一种生物微乳液小胶束、膀胱癌细胞悬液及小鼠气囊膀胱癌模型的构建方法

摘要

本发明公开了一种生物微乳液小胶束、膀胱癌细胞悬液及小鼠气囊膀胱癌模型的构建方法，属于癌症模型构建技术领域。该生物微乳液小胶束是将PAMAM用促肿瘤生长液配置成10％的PAMAM溶液；将COOH‑PEG‑OH加入到10％PAMAM溶液中，混合均匀；将5％醛基化的右旋糖酐与上述溶液进行混合，获得生物微乳液小胶束。该细胞悬液是将经过消化处理后的对数期膀胱癌细胞与生物微乳液小胶束进行混合获得的。本发明还提供了一种小鼠气囊膀胱癌模型的构建方法。本发明膀胱癌细胞悬液可以使肿瘤成团生长，防止癌细胞移位，并且能够促进肿瘤生长。气囊膀胱癌模型利用气囊代替膀胱，可用于药物灌注，成功率高，成瘤周期短。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物微乳液小胶束、膀胱癌细胞悬液及小鼠气囊膀胱癌模型的构建方法，属于癌症模型构建技术领域。

背景技术

现有的小鼠肿瘤模型的建立常用到生物胶(基质胶，matrigel)配制细胞悬液以利于细胞团聚，增加肿瘤种植的成功率，但使用生物胶有时出现肿瘤细胞在悬液中聚集而无法获得足够的营养，最终造成种瘤失败。同时生物胶会造成肿瘤团块缺血缺氧，导致肿瘤生长缓慢甚至停滞。目前，小鼠膀胱癌模型分为皮下瘤模型和原位瘤模型，皮下瘤模型多采取将肿瘤细胞种植于皮下完成。原位瘤模型分为自发成瘤模型与移植瘤模型，移植瘤模型是破坏小鼠膀胱粘膜后将肿瘤细胞种植于膀胱，自发成瘤模型是持续喂养小鼠含有化学药物的水而诱导肿瘤生成。

化疗药灌注治疗是膀胱癌术后最重要的治疗方法，但因小鼠膀胱体积较小，现有的小鼠膀胱癌模型多采用药物静脉注射治疗，但静脉注射是经血给药，给药方式不同于灌注治疗，不能准确地反应药物的疗效和副作用。

现有的小鼠膀胱癌模型主要存在以下问题：1、皮下瘤模型虽然成功率高、操作简便，但药物治疗时只可采用静脉给药的方式，不能使用现在临床上药物灌注的方法，由于药物灌注和静脉注射引起的副作用种类和程度不尽相同，这使得对药物疗效的评价存在偏差，因此皮下瘤模型不能准确评价药物灌注的副作用；2、原位癌模型中的移植瘤模型虽然可以模拟膀胱癌的生长环境且可以进行灌注治疗，但灌注治疗过程中容易造成膀胱破裂导致小鼠死亡，此种方式构建模型的死亡率可达30％(Zhang N,Dongyang L I,Shao J,etal.Animal models for bladder cancer:The model establishment and evaluation(Review)[J].Oncology Letters,2015,9(4):1515-1519.)；3、原位癌模型中的自发成瘤模型，由于需要持续喂养小鼠含有化学药物的水进而诱导肿瘤生成，因此存在耗时过长的缺陷，往往需要2-5个月的时间诱导肿瘤的发生(Weldon T E,Soloway M S.Susceptibilityof urothelium to neoplastic cellular implantation[J].Urology,1975,5(6):824-827)，这会过多的耗费人力物力并显著延长实验周期。

发明内容

为解决现有生物胶配置细胞悬液种瘤后造成肿瘤细胞在悬液中聚集而无法获得足够的营养，最终造成种瘤失败，或肿瘤团块造成营养供应不足，以及小鼠膀胱癌模型中的皮下瘤模型无法使用药物灌注的方式，不能准确评价药物灌注的副作用和疗效，移植瘤模型死亡率高，自发成瘤模型建模周期过长的问题，本发明提供了用于构建膀胱癌模型的细胞悬液，气囊的制备方法、气囊膀胱癌模型构建方法及小鼠气囊膀胱癌模型的构建方法，气囊膀胱癌模型可以采用药物灌注的方式，可以准确评价药物的疗效和副作用，同时该模型成瘤率高、死亡率低，模型构建时间短，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种生物微乳液小胶束，该生物微乳液小胶束是通过如下步骤进行制备的：

