续步骤E的诱导；

E、将完成步骤D诱导且未转变为螺旋藻孢子的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为1～2℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为2℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为1～2℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为0℃条件下，诱导14h；然后重复步骤E中的上述诱导条件循环诱导，直至螺旋藻藻种转变为螺旋藻孢子，结束诱导。

所述的螺旋藻的超低温保存方法，还包括有解冻步骤，具体为，首先，将冻存的螺旋藻孢子，转至-12℃温度下解冻92h，然后，在最低温度大于0℃，最高温度不大于2℃条件下解冻至冰完全融化后，最后，在最高温度不高于8℃，最低温度不低于0℃条件下培养，直至螺旋藻孢子恢复为螺旋藻藻种。

本发明的优点：本发明通过将螺旋藻藻种诱导为螺旋藻孢子后，对螺旋藻孢子进行超低温保存，需要螺旋藻藻种时，再将螺旋藻孢子解冻恢复为螺旋藻藻种，螺旋藻藻种的存活率在90％以上；螺旋藻藻种保存时间长、省时、省力、无污染、无遗传漂变，同时降低了保存成本。

附图说明：

图1为螺旋藻藻种丝状个体状态图。

图2为螺旋藻孢子在显微镜放大100倍下的图片。

具体实施方式：

实施例1：一种螺旋藻藻种的超低温保存方法，其包括如下步骤：

(1)将螺旋藻藻种诱导为螺旋藻孢子，具体方法为：在我国北方地区，秋季时获取带有螺旋藻藻种的培养液，并在培养液中加入单糖做保护剂，单糖在培养液中的质量百分比浓度为5％，然后在自然状态下培养，到了冬季，螺旋藻藻种在冬季自然温度和光照条件的诱导下，转变为螺旋藻孢子。

(2)将步骤(1)得到的螺旋藻孢子冰冻保存，具体步骤为：首先将螺旋藻孢子进行初步冰冻，初步冰冻温度为-8℃，初步冰冻时间为48h，然后在-80℃温度下冻存至6个月。

(3)将步骤(2)冰冻的螺旋藻孢子解冻，恢复为螺旋藻藻种，具体步骤为：将在-80℃温度下冻存的螺旋藻孢子，转至-12℃温度下解冻92h，然后，在最低温度大于0℃，最高温度不大于2℃条件下解冻至冰完全融化，最后，在最高温度不高于8℃，最低温度不低于0℃条件下培养，直至螺旋藻孢子恢复为螺旋藻藻种。

对冷冻前和恢复后的螺旋藻藻种的存活数量进行检测对比，螺旋藻藻种经冷冻后，其存活率为98％。

实施例2：一种螺旋藻藻种的超低温保存方法，其包括如下步骤：

(1)将螺旋藻藻种诱导为螺旋藻孢子，具体方法为：在我国北方地区，秋季时获取带有螺旋藻藻种的培养液，在培养液中加入三糖做保护剂，三糖在培养液中的质量百分比浓度为8％，然后在自然状态下培养，到了冬季，螺旋藻藻种在冬季自然温度和光照条件的诱导下，转变为螺旋藻孢子。

(2)将步骤(1)得到的螺旋藻孢子冰冻保存，具体步骤为：首先将螺旋藻孢子进行初步冰冻，初步冰冻温度为-12℃，初步冰冻时间为36h，然后在-100℃温度下冻存至12个月。

(3)将步骤(2)冰冻的螺旋藻孢子解冻，恢复为螺旋藻藻种，具体步骤为：将在-80℃温度下冻存的螺旋藻孢子，转至-12℃温度下解冻92h，然后，在最低温度大于0℃，最高温度不大于2℃条件下解冻至冰完全融化，最后，在最高温度不高于8℃，最低温度不低于0℃条件下培养，直至螺旋藻孢子恢复为螺旋藻藻种。

对冷冻前和恢复后的螺旋藻藻种的存活数量进行检测对比，螺旋藻藻种经冷冻后，其存活率为100％。

实施例3：一种螺旋藻藻种的超低温保存方法，其包括如下步骤：

(1)将螺旋藻藻种诱导为螺旋藻孢子，具体方法为：在我国北方地区，秋季时获取带有螺旋藻藻种的培养液，在培养液中加入二甲基亚砜做保护剂，二甲基亚砜在培养液中的质量百分比浓度为15％；然后在自然状态下培养，到了冬季，螺旋藻藻种在冬季自然温度和光照条件的诱导下，转变为螺旋藻孢子。

(2)将步骤(1)得到的螺旋藻孢子冰冻保存，具体步骤为：首先将螺旋藻孢子进行初步冰冻，初步冰冻温度为-20℃，初步冰冻时间为24h，然后在液氮中冻存至18个月。

(3)将步骤(2)冰冻的螺旋藻孢子解冻，恢复为螺旋藻藻种，具体步骤为：将在-80℃温度下冻存的螺旋藻孢子，转至-12℃温度下解冻92h，然后，在最低温度大于0℃，最高温度不大于2℃条件下解冻至冰完全融化，最后，在最高温度不高于8℃，最低温度不低于0℃条件下培养，直至螺旋藻孢子恢复为螺旋藻藻种。

