HPLC法分离测定伊索克酸及其有关物质的方法

摘要

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种HPLC法分离测定伊索克酸及其有关物质的方法。本发明的方法采用的色谱柱是以辛烷基硅烷键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测；所述有关物质包括A‑G的一种或多种；所述流动相A为六氟磷酸钾溶液，所述流动相B为有机溶剂。该方法能有效分离伊索克酸中上述7个杂质及其他单个杂质，并定量测定其存在水平，该方法分离度好，专属性强，灵敏度高且准确，对伊索克酸、盐酸奥洛他定的质量控制具有极其重要的意义。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学领域，具体涉及一种HPLC法分离测定伊索克酸及其有关物质的方法。

背景技术

伊索克酸为合成抗组胺药，是合成新型首选抗过敏药物盐酸奥洛他定的关键起始原料。伊索克酸的分子式为C₁₆H₁₂O₄，化学名为6,11-二氢-11-氧代-二苯并[b,e]噁庚英-2-乙酸，其化学结构式如下：

其合成路线如下：

从其化学结构式及合成路线可知，伊索克酸中可能存在如下杂质：

综上所述，伊索克酸中可能存在的杂质多(7个)且需选择低波长进行检测，分析方法建立时要求高、干扰大。说明，需建立一套能有效检测出所有杂质的分析方法。

到目前为止，还没有公开的方法报道可有效分离伊索克酸中以上7个杂质及其他单个杂质，并定量测定其存在水平的分析方法。因此现开发一种测定伊索克酸有关物质的方法，对伊索克酸、盐酸奥洛他定的质量控制具有极其重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种HPLC法分离测定伊索克酸及其有关物质的方法。本发明的方法能有效分离伊索克酸中上述7个杂质及其他单个杂质，并定量测定其存在水平，该方法分离度好，专属性强，灵敏度高且准确，对伊索克酸、盐酸奥洛他定的质量控制具有极其重要的意义。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

HPLC法分离测定伊索克酸及其有关物质的方法，其特征在于，所述方法采用的色谱柱是以辛烷基硅烷键合硅胶为填料，采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，进入检测器进行检测；所述有关物质包括A-G的一种或多种，具体结构式如下所示：

所述流动相A为六氟磷酸钾溶液，所述流动相B为有机溶剂。

下表为有关物质编号对应的名称及来源信息：

进一步，所述六氟磷酸钾溶液的pH值为2.0-6.0。

作为一种优选，所述六氟磷酸钾溶液的pH值为3.0。

选用磷酸、甲酸、乙酸、柠檬酸、冰醋酸和三氟乙酸中的一种或多种进行pH调节。优选磷酸进行pH调节。

进一步，所述六氟磷酸钾溶液的浓度为0.005mol/L-0.1mol/L。

作为一种优选，所述六氟磷酸钾溶液的浓度为0.01mol/L-0.08mol/L。

作为一种优选，所述六氟磷酸钾溶液的浓度为0.02mol/L。

流动相中六氟磷酸钾浓度为0.02mol/L的条件下，OLO-Z1b(杂质F)与其他单个杂质Ⅰ能得到良好的分离度，定量更准确，且主峰峰形更佳。

进一步，所述有机溶剂为乙腈和/或甲醇。

作为一种优选，所述有机溶剂为乙腈。

进一步，所述梯度洗脱设置如下：

所述流动相的流速为0.5-1.5ml/min。

作为一种优选，所述梯度洗脱设置如下：

所述流动相的流速为1.0ml/min。

进一步，所述色谱柱填料的颗粒粒径为3-5μm；选用色谱柱柱长为150-250mm；所述色谱柱的柱温为15-50℃。

作为一种优选，所述色谱柱填料的颗粒粒径为3-5μm；选用色谱柱柱长为150mm；所述色谱柱的柱温为25℃。

进一步，反相液相色谱法分离测定伊索克酸及其有关物质的方法，所述有关物质为A-G，具体包括以下步骤：

1)分别取待测样品伊索克酸及其相关物质A-G的对照品，用稀释剂溶解制成待测样品及所述各相关物的对照品溶液，分别取待测样品伊索克酸及其各相关物质对照品溶液进样，进入高效液相色谱仪进行梯度洗脱，进入检测器进行检测，确定待测样品伊索克酸及其各相关物的保留时间；

2)取供试品加稀释剂制成供试品溶液，再取稀释剂作为空白溶液，分别取供试品溶液及空白溶液进样，进行高效液相色谱分析，记录色谱图，按加校正因子的主成分自身稀释法计算供试品中相关物质A-G的含量。

