抗癌、抗炎多肽Lunasin在哺乳动物细胞CHO‑S中的表达、纯化方法

摘要

本发明公开了抗癌、抗炎多肽Lunasin在哺乳动物细胞CHO‑S中的表达、纯化方法。Lunasin多肽在哺乳动物细胞中的表达、纯化方法，包含如下步骤：(1)体外化学合成Lunasin基因；(2)PCR扩增Lunasin基因；(3)真核细胞表达载体的改造；(4)将Lunasin基因连接到改造后的哺乳动物细胞表达载体pZWCT1上；(5)阳性克隆的鉴定；(6)表达载体质粒瞬时转染哺乳动物细胞CHO‑S；(7)高密度细胞培养生产Lunasin多肽；(8)Lunasin多肽的分离纯化。本发明使Lunasin多肽的规模化生产成为可能，成本低、产量高，蛋白修饰准确，而且蛋白纯化方便简单。

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质工程领域，涉及抗癌、抗炎多肽Lunasin在哺乳动物细胞CHO-S中的表达、纯化方法。

背景技术

Lunasin多肽是一种最早分离于大豆的富含天冬氨酸(Asp)的活性肽(分子量为5.5KD)，由43个氨基酸组成，序列为SKWQHQQDSCRKQLQGVNLTPCEKHIMEKIQGRGDDDDDDDDD。N端第1-22个氨基酸序列的功能目前尚不清楚，第23-31个氨基酸序列可使Lunasin定位到染色体组蛋白H3和H4上，第32-34氨基酸Arg-Gly-Asp(RGD)是一个细胞黏附基序，可使Lunasin进入细胞核。它的C端连续9个Asp可使Lunasin多肽结合到染色体着丝粒处，使微管不能粘附在着丝粒着丝点上(Hernández-Ledesma et al.2009)。Lunasin多肽的上述性质使其具有显著的抗癌活性。目前研究表明，Lunasin多肽的抗癌机理主要有：Lunasin多肽通过与肿瘤细胞内乙酰化的核心组蛋白特异性结合，抑制核心组蛋白去乙酰化，从而阻断细胞的有丝分裂，最终导致肿瘤细胞的死亡(Hernández-Ledesma et a1.2011)；在肿瘤细胞模型的实验中，Lunasin多肽的抗癌作用不依赖于抑制组蛋白的去乙酰化，而是通过干扰肿瘤细胞的信号通路从而抑制肿瘤细胞的生长(Dia&Mejia,2011；Kapoor,2014)。此外，Lunasin多肽还可以和免疫细胞因子--白细胞介素(IL-12或者IL-2)协同作用，提高杀伤肿瘤细胞的作用(Chang et al.2014)。大量的研究表明，炎症反应是诱发肿瘤发生、形成和发展的一个重要因素。而Lunasin多肽在抗细胞炎症反应中也可以发挥重要的功能。如：Lunasin多肽可以抑制脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞RAW 264.7后促炎因子前列腺素2(PGE2)和一氧化氮(NO)的形成，通过抑制NF-κB通路来发挥抗炎症的作用(Dia et al.2009；Mejia&Dia,2009)。最近，Jia等研究发现Lunasin多肽可以通过诱导细胞凋亡抑制类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞的增殖，进一步通过抑制细胞内促炎细胞因子(IL-6，IL-8和基质金属蛋白酶)的产生，而发挥抗炎症作用(Jia et al.2015)。Lunasin多肽可抗肠道和血清降解，在抵达靶器官和血液后仍保持活性和完整性。因此，Lunasin多肽在抗癌抗炎症方面具有极大的应用潜力，将在人类健康中发挥重大作用。

目前，Lunasin多肽主要有从天然物质中分离、化学合成、谷类发酵、重组表达的方法。但是从天然物质中分离步骤繁琐、劳动强度大，化学合成则成本昂贵，无法满足后续体内外实验的研究需要。重组的途径则成为大量生产Lunasin多肽的首选方法之一。但目前公开的重组制备Lunasin多肽的方法仅限于大肠杆菌原核表达以及毕赤酵母真核表达。相比于大肠杆菌原核表达系统和毕赤酵母真核表达系统，哺乳动物细胞表达系统发展较晚，而且细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上也影响了它的广泛应用。因此，目前尚未见在哺乳动物细胞中重组表达Lunasin多肽的相关报道。