对冷冻前和恢复后的螺旋藻藻种的存活数量进行检测对比，螺旋藻藻种经冷冻后，其存活率为99％。

实施例4：一种螺旋藻藻种的超低温保存方法，其包括如下步骤：

(1)将螺旋藻藻种诱导为螺旋藻孢子，具体方法为：

A、获取带有螺旋藻藻种的培养液，在培养液中加入双糖做为保护剂，双糖在培养液中的质量百分比浓度为5％；然后，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，相当于2个40w的灯管照射的强度，温度为14℃条件下，诱导2h；在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，相当于4个40w的灯管的照射强度，温度为18℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，相当于2个40w的灯管照射强度，温度为14℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，相当于没有光线黑暗状态下光的强度，温度为12℃条件下，诱导14h；然后重复步骤A中的上述诱导条件再诱导24h；

B、将完成步骤A诱导的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为10℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为14℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为10℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为8℃条件下，诱导14h；然后重复步骤B中的上述诱导条件再诱导24h；

C、将完成步骤B诱导的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为4℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为6℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为4℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为0℃条件下，诱导14h；然后重复步骤C中的上述诱导条件再诱导24h；

D、将完成步骤C诱导的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为3℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为4℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为3℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为0℃，诱导14h；然后重复步骤D中的上述诱导条件再诱导24h，此时，螺旋藻藻种转变为螺旋藻孢子，结束诱导；

(2)将步骤(1)得到的螺旋藻孢子冰冻保存，具体步骤为：首先将螺旋藻孢子进行初步冰冻，初步冰冻温度为-8℃，初步冰冻时间为48h，然后在-80℃温度下冻存至6个月。

(3)将步骤(2)冰冻的螺旋藻孢子解冻，恢复为螺旋藻藻种，具体步骤为：将在-80℃温度下冻存的螺旋藻孢子，转至-12℃温度下解冻92h，然后，在最低温度大于0℃，最高温度不大于2℃条件下解冻至冰完全融化，最后，在最高温度不高于8℃，最低温度不低于0℃条件下培养，直至螺旋藻孢子恢复为螺旋藻藻种。

对冷冻前和恢复后的螺旋藻藻种的存活数量进行检测对比，螺旋藻藻种经冷冻后，其存活率为97％。

实施例5：一种螺旋藻藻种的超低温保存方法，其包括如下步骤：

(1)将螺旋藻藻种诱导为螺旋藻孢子，具体方法为：

A、获取带有螺旋藻藻种的培养液，在培养液中加入甘油作为保护剂，甘油在培养液中的质量百分比浓度为10％；然后，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为16℃条件下，诱导2h；在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为20℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为16℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为13℃条件下，诱导14h；然后重复步骤A中的上述诱导条件再诱导24h；

B、将完成步骤A诱导的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为12℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为15℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为12℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为9℃条件下，诱导14h；然后重复步骤B中的上述诱导条件再诱导24h；

C、将完成步骤B诱导的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为5℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为7℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为5℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为2℃条件下，诱导14h；然后重复步骤C中的上述诱导条件再诱导24h；

D、将完成步骤C诱导的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为3℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为4℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为3℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为1℃，诱导14h；然后重复步骤D中的上述诱导条件再诱导24h；

E、将完成步骤D诱导且未转变为螺旋藻孢子的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为1℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为2℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为1℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为0℃条件下，诱导14h；然后重复步骤E中的上述诱导条件循环诱导，直至螺旋藻藻种转变为螺旋藻孢子，结束诱导；

(2)将步骤(1)得到的螺旋藻孢子冰冻保存，具体步骤为：首先将螺旋藻孢子进行初步冰冻，初步冰冻温度为-12℃，初步冰冻时间为36h，然后在-80℃温度下冻存至12个月。

(3)将步骤(2)冰冻的螺旋藻孢子解冻，恢复为螺旋藻藻种，具体步骤为：将在-80℃温度下冻存的螺旋藻孢子，转至-12℃温度下解冻92h，然后，在最低温度大于0℃，最高温度不大于2℃条件下解冻至冰完全融化，最后，在最高温度不高于8℃，最低温度不低于0℃条件下培养，直至螺旋藻孢子恢复为螺旋藻藻种。

对冷冻前和恢复后的螺旋藻藻种的存活数量进行检测对比，螺旋藻藻种经冷冻后，其存活率为90％。

实施例6：一种螺旋藻藻种的超低温保存方法，其包括如下步骤：

(1)将螺旋藻藻种诱导为螺旋藻孢子，具体方法为：

A、获取带有螺旋藻藻种的培养液，优选的，在培养液中加入三糖作为保护剂，三糖在培养液中的质量百分比浓度为8％，然后，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为18℃条件下，诱导2h；在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为24℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为18℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为14℃条件下，诱导14h；然后重复步骤A中的上述诱导条件再诱导24h；