1)将氨基的树状大分子PAMAM用促肿瘤生长液配置成10％(质量)的PAMAM溶液；所述促肿瘤生长液是将VEGF人重组蛋白和Endocan人重组蛋白加入到DMED培养液中配置成促肿瘤生长液；

2)将COOH-PEG-OH加入到步骤1)获得的10％PAMAM溶液中，混合均匀；

3)将5％(质量)醛基化的右旋糖酐与步骤2)获得的溶液进行混合，获得生物微乳液小胶束。

进一步地，步骤2)所述10％(质量)PAMAM溶液和COOH-PEG-OH的质量比为1:7。

进一步地，所述步骤3)是将5％(质量)醛基化的右旋糖酐与步骤2)获得的溶液按照体积比为1:1进行混合。

进一步地，所述VEGF人重组蛋白和Endocan人重组蛋白在促肿瘤生长液中的终浓度均为10μg/mL。

本发明中氨基的树状大分子PAMAM为聚酰胺-胺型树枝状高分子，含75％氨基。可直接购买获得。

本发明还提供了一种用于构建膀胱癌模型的膀胱癌细胞悬液，该膀胱癌细胞悬液是将对数生长期的膀胱癌细胞进行消化离心，弃上清后将膀胱癌细胞与上述生物微乳液小胶束进行混合，获得膀胱癌细胞悬液。

进一步地，所述生物微乳液小胶束与膀胱癌细胞(经过消化离心后的膀胱癌细胞)的体积比为(1:1)-(1:2)。

进一步地，所述生物微乳液小胶束与膀胱癌细胞(经过消化离心后的膀胱癌细胞)的体积比为1:1。

进一步地，所述消化是用0.25％胰蛋白酶消化3min-5min。

本发明所述生物微乳液小胶束与经过消化处理后的膀胱癌细胞是在冰上混匀的，防止细胞失活。本发明制备好的膀胱癌细胞悬液置于冰盒中待用，以防止生物微乳液小胶束凝固。

本发明所述细胞悬液中的膀胱癌细胞可以是MB49、EJ、RT112、5637中的任意一种，但不局限于上述列举的膀胱癌细胞，其他膀胱癌细胞也都可以用于制备本发明的细胞悬液，均可以获得相同的技术效果。

本发明还提供了上述的膀胱癌细胞悬液在构建膀胱癌模型中的应用。

本发明还提供了一种小鼠气囊膀胱癌模型的构建方法，具体包括如下步骤：

步骤一：取5周龄小鼠，麻醉小鼠后在小鼠背部选择一块区域将鼠毛剔除干净，注入无菌空气3mL，以后每隔一天补充注入无菌空气1mL，5天后气囊构建完毕；

步骤二：将上述制备获得的膀胱癌细胞悬液接种于步骤一构建的气囊的最低点，并在接种结束后，继续保持体位2min至生物微乳液小胶束凝固，之后每隔一天注入无菌空气1mL，直至形成肿瘤，即获得小鼠气囊膀胱癌模型。