大肠杆菌原核表达系统具有操作简单、表达水平高、周期短、易于大规模高密度培养、成本低等优点，往往成为表达抗体片段以及表达产物翻译后修饰的有无不影响功能和活性的蛋白类药物的首选表达系统。而对于Lunasin多肽来说，表达产物多肽链的折叠、二硫键的形成等常影响表达产物的合成分泌、生物活性、体内稳定性及免疫原性等特性。由于原核细胞缺少内质网和高尔基体等可用于进行糖基化的结构和机制，所表达的产物是非糖基化的，且常常以包涵体的形式存在；酵母、昆虫及植物等真核细胞虽能进行糖基化，但其糖基化的方式与人类等哺乳动物细胞糖基化的方式是不一样的。与其他真核细胞表达系统相比，在哺乳动物细胞中表达的目的基因产物与天然蛋白的结构、糖基化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，并且哺乳动物细胞能以悬浮培养或在无血清的培养基中达到高密度且培养体积能达到1000L以上。因此，建立哺乳动物细胞高效表达体系及高表达工程细胞株的获得，是制药基因工程药物研究和生产的瓶颈，也是研究方向。

发明内容：

本发明的目的是提供一种利用哺乳动物细胞CHO-S高水平、高质量表达抗癌、抗炎多肽Lunasin的方法。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

Lunasin多肽在哺乳动物细胞中的表达、纯化方法，包含如下步骤：

(1)体外化学合成Lunasin基因；

(2)以体外化学合成的Lunasin基因为模板，设计含有特异性酶切位点的引物，PCR扩增Lunasin基因；

(3)真核细胞表达载体的改造：以哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1为骨架，在多克隆位点中分别加入引导表达蛋白质分泌的小鼠的IL2信号肽基因序列，用于纯化目的蛋白质的6个连续的编码组氨酸的基因序列，以及用以增加蛋白质表达量的强启动子WPRE，将改造后的表达载体命名为pZWCT1；

(4)通过双酶切和T4DNA连接酶方法将Lunasin基因连接到改造后的哺乳动物细胞表达载体pZWCT1上；

(5)阳性克隆的鉴定；

(6)表达载体质粒瞬时转染哺乳动物细胞CHO-S；

(7)高密度细胞培养生产Lunasin多肽；

(8)Lunasin多肽的分离纯化。

其中，步骤(2)中所述的含有特异性酶切位点的引物优选含有EcoRI和XhoI酶切位点的引物，上游引物序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物序列如SEQ ID NO.3所示.

所述的步骤(3)真核细胞表达载体的改造的具体方法优选包括以下步骤：以pCDNA3.1载体为骨架，用内切酶NheI和EcoRI双酶切，然后连接合成的编码小鼠IL2信号肽和6个连续组氨酸的基因序列(两端含NheI和EcoRI酶切位点)，连接成功之后，再用内切酶XhoI和ApaI双酶切，用同样的技术手段将强启动子WPRE连接入多克隆位点，载体改造成功。

步骤(5)所述的阳性克隆的鉴定方法优选为菌落PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序鉴定中的一种或多种。

步骤(6)所述的表达载体质粒瞬时转染哺乳动物细胞CHO-S的方法为：将CHO-S细胞密度调为2.5×10⁶/ml后转染表达载体。

运用很少分泌自身内源蛋白、转录翻译后修饰准确且能以悬浮培养方式达到高密度培养的CHO-S细胞株合成Lunasin多肽，转染表达载体的CHO-S细胞在培养的过程中能持续高密度生长并持续合成和分泌Lunasin多肽，转染改造后的表达载体的CHO-S细胞在培养过程中细胞密度能超过1.5×10⁷/ml，远高于普通细胞培养5×10⁵/ml的密度。步骤(7)所述的高密度细胞培养生产Lunasin多肽的方法优选为：在GibcoBRL公司的无血清IMDM培养基(IMDM粉17.7g/L，NaHCO₃>2浓度孵箱，37℃，100-150rpm振荡培养10天，CHO-S细胞能在无血清的培养基中持续高密度生长。

