替考拉宁分子印迹膜的制备方法

摘要

本发明公开了一种替考拉宁分子印迹膜的制备方法，包括以下步骤：1)、在替考拉宁中加入甲醇，搅拌形成替考拉宁甲醇悬浮液；再加入四丁基氢氧化铵溶液直至形成澄清溶液，然后加入无水硫酸镁室温下搅拌，过滤，得滤液；2)、在滤液中加入甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯和偶氮二异丁腈搅拌均匀；然后放入PVDF膜进行浸泡，取出后放入真空干燥箱干燥；3)、将步骤2)所得的干燥后PVDF膜采用索氏提取法洗脱模板分子，直至所得的洗脱液中无替考拉宁为止，洗脱剂为甲醇/乙酸溶液；4)、洗脱后膜于空气中晾干；得替考拉宁分子印迹膜。

说明书

技术领域

本发明涉及一种分子印迹膜的制备方法，特别是一种替考拉宁分子印迹膜的制备方法。

背景技术

分子印迹膜是人工合成的对印迹分子具有专一识别能力的新型分离膜，在许多领域展现了良好的应用前景。PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物；PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。

替考拉宁，又名太古霉素，1975年被首次发现。它是特定的游动放线菌经发酵、提取后得到的一种万古霉素族糖肽类抗生素，为多个化学结构非常相似的化合物组成的抗生素混合物。替考拉宁(Teicoplanin)为与万古霉素类似的新糖肽类抗生素，其抗菌谱及抗菌活性与万古霉素相似。对金葡菌的作用比万古霉素更强，不良反应更少。本品对革兰阳性菌如葡萄球菌、链球菌、肠球菌和大多厌氧性阳性菌敏感。临床主要用于金葡菌及链球菌属等敏感菌所致的严重感染，如心内膜炎、骨髓炎、败血症及呼吸道、泌尿道、皮肤、软组织等的感染。临床用主要是注射用替考拉宁，赛诺菲安万特公司生产(商品名为他格适)，中国内也有仿制药。替考拉宁结构上与万古霉素不同的是，在肽骨架上多了脂肪酸侧链，提高了亲脂性，更易于渗入组织和细胞。替考拉宁因此在治疗上表现出比万古霉素更多的优势。

2013104671994的发明《苯乙醇胺A分子印迹膜及其制备方法与应用》，公开了一种苯乙醇胺A分子印迹膜及其制备方法；该方法包括如下步骤：苯乙醇胺A和甲基丙烯酸经混合后进行预聚合；向所述预聚合后的体系中加入二甲基丙烯酸乙二醇酯和2,2’-偶氮二异丁腈得到聚合体系，向所述聚合体系中浸入PVDF膜，然后将浸泡后的所述PVDF膜置于氮气环境下进行聚合反应，聚合反应结束后，用甲醇洗涤PVDF膜即得。该方法具有如下有益效果：本发明提供的苯乙醇胺A分子印迹膜兼具分子印迹和膜分离技术两方面的优点：(1)苯乙醇胺A分子印迹膜上特异性的空间位点和功能基团可对待测物实现特异性识别；(2)相比传统的分子印迹微球材料，本发明的分子印迹膜材料具有更稳定，形态规整，可以直接应用，不需要装柱等繁琐的制备过程。

2013102053583的发明《一种对羟基苯甲酸分子印迹膜的合成方法及其应用》，涉及一种对羟基苯甲酸分子印迹膜的合成方法及其应用，属材料制备技术领域。特指以接枝甲基丙烯酸的有机膜(PVDF)为功能性基膜，对羟基苯甲酸作为模板分子，N，N′-亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，二苯甲酮为光引发剂，以甲醇为致孔剂，以光引发法合成以商用PVDF膜为基底制备对羟基苯甲酸表面印迹吸附膜的方法。静态吸附实验用来研究了制备的印迹吸附膜的吸附平衡和选择性识别性能。结果表明利用本方法获得的对羟基苯甲酸印迹膜具有优越的对羟基苯甲酸分子识别性能。

201310020674.3的发明《一种用于组织工程的分子印迹多孔凝胶膜的制备方法》，提供了一种用于组织工程的分子印迹多孔凝胶膜的制备方法；以生长因子、多肽、蛋白质等生物活性分子为模板分子，以具有良好生物相容性并可降解吸收的天然高分子海藻酸钠为基体，以水溶性高分子或无机盐为致孔剂，采用绿色环保的水相印迹方法，制备厚度可控制在20-1000μm的分子印迹多孔凝胶膜。该方法操作简单，不使用任何有毒有害溶剂，使用的材料本身生物相容性好，可以根据细胞培养的需要，获得对不同模板分子具有识别和缓释性能的细胞培养多孔凝胶膜支架，用于调控细胞的生长，在组织工程领域有很好的应用前景。