本发明方法中接种时需注意，接种位置需处于气囊在小鼠身体中的最低点，并在接种结束后，继续保持体位2min至生物微乳液小胶束凝固，这样可防止肿瘤移位。

本发明所述小鼠为C57BL/6小鼠，也可以选用其他类型的小鼠,如BALB/c裸小鼠,经试验可以成瘤，可以获得与C57BL/6小鼠相同的技术效果。

本发明选择5周龄的小鼠，5周的小鼠自身免疫力弱，有利于成瘤。小于5周龄的小鼠可能会发生无法负荷肿瘤致使小鼠死亡的情况。

本发明所构建的小鼠气囊膀胱癌模型可以用于后续进行灌注治疗。

本发明中气囊的制备方法应该不仅仅是本案中提及的一种方法，有可能还有多种方法，采用其他方法获得的气囊用该细胞悬液应该也能够实现小鼠气囊膀胱该模型的制作。

本发明中注入空气的针头孔径可以为26G-30G，使用孔径为该范围内的针头可以避免针孔过大导致气囊跑气。

由于小鼠膀胱体积小，本发明的小鼠气囊膀胱癌模型用气囊模拟膀胱，即用气囊代替膀胱的囊状结构，利于操作和观察。

本发明中采用的无菌空气以防止小鼠感染造成的炎症会影响肿瘤生长，使肿瘤相关的生化指标产生波动，从而导致实验结果不准确。

本发明有益效果：

1、本发明通过在传统的DMEM培养液中加入了VEGF和Endocan人重组蛋白制备促肿瘤生长液，该促肿瘤生长液能够为肿瘤提供更多的氧气和养分，促进肿瘤生长。并且本发明控制VEGF人重组蛋白和Endocan人重组蛋白在促肿瘤生长液中的终浓度均为10μg/mL，经试验，10μg/mL可使肿瘤血管密度达到最高点。

2、本发明制备了一种全新的生物微乳液小胶束，该生物微乳液小胶束一方面由于其中的树状分子结构PAMAM，可使细胞嵌合于胶束的微孔中，有利于细胞在其中均匀分布和获得营养供应，进而促进肿瘤生长，不会出现采用生物胶配置细胞悬液后肿瘤细胞在悬液中分布不均，无法获得足够的营养，最终造成种瘤失败，也不会出现肿瘤细胞团块供血供氧不足的现象，成功的克服了“现有生物胶配置细胞悬液种瘤后造成肿瘤细胞在悬液中聚集而无法获得足够的营养，最终造成种瘤失败，或肿瘤团块造成营养供应不足”；另一方面生物微乳液小胶束还可以作为一种凝胶，其粘附性强，可以粘附于人体任何组织，较准确地将膀胱癌细胞固定到某个预设位置，防止癌细胞移位，进而使得肿瘤成瘤率得到提高，并且促进肿瘤成团生长，同时，生物微乳液小胶束由于其微结构特点，可使细胞更均匀的分布其中，有利于细胞均匀获得营养供应，加快肿瘤生长，促进肿瘤成形，而不会出现肿瘤细胞团块造型营养供应不足的现象。

3、本发明通过将将VEGF人重组蛋白和Endocan人重组蛋白加入到DMED培养液中配置成促肿瘤生长液，然后用促肿瘤生长液将氨基的树状大分子PAMAM配置成10％(质量)的PAMAM溶液，再加入COOH-PEG-OH混合均匀，然后加入5％(质量)醛基化的右旋糖酐混合，最终制备获得一种新型的生物微乳液小胶束，该方法中通过优化采用10％PAMAM溶液和COOH-PEG-OH按照质量比为1:7进行混合，将5％(质量)醛基化的右旋糖酐与步骤2)获得的溶液按照体积比为1:1进行混合，上述参数最有益于化学反应。

4、本发明小鼠气囊膀胱癌模型构建方法中将膀胱癌细胞与生物微乳液小胶束混匀，通过将生物微乳液小胶束与膀胱癌细胞混匀，可以通过生物微乳液小胶束的作用将膀胱癌细胞固定到气囊上，使肿瘤成团生长。本发明将生物微乳液小胶束与经过消化处理后的膀胱癌细胞按照(1:1)-(1:2)混匀，即不会因生物微乳液小胶束所占的体积过大，造成细胞密度低，不易成瘤；也不会因细胞所占的体积过大，不能维持种瘤形态且不利于种瘤贴附于气囊壁，其中等体积混合效果最好。

5、以往文献报道小鼠膀胱癌皮下瘤模型不能进行药物灌注治疗，对药物的疗效和副作用评价存在偏差，而原位癌模型或死亡率高、操作复杂，或耗时长，耗费人力物力，本发明利用气囊代替膀胱，模拟膀胱的囊状结构，提供了一种小鼠气囊膀胱癌模型的构建方法，该模型可以采用药物灌注的方式给药，更贴近临床膀胱癌药物治疗方法，可以准确评价药物的疗效，能够解决皮下瘤模型不能进行药物灌注治疗，对药物的疗效和副作用评价存在偏差的问题，同时该方法种植肿瘤操作简便，成瘤率高达100％、死亡率低，模型构建成瘤周期短，能够解决原位癌模型或死亡率高、操作复杂，或耗时长，耗费人力物力的问题，本发明方法可用于构建小鼠膀胱癌模型，进而用于评价药物的治疗效果和副作用。