步骤1)中稀释剂为乙腈和/或甲醇。优选稀释剂为乙腈。

步骤2)中稀释剂为六氟磷酸钾溶液；所述六氟磷酸钾溶液的浓度为0.005mol/L-0.1mol/L；优选所述六氟磷酸钾溶液的浓度为0.02mol/L，pH值为3.0。

进一步，步骤2)中供试品溶液的进样量为5-100μl。

作为一种优选，步骤2)中供试品溶液的进样量为20μl。

进一步，所述检测器的检测波长为220nm±5nm。所述检测器选用紫外检测器、DAD检测器和VWD检测器中的任一种。

本发明的目的之二在于提供一种用于固液分离测定伊索克酸及其有关物质的试剂，所述有关物质包括A-G的一种或多种，所述试剂包括：

试剂A：六氟磷酸钾溶液；

试剂B：有机溶剂；

所述六氟磷酸钾溶液的pH值为2.0-6.0；所述六氟磷酸钾溶液的浓度为0.005mol/L-0.1mol/L；

所述有机溶剂为乙腈和/或甲醇。

本发明的有益效果在于：

1)目前没有有效的发方法能同时分离测定伊索克酸所述7个杂质及其他单个杂质，并定量测定其存在水平，本发明的方面填补了这一空白，本方法适用于伊索克酸有关物质的检测，该方法能准确的检测伊索克酸中可能存在的已知杂质及其他单个杂质的含量。

2)本发明的方法分离度好，专属性强，灵敏度高且准确，确保了伊索克酸原料药及其制剂的质量可控。对伊索克酸、盐酸奥洛他定的质量控制具有极其重要的意义。

2)本发明提供的用于固液分离测定伊索克酸及其有关物质的试剂能同时有效分离伊索克酸及其有关物质，对实现伊索克酸及其有关物质的质量控制有重要意义。

附图说明

图1为实施例1中混合溶液HPLC图。

图2为实施例1中测定伊索克酸有关物质-供试品溶液HPLC图。

图3为实施例1中测定伊索克酸有关物质-对照溶液HPLC图。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1伊索克酸有关物质的测定

1、仪器与条件

仪器：高效液相色谱仪SHIMADZU LC-20A(LC2019)；

检测器：紫外检测器；

色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶填充剂(Agilent Eclipse XDB-C8，150mm×4.6mm，5μm)；

流动相：流动相A：0.02mol/L六氟磷酸钾(用磷酸调pH值至3.0)；流动相B：乙腈；以流动相A、B进行线性梯度洗脱；

检测波长：220nm；

柱温：25℃；

流速：1.0ml/min；

进样体积：20μl。

流动相A、B线性梯度洗脱条件为：

2、实验步骤

(1)杂质混合贮备液：精密称取对羟基苯乙酸12.46mg、苯酞12.53mg、OLO-SMb12.44mg、OLO-Z1a 12.83mg、OLO-Z1b 12.35mg，置同一25ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

OLO-Z1c贮备液：精密称取OLO-Z1c 2.38mg，置25ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

OLO-SMa贮备液：精密称取OLO-SMa 13.20mg，置25ml量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

混合溶液：精密称取供试品(伊索克酸)25.13mg，置50ml量瓶中，加乙腈15ml使溶解，精密移取杂质混合贮备液0.1ml、OLO-Z1c贮备液0.53ml、OLO-SMa贮备液0.1ml，置同一量瓶中，加0.02mol/L六氟磷酸钾溶液(用磷酸调pH值至3.0)稀释至刻度，摇匀，即得。(含各杂质约0.2％)

(2)取伊索克酸约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加乙腈15ml振摇使溶解，加0.02mol/L六氟磷酸钾溶液(用磷酸调pH值至3.0)稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

(3)精密量取供试品溶液0.2ml，置100ml量瓶中，用溶剂(乙腈-0.02mol/L六氟磷酸钾溶液(用磷酸调pH值至3.0)(30：70))稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。

(4)分别取20μl混合溶液、供试品溶液和对照溶液，注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图1-3。

3、检测结果

供试品溶液的色谱图中如有杂质峰(溶剂和梯度洗脱峰除外)，按下式计算杂质含量，均应符合下表中限度规定。供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积0.25倍的峰可忽略不计(0.05％)。

计算公式：

As/Ar×F×0.2％

式中：As——供试品溶液色谱图中各杂质峰的峰面积；

Ar——对照溶液色谱图中主峰的峰面积；

F——各杂质校正因子。

各物质的相对保留时间、校正因子及限度规定

实施例2多批伊索克酸有关物质测定结果

按照实施例1的方法对本公司多批伊索克酸样品进行有关物质测定。计算结果见下表。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。