步骤(8)所述的Lunasin多肽的分离纯化方法优选为：离心后收取上清液，运用镍离子柱亲和纯化Lunasin蛋白，并用SDS-PAGE检测纯化蛋白质的纯度。

本发明所述的Lunasin多肽在哺乳动物细胞中的表达、纯化方法，优选还包括蛋白质免疫印迹分析鉴定Lunasin多肽及Lunasin多肽的生物活性鉴定。

本发明的有益效果:

本发明获得Lunasin多肽的方法是体外化学合成Lunasin基因，通过基因拼接将Lunasin基因导入哺乳动物细胞CHO-S，并运用哺乳动物细胞CHO-S能以悬浮培养方式达到高密度培养合成，使Lunasin多肽的规模化生产成为可能，使Lunasin多肽的稳定性得到极大的提高。运用哺乳动物细胞CHO-S在培养液中高密度生长的过程中能持续高密度生长并持续合成和分泌Lunasin多肽，成本低、产量高，蛋白修饰准确，而且蛋白纯化方便简单。本发明获得的具有抗炎抗癌的Lunasin多肽，能够显著降低由LPS刺激巨噬细胞RAW264.7后促炎因子NO的释放量，达到抗炎抗癌的效果。该抗炎抗癌活性肽具有高效低毒的特点，对于开发抗炎抗癌药物和功能食品有着较好的应用前景。由于Lunasin多肽能通过基因异源表达合成技术进行大规模制备，为将来药物开发中低成本和高产率的制备奠定了基础。

附图说明

图1是Lunasin基因的PCR扩增结果图。

1为扩增的Lunasin基因，M为标准分子量

图2是改造并插入Lunasin基因的表达载体图。

图3 EcoRI和XhoI双酶切鉴定阳性表达载体图。

其中，M为标准分子量；1，2为阳性质粒的双酶切结果

图4是Lunasin基因测序结果图。

图5是Lunasin基因序列比对结果图。

其中，Sequence 0为重组载体测序结果序列，Sequence 1为合成的Lunasin基因序列，Consensus为一致性序列。

图6是SDS-PAGE检测Lunasin多肽纯化结果图。

其中，1为转染阳性质粒载体；2，3为未转染质粒的空白细胞对照；4为转染空载体的细胞对照

图7是Western Blot分析结果图。

其中，1为转染空载体；2为转染阳性质粒载体。

图8是Lunasin多肽的活性检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

1)NCBI数据库查找Lunasin基因序列，体外化学合成Lunasin基因。Lunasin基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2)设计扩增Lunasin基因引物。正向引物(Lunasin-F)为CGTCCAAATGGCAGCACCAGC(SEQ ID NO.2)，酶切位点为EcoRI(斜体)；反向引物(Lunasin-R)为CCGGTCGTCGTCATCATCATCATCGTC(SEQ ID NO.3)，酶切位点为XhoI(斜体)。

3)PCR扩增Lunasin基因。扩增条件为95℃3min预变性，95℃30s、55℃30s、72℃50s，30个循环，72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR片段符合目的基因预期大小，见图1。