6、传统的构建小鼠模型的方法是先将细胞悬液吸入注射器后，打入小鼠皮下构建皮下瘤模型，或利用细胞种植于膀胱、喂食化学药物的方法构建原位癌模型而本发明通过构建气囊代替膀胱的囊状结构，构建气囊后将细胞悬液种植于气囊内，模拟膀胱内生长的肿瘤，可以解决皮下瘤无法应用药物灌注治疗的问题，克服原位癌模型死亡率高、成瘤周期长的缺点，进而能够达到利用小鼠模型模拟药物灌注治疗的效果。

7、本发明构建气囊的过程中通过“先注入无菌空气3mL，以后每隔一天补充注射无菌空气1mL，5天以后气囊构建完毕”，采用首次注射3mL无菌空气，以保证气囊有足够的体积，以后，每隔一天补充注射1mL无菌空气，维持气囊形态，5天或者多于5天气囊构建完成。

8、本发明在构建小鼠气囊膀胱癌模型过程中通过“将膀胱癌细胞悬液接种于构建好的气囊中，每隔一天补充注射无菌空气1mL，5天以后获得小鼠气囊膀胱癌模型”，采用每隔一天补充注射无菌空气1mL是为了维持气囊形态，5天或者多于5天后膀胱癌模型构建成功。

附图说明

图1为生物微乳液小胶束。

图2为小鼠气囊膀胱癌模型构建完毕后的外观。

图3为将小鼠气囊膀胱癌模型构建完成后，将气囊剥离的外观。

图4为构建小鼠气囊膀胱癌模型的流程图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1：促肿瘤生长液的制备

本实施例提供了一种促肿瘤生长液，该促肿瘤生长液是通过如下方法制备的：

将VEGF人重组蛋白和Endocan人重组蛋白加入到DMED培养液中配置成促肿瘤生长液；使得VEGF人重组蛋白和Endocan人重组蛋白在促肿瘤生长液中的终浓度均为10μg/mL。

为了说明本实施的促肿瘤生长液所能够产生的有益效果，通过以下实验进行说明：

对照实验1：将VEGF人重组蛋白加入到DMED培养液中配置成促肿瘤生长液(10μg/mL)。

对照实验2：将Endocan人重组蛋白加入到DMED培养液中配置成促肿瘤生长液(10μg/mL)。

将对照实验1和对照实验2以及本实施例制备的促肿瘤生长液用于构建小鼠膀胱癌模型，以验证该促肿瘤生长液的促生长作用。

构建小鼠膀胱癌模型具体方法为：将MB49膀胱癌细胞接种于含10％灭活小牛血清的DMEM培养液中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度下培养，每1-2d换液1次。取对数生长期的MB49细胞若干瓶，0.25％胰蛋白酶消化细胞约5min，弃去消化液，加入少量的完全培养基，将细胞从瓶壁吹打下来，混匀离心800rpm，5min，弃上清，每瓶消化所得细胞分别与150μl上述三种促肿瘤生长液混匀后种植于小鼠腋下部。5天后测量每组肿瘤直径大小。结果如表1所示。

表1不同促肿瘤生长液的效果比较

本实施例对照实验1对照实验2肿瘤直径(mm)0.650.410.37

通过表1中的数据可知，本实施例的促肿瘤生长液种瘤后5天肿瘤直径可达0.55mm，远远大于对照实验1和2，说明本实施例采用VEGF人重组蛋白和Endocan人重组蛋白能够显著促进肿瘤生长，进而可以缩短培养肿瘤的周期，同时采用两种的效果远远好于单独一种的效果，说明VEGF人重组蛋白和Endocan人重组蛋白能够起到协同促进肿瘤生长的作用。