B、将完成步骤A诱导的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为14℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为16℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为14℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为10℃条件下，诱导14h；然后重复步骤B中的上述诱导条件再诱导24h；

C、将完成步骤B诱导的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为6℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为8℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为6℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为3℃条件下，诱导14h；然后重复步骤C中的上述诱导条件再诱导24h；

D、将完成步骤C诱导的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为3℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为4℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为3℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为2℃，诱导14h；然后重复步骤D中的上述诱导条件再诱导24h；

E、将完成步骤D诱导且未转变为螺旋藻孢子的培养液，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为1℃条件下，诱导2h，在光照强度为230～239μmol.m^-2.s^-1，温度为2℃条件下，诱导6h，在光照强度为120～129μmol.m^-2.s^-1，温度为1℃条件下，诱导2h，在光照强度为0～3μmol.m^-2.s^-1，温度为0℃条件下，诱导14h；然后重复步骤E中的上述诱导条件循环诱导，直至螺旋藻藻种转变为螺旋藻孢子，结束诱导；

(2)将步骤(1)得到的螺旋藻孢子冰冻保存，具体步骤为：首先将螺旋藻孢子进行初步冰冻，初步冰冻温度为-20℃，初步冰冻时间为24h，然后在液氮中冻存至18个月。

(3)将步骤(2)冰冻的螺旋藻孢子解冻，恢复为螺旋藻藻种，具体步骤为：将在-80℃温度下冻存的螺旋藻孢子，转至-12℃温度下解冻92h，然后，在最低温度大于0℃，最高温度不大于2℃条件下解冻至冰完全融化，最后，在最高温度不高于8℃，最低温度不低于0℃条件下培养，直至螺旋藻孢子恢复为螺旋藻藻种。

对冷冻前和恢复后的螺旋藻藻种的存活数量进行检测对比，螺旋藻藻种经冷冻后，其存活率为100％。

由实施例1-6可以看出，螺旋藻孢子的冷冻时间对螺旋藻藻种的存活率影响极小，由此可见，螺旋藻孢子的冷冻时长可以根据实际需要来确定。

实施例7：分别取钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)藻种如图1和该螺旋藻藻种利用本发明方法诱导得到的螺旋藻孢子如图2，进行rDNA(16-23S)检测，PCR扩增螺旋藻DNA的引物是：

F1：GGAGGCTGTGAAGAATTCCTTGTGG

R1：GAA CTG TCT CAC GAC GTT CTG AAC C分别有。6个重复，测序公司为上海祥音公司。

钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)藻种的碱基序列如下：

GGGAGGCTGTGAAGAATTCCTTGTGGGGGATTCTGAGCCATCGGTGAGATACCACTCTGGCGAAGCTAGAATTCTAACCTTTTCCCGTTATCCGGGAAAGAGACAGTTTCAGGGGGGCAGTTTGACTGGGGCGGTCGCCTCCTAAATGGTAACGGAGGCGCGCAAGGGTTCCCTCAGGCTGGTTGGAAATCAGCCGTAGAGTGCAAAGGCATAAGGGAGCTTGACTGCAAGACCTACAAGTCGAGCAGGGACGAAAGTCGGCCTTAGTGATCCGACGGTGCTGCGTGGAAAGGCCGTCGCTCAACGGATAAAAGTTACTCTAGGGATAACAGGCTGATCTCCCCCAAGAGTTCACATCGACGGGGAGGTTTGGCACCTCGATGTCGGCTCATCGCAACCTGGGGCGGTAGTACGTCCCAAGGGTTGGGCTGTTCGCCCATTAAAGCGGTACGTGAGCTGGGTTCAGAACGTCGTGAGACAGTTC

钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)孢子的碱基序列如下：

GGGAGGCTGTGAAGAATTCCTTGTGGGGGATTCTGAGCCATCGGTGAGATACCACTCTGGCGAAGCTAGAATTCTAACCTTTTCCCGTTATCCGGGAAAGAGACAGTTTCAGGGGGGCAGTTTGACTGGGGCGGTCGCCTCCTAAATGGTAACGGAGGCGCGCAAGGGTTCCCTCAGGCTGGTTGGAAATCAGCCGTAGAGTGCAAAGGCATAAGGGAGCTTGACTGCAAGACCTACAAGTCGAGCAGGGACGAAAGTCGGCCTTAGTGATCCGACGGTGCTGCGTGGAAAGGCCGTCGCTCAACGGATAAAAGTTACTCTAGGGATAACAGGCTGATCTCCCCCAAGAGTTCACATCGACGGGGAGGTTTGGCACCTCGATGTCGGCTCATCGCAACCTGGGGCGGTAGTACGTCCCAAGGGTTGGGCTGTTCGCCCATTAAAGCGGTACGTGAGCTGGGTTCAGAACGTCGTGAGACAGTTC

两段碱基序列对比可见，钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)藻种与钝顶螺旋藻(Spirulina platensis)孢子的碱基序列完全相同，证明螺旋藻藻种确实存在孢子状态。