PCR扩增体系：

4)真核细胞表达载体的改造。以哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1为骨架，在多克隆位点中分别加入用以引导表达蛋白质的分泌的小鼠IL2信号肽、用于表达蛋白质的纯化的6个连续的编码组氨酸(6His)的基因序列、以及用以增加蛋白质的表达量强启动子WPRE。具体步骤如下：首先运用内切酶NheI和EcoRI同时双酶切表达载体pcDNA3.1及体外合成的编码小鼠IL2信号肽和6个连续的组氨酸的基因序列(TATCACCCTTGCTAATCACTCCTCACAGTGACCTCAAGTCCTGCAGGCATGTACAGCATGCATCATCACCATCACCAT(SEQ ID NO.4)，两端斜体分别表示NheI和EcoRI酶切位点)，然后分别回收两者酶切后的目的片段，纯化后用T4DNA连接酶于16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取生长良好的单一菌落进行菌落PCR验证，所用正向引物为载体上的CMVPromoter Primer(GTGATGCGGTTTTGGCAGTACATC(SEQ ID NO.5))，反向引物为插入目的片段IL2信号肽和6个连续的编码组氨酸基因的3’端互补序列(6His-R：GAATTCATGGTGATGGTGATGATG(SEQ ID NO.6))，如果PCR扩增出条带大小为370bp，即为将小鼠IL2信号肽和6个连续的编码组氨酸基因序列已成功连入pcDNA3.1载体；提取阳性克隆的质粒，用内切酶XhoI和ApaI进行双酶切后，用同样的技术手段将体外合成的强启动子WPRE基因序列(SEQ ID NO.7，WPRE基因两端斜体分别为XhoI和ApaI酶切位点)连接入多克隆位点，用于检测阳性克隆的引物为WPRE基因的正向引物WPRE-F(GAATCAACCTCTGGATTACA(SEQID NO.8))和载体上bGH poly(A)signal的3’端互补序列(bGH signal-R:CCAGCATGCCTGCTATTGTC(SEQ ID NO.9))，如果PCR扩增条带大小为840bp，表明将强启动子WPRE基因序列成功连入多克隆位点，载体即改造成功。将改造后的表达载体命名为pZWCT1，见图2。

5)Lunasin基因连接真核细胞表达载体。EcoRI和XhoI双酶切Lunasin基因PCR扩增产物和pZWCT1基因表达载体，将两者双酶切产物切胶纯化后运用T4DNA连接酶进行连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过菌落PCR鉴定阳性克隆，提取阳性克隆质粒进行双酶切鉴定，结果显示上面条带为载体，下面小片段大小符合目的基因大小，见图3。进一步通过测序验证已连接片段的序列是否与目的片段的序列相同，结果显示拼接基因是我们需要的目的基因，见图4和图5。

6)转染哺乳动物细胞CHO-S。CHO-S细胞株具有准确的转录翻译后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能等方面最接近于天然蛋白形态，而且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物的分离纯化。此外，CHO-S细胞株能以悬浮培养方式在培养的过程中持续高密度生长。细胞转染前将CHO-S细胞密度调为2.5×10⁶/ml，所述转染是在如下条件进行，按细胞：质粒：PEI＝1:3:9的比例进行瞬时转染，转染时间为7天。

7)Lunasin多肽的高密度细胞培养生产和分离纯化。利用CHO-S细胞株能以悬浮培养方式达到高密度培养的特性，转染表达载体的CHO-S细胞在培养的过程中能持续高密度生长并持续合成和分泌Lunasin多肽，具体方法为：将CHO-S细胞密度调为2.5×10⁶/ml后转染表达载体，在GibcoBRL公司的无血清IMDM培养基(IMDM粉17.7g/L，NaHCO₃>2浓度孵箱，37℃，125rpm振荡培养，CHO-S细胞能在无血清的培养基中持续高密度生长，其细胞密度能超过1.5×10⁷/ml，远高于普通细胞培养5×10⁵/ml的密度。离心后收取上清液，运用镍离子柱亲和纯化Lunasin蛋白，并用SDS-PAGE检测纯化蛋白质的纯度，纯度超过98％，见图6。