实施例2：一种生物微乳液小胶束

本实施例提供了一种生物微乳液小胶束，该生物微乳液小胶束是通过如下步骤进行制备的：1)将氨基的树状大分子PAMAM用实施例1制备的促肿瘤生长液(将VEGF人重组蛋白和Endocan人重组蛋白加入到DMED培养液中配置成促肿瘤生长液，VEGF人重组蛋白和Endocan人重组蛋白在该促肿瘤生长液中的终浓度均为10μg/mL)配置成10％(质量)的PAMAM溶液；2)将COOH-PEG-OH按照10％PAMAM溶液和COOH-PEG-OH的质量比为1:7加入到步骤1)获得的10％PAMAM溶液中，混合均匀；3)将5％(质量)醛基化的右旋糖酐与步骤2)获得的溶液等体积进行混合，获得生物微乳液小胶束。所得的生物微乳液小胶束如下图1所示。

本实施例中的氨基的树状大分子PAMAM为聚酰胺-胺型树枝状高分子，含75％氨基。

实施例3：一种用于构建膀胱癌模型的膀胱癌细胞悬液

本实施例提供了一种用于构建膀胱癌模型的膀胱癌细胞悬液，该膀胱癌细胞悬液是将对数生长期的膀胱癌细胞进行消化处理后离心，将经过消化处理后的膀胱癌细胞与实施例2制备的生物微乳液小胶束进行混合，获得膀胱癌细胞悬液；生物微乳液小胶束与经过消化处理后的膀胱癌细胞的体积比为(2:1)-(1:2)(其中等体积混合效果最好)；其中消化处理是用0.25％胰蛋白酶消化3min-5min，具体方案如下：

1)将MB49膀胱癌细胞接种于含10％灭活小牛血清的DMEM培养液中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度下培养，每1-2d换液1次，培养至对数生长期。

2)取对数生长期的MB49细胞若干瓶，0.25％胰蛋白酶消化细胞约5min，弃去消化液，加入少量的完全培养基，将细胞从瓶壁吹打下来，混匀离心800rpm，5min，弃上清，

3)按照膀胱癌细与生物微乳液小胶束的体积比为2:1，1:1，1:2加入生物微乳液小胶束在冰上混匀，置于冰盒中待用，以防止生物微乳液小胶束凝固和细胞失活，分别命名为实验组1、实验组2和实验组3。

为证明本实施例制备的膀胱癌细胞悬液能够取得的有益效果，分别将实验组1、2和3制备的膀胱癌细胞悬液用于构建小鼠皮下膀胱癌模型，具体方法如下：

利用注射器分别吸取150μl三种不同比例的细胞悬液，注射至小鼠腋下皮肤。5天后观察肿瘤大小，结果如表2所示。

表2不同比例膀胱癌细胞悬液种瘤后的肿瘤大小

由表2可知：将生物微乳液小胶束与经过消化处理后的膀胱癌细胞按照(2:1)-(1:2)混匀肿瘤后均可成功获得肿瘤，但其中等体积混合效果最好，说明将生物微乳液小胶束与经过消化处理后的膀胱癌细胞按照(2:1)-(1:2)即不会因生物微乳液小胶束所占的体积过大，造成细胞密度低，不易成瘤；也不会因细胞所占的体积过大，不能维持种瘤形态且不利于种瘤贴附于气囊壁。

实施例4：小鼠气囊膀胱癌模型的构建

本实施例提供了一种小鼠气囊膀胱癌模型的构建方法，具体方法如下：

1、将MB49膀胱癌细胞接种于含10％灭活小牛血清的DMEM培养液中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度下培养，每1-2d换液1次，培养至对数生长期；取对数生长期的MB49细胞若干瓶，0.25％胰蛋白酶消化细胞约5min，弃去消化液，加入少量的完全培养基，将细胞从瓶壁吹打下来，混匀离心800rpm，5min，弃上清；按照膀胱癌细与生物微乳液小胶束的体积比1:1加入生物微乳液小胶束在冰上混匀，置于冰盒中待用，以防止生物微乳液小胶束凝固，命名为实验组。