201310416024.0的发明《一种氯唑西林分子印迹聚合膜的制备方法》，公开了一种氯唑西林分子印迹聚合膜的制备方法，包括：(1)氯唑西林聚合液的制备；(2)氯唑西林分子印迹聚合膜的制备：将氯唑西林聚合溶液通氮气除氧，浸入聚偏氟乙烯膜，再通氮气除氧后，静置浸泡；取出完全浸透的聚偏氟乙烯膜置入已被除氧的器皿中，在紫外交联仪下反应；将反应完全后得到的膜取出，用甲醇和冰醋酸的混合液洗脱至洗脱液检测不出模板分子为止，然后再用乙腈水溶液洗至中性，即得氯唑西林分子印迹聚合膜。本发明对氯唑西林在动物源性食品中的残留检测具有重要意义。同时本发明建立的氯唑西林分子印迹聚合物膜具有操作简便、耗能少、反应时间短、干净无污染等特点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种替考拉宁分子印迹膜的制备方法。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种替考拉宁分子印迹膜的制备方法，依次包括以下步骤：

1)、在替考拉宁中加入甲醇，搅拌形成替考拉宁甲醇悬浮液；

于搅拌条件下，向替考拉宁甲醇悬浮液中加入(滴加)四丁基氢氧化铵溶液直至形成澄清溶液，然后加入无水硫酸镁室温下搅拌1～3h，过滤，得滤液；

2)、在滤液中加入甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)和偶氮二异丁腈(AIBN)搅拌均匀；然后放入PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜)进行浸泡(PVDF膜需全部被浸没)，浸泡时间为1±0.2h，取出后放入真空干燥箱干燥；

所述替考拉宁：甲基丙烯酸(MAA)：乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)：偶氮二异丁腈(AIBN)＝1：3.8～4.2：65～70：0.7～0.9的摩尔比；

3)、将步骤2)所得的干燥后PVDF膜采用索氏提取法洗脱模板分子，直至所得的洗脱液中无替考拉宁为止，洗脱剂为甲醇/乙酸溶液，所述甲醇/乙酸溶液中甲醇的体积浓度为88～92％；

4)、步骤3)所得的洗脱后膜于空气中晾干；得替考拉宁分子印迹膜(MIM)。

作为本发明的替考拉宁分子印迹膜的制备方法的改进，所述步骤3)为：将步骤2)所得的干燥后PVDF膜浸泡在洗脱剂中于80±5℃水浴3±0.5h，倒掉所产生的洗脱液，重新更换洗脱剂后重复上述水浴，直至所得的洗脱液中不再检测到替考拉宁为止。

作为本发明的替考拉宁分子印迹膜的制备方法的进一步改进：四丁基氢氧化铵溶液是质量浓度23～28％的四丁基氢氧化铵甲醇溶液。

作为本发明的替考拉宁分子印迹膜的制备方法的进一步改进：所述步骤2)中的干燥为于60±10℃干燥48±2h。

作为本发明的替考拉宁分子印迹膜的制备方法的进一步改进：所述替考拉宁：甲基丙烯酸(MAA)：乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)：偶氮二异丁腈(AIBN)＝1：4：66.7：0.8的摩尔比。

作为本发明的替考拉宁分子印迹膜的制备方法的进一步改进：所述甲醇/乙酸溶液中甲醇的体积浓度为90％。

即，甲醇：乙酸＝9:1的体积比。

作为本发明的替考拉宁分子印迹膜的制备方法的进一步改进：所述步骤1)中，每0.3mmol替考拉宁配用15±5ml的甲醇、2±0.5g的无水硫酸镁。

本发明在发明过程中考虑到替考拉宁易溶于水、难溶于甲醇等溶剂，且不溶于有机溶剂，其溶解特性不利于分子印迹膜的制备，因此本发明步骤1)中通过使用四丁基氢氧化铵溶液改变功能单体，解决了替考拉宁在甲醇中溶解性问题，即，解决了利用传统溶剂无法进行替考拉宁分子印迹膜的制备。