8)蛋白免疫印迹(Western Blot)分析鉴定Lunasin多肽。取5.5cm×7.8cm PVDF膜及滤纸。将PVDF膜于甲醇中湿润，浸于l×转移缓冲液中平衡10-15min。SDS-PAGE电泳结束后，将蛋白湿转入PVDF膜。在转移盒中，依次放入海棉垫、2层滤纸(预先在转移液中湿润)、凝胶(未染色的SDS-PAGE凝胶)、PVDF膜、2层滤纸(预先在转移液中湿润)，扣紧。将转移盒放入转移槽中，凝胶面朝向阴极，接通电源，恒流200mA转移2h。取出转印膜放入封闭液中，置于摇床上室温处理1h。以TBS-T洗液洗膜4次，每次10-15min。将膜放入含1：400稀释的鼠源His单克隆抗体(一抗)溶液中室温孵育1h。将膜取出，用PBS-T洗液洗膜4次，每次10-15min。将膜放入含有1：2000稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(二抗)，继续室温孵育1h。取出膜，以PBS-T洗液洗膜4次，每次10-15min。利用ECL-Reagent与二抗上的辣根过氧化物酶反应，产生发射波长为428nm的光波，此光经X光片感光记录下来，结果显示表达蛋白是多肽Lunasin，见图7。

9)Lunasin多肽的生物活性鉴定。

根据Mejia和Dia方法(Mejia&Dia,2009)，本专利采用巨噬细胞RAW264.7鉴定表达的Lunasin多肽的活性。通过在细胞培养液中加入不同浓度的Lunasin多肽，检测LPS刺激巨噬细胞RAW264.7后培养基中一氧化氮(NO)浓度变化来鉴定Lunasin多肽的活性。具体步骤如下：

①在24孔板上加细胞悬液，细胞密度约为1×10⁵/孔，细胞悬液量为500μl/孔。

②5％CO₂浓度，37℃孵育24h。

③更换新鲜加药的生长培养基，5％CO₂浓度，37℃孵育30min。

④向各孔中加入1μg/mL的LPS，5％CO₂浓度，37℃孵育24h。

⑤培养基中NO浓度测定，使用碧云天公司的NO检测试剂盒，步骤参考试剂盒说明书。

图8结果显示，用1μg/mL的LPS刺激巨噬细胞RAW264.7后，细胞培养液中促炎因子NO的含量增加(与空白对照-/-相比)。当培养液中加入不同浓度(10、25和50μM)的Lunasin多肽后，与对照组(+/-)相比，细胞培养液中促炎因子NO的浓度有不同程度的减少，当培养液中加入Lunasin的浓度达50μM时，促炎因子NO的浓度显著降低。结果表明，在10-50μM范围内重组Lunasin多肽对巨噬细胞RAW264.7无细胞毒性，而且Lunasin多肽浓度为50μM时可显著降低由LPS刺激引起的促炎因子NO的产量，表明重组Lunasin多肽具有降低炎症反应的生物学活性。

<110> 江苏省中国科学院植物研究所 王元涛

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<212> DNA

<213> 大豆

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<223> 引物P1

<400> 1

tccaaatggc agcaccagca agacagctgc cgcaagcagc tccagggggt gaacctcacg 60

ccttgcgaga agcacatcat ggagaagatc caaggccgcg gcgatgacga tgatgatgat 120

gacgacgac 129

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物Lunasin-F

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cggaattctc caaatggcag caccagc 27

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<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物Lunasin-R

<400> 3

ccgctcgagg tcgtcgtcat catcatcatc gtc 33

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 编码小鼠IL2信号肽和6个连续的组氨酸的基因序列

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gctagctatc acccttgcta atcactcctc acagtgacct caagtcctgc aggcatgtac 60

agcatgcatc atcaccatca ccatgaattc 90

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物CMV Promoter Primer

<400> 5

gtgatgcggt tttggcagta catc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引物6His-R

<400> 6

gaattcatgg tgatggtgat gatg 24

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 强启动子WPRE基因序列

<400> 7

ctcgagaatc aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat 60

gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct 120

tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag 180

gagttgtggc ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc 240

cccactggtt ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc 300

ctccctattg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 360

cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc ctttccatgg 420

ctgctcgcct gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg 480

gccctcaatc cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg 540

cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcgggcc 600

c 601

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 正向引物WPRE-F

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gaatcaacct ctggattaca 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 反向引物bGH signal-R

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ccagcatgcc tgctattgtc 20