本发明的替考拉宁分子印迹膜的用途是：可进行替考拉宁富集、用于替考拉宁浓度测定。

本发明的技术优势主要体现在：由于替考拉宁溶解性特殊，其用传统制备方法难于获得分子印迹聚合物或分子印迹膜，本发明成功制备了替考拉宁分子印迹膜，为类似溶解特性的物质制备分子印迹聚合物或印迹膜提供了技术参考。同时，替考拉宁血药浓度等检测步骤极其繁琐，本发明在替考拉宁的富集、分离和检测方面具有良好的应用前景，后续可为替考拉宁浓度快速检测提供条件。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是替考拉宁的紫外标准曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1、一种替考拉宁分子印迹膜的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、称取替考拉宁0.3mmol(约0.5690g)，加入15ml甲醇，搅拌形成替考拉宁甲醇悬浮液；

于搅拌条件下，向替考拉宁甲醇悬浮液中滴加四丁基氢氧化铵溶液(质量浓度25％的四丁基氢氧化铵甲醇溶液，用量约1ml)直至形成澄清溶液，然后加入2g无水硫酸镁，室温下搅拌2h，过滤，得滤液；

2)、在滤液中加入AAM 1.2mmol(86mg)、EDGMA 20mmol(4ml)和AIBM 0.24mmol(40mg)，搅拌均匀；然后放入PVDF膜进行浸泡(PVDF膜需全部被浸没)，浸泡1h，取出后放入真空干燥箱中，60℃干燥48h；

3)、将步骤2)所得的干燥后PVDF膜采用索氏提取法洗脱模板分子，洗脱剂为甲醇乙酸(9:1/v：v)溶液；

即，将干燥后的PVDF膜放入洗脱剂中于80±5℃水浴3h，倒掉所产生的洗脱液，重新更换洗脱剂后重复上述水浴，直至所得的洗脱液中不再检测到替考拉宁为止。

4)、洗脱后的膜于空气中晾干；得替考拉宁分子印迹膜MIM。

实验一、

空白膜NIM的制备方法，依次进行以下步骤：

1)、15ml甲醇中，于搅拌条件下，滴加四丁基氢氧化铵溶液(质量浓度25％的四丁基氢氧化铵甲醇溶液，用量约1ml)，然后加入2g无水硫酸镁，室温下搅拌2h，过滤；

2)、在滤液中加入AAM 86mg(1.2mmol)、EDGMA 4ml(20mmol)和AIBM 40mg(0.24mmol)，搅拌均匀；然后放入PVDF膜(同实施例1所用的PVDF膜)进行浸泡(PVDF膜需全部被浸没)，浸泡1h，取出后放入真空干燥箱中，60℃下，干燥48h，得空白膜NIM。

替考拉宁模板分子印迹膜MIM特异性吸附能力评价：

制备9.5mg/L的替考拉宁溶液，称取等量MIM和NIM分别置于烧杯中，并分别加入上述浓度(9.5mg/L)的替考拉宁水溶液30mL，于恒温振荡箱中25℃条件下振荡8h。取出膜，紫外分光光度法检测溶液浓度。

紫外分光光度计测定替考拉宁浓度：

标准曲线：配制2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/L的替考拉宁标准溶液，在210nm出检测吸光度，画出标准曲线，如图1。利用聚合物吸附前后的浓度差值，可计算出MIM和NIM的吸附量Q：Q＝(C0-Cv)*V/m和特异因子α：(1)△Q＝QMIM-QNIM；(2)α＝QMIM/QNIM。其中QMIM为MIM的饱和吸附量，QNIM为NIM的饱和吸附量。C0为配制的替考拉宁溶液浓度(单位mg/L)，Cv为静态吸附后溶液浓度(单位mg/L)，V为静态吸附溶液体积(单位L)，m为用于静态吸附的MIM质量(单位g)。

实验结果：QMIM＝12；QNIM＝4.69

△Q＝QMIM-QNIM＝7.31；

α＝QMIM/QNIM＝2.56。

结论：替考拉宁分子印迹膜对替考拉宁分子具有特异性吸附。

对比例1、取消实施例1步骤1)中“四丁基氢氧化铵溶液”的使用，其余等同于实施例1。

取消“四丁基氢氧化铵溶液”的使用，替考拉宁将在溶液中析出，因此无法制备分子印迹膜。

对比例2、将实施例1中的无水硫酸镁的用量由2g改成1g，其余等同于实施例1。这会导致除水不完全，使印迹失败，无法进行特异性吸附。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。