2、准备注射器：将1mL注射器针头连接于5mL注射器备用。(本实施例以1mL注射器针头为例，其他类型针头，只要是孔径在26G-30G范围内，均能够保证不破坏气囊，不至于使气囊上留下的针孔漏气，避免针孔过大导致气囊跑气，进而影响实验结果，本发明不一一列举)。

3、步骤：

皮下气囊的构建：取5周龄C57BL/6小鼠，麻醉后小将鼠背部中部将约2cm×2cm面积的鼠毛剔除干净。将注射器针头取下，将针筒与0.22μm滤器连接，超净台内抽取适当体积无菌空气，而后取下滤器，连接针头待用。在小鼠背部注入无菌空气3mL，以后每隔一天利用胰岛素针补充注射无菌空气1mL，5天后气囊构建完毕。(空气要保证无菌，因为根据文献报道，感染造成的炎症会影响肿瘤生长，使肿瘤相关的生化指标产生波动，从而导致实验结果不准确；本实施例以C57BL/6小鼠为例，也可以选用其他类型的小鼠,如BALB/c裸小鼠,经试验可以成瘤，可以获得与C57BL/6小鼠相同的技术效果；本实施例选择5周龄的小鼠，5周的小鼠自身免疫力弱，有利于成瘤，小于5周龄的小鼠可能会发生无法负荷肿瘤致使小鼠死亡的情况。)

小鼠气囊膀胱癌模型的构建：将上述细胞悬液接种于气囊中，接种位置需处于小鼠身体最低点，并在接种结束后，继续保持体位2min至生物微乳液小胶束凝固，以防止肿瘤移位，之后每隔一天补充注射无菌空气1mL，5天后通过观察和手触证实肿瘤已种植成功，获得小鼠气囊膀胱癌模型。图4为构建小鼠气囊膀胱癌模型的流程图。图2为小鼠气囊膀胱癌模型构建完毕后的外观；图3为将小鼠气囊膀胱癌模型构建完成后，将气囊剥离的外观；可见肿瘤成型。上述方法构建的小鼠气囊膀胱癌模型命名为实验组1。

对照实验1：以传统的原位癌模型作为对照实验1，具体构建方法如下：

1、膀胱癌细胞悬液的制备：将MB49膀胱癌细胞接种于含10％灭活小牛血清的DMEM培养液中，在37℃、5％CO₂、饱和湿度下培养，每1-2d换液1次。取对数生长期的MB49细胞若干瓶，0.25％胰蛋白酶消化细胞约5min，弃去消化液，加入少量的完全培养基，将细胞从瓶壁吹打下来，混匀离心800rpm，5min，加入培养基制成细胞悬液待用。

2、小鼠尿道插管：取5周龄C57BL/6小鼠，麻醉后，尿道口周围消毒，24G静脉留置针针头以无菌石蜡油棉球消毒，将针尖退出套管2-3mm，缓慢插入小鼠尿.，

3、构建原位癌模型:抽出尿液，注入0.1ml细胞悬液，留置套管2h，而后拔出套管，将小鼠放回鼠笼，5天观察膀胱成瘤情况。

将实验组构建的小鼠气囊膀胱癌模型的和对照实验构建的小鼠原位癌膀胱癌模型的模型构建成功率、死亡率统计，结果如表3所示。

表3为模型构建成功率、死亡率和肿瘤大小结果

模型名称成瘤率死亡率实验组1(1:1)100％0％对照实验183％20％

通过对比实验组1和对照实验1的实验数据可知：传统的原位癌模型成瘤率在83％,死亡率高达20％，而利用本发明的气囊膀胱癌模型(实验组1)，在动物皮下构建气囊模拟膀胱，不仅能够减少灌注治疗过程中由于灌注造成膀胱破裂而产生导致死亡的情况发生，有效降低动物死亡率，死亡率低达0％，并且此种方式成瘤率高，成瘤率高达100％。

综上所述，本实施方法构建小鼠膀胱癌模型成功率高、高达100％，死亡率低，低达0％、操作简单、可用于药物灌注治疗的小鼠胱癌模型构建方法。

实施例5：小鼠气囊膀胱癌模型的评估药物副作用的应用

准备吉西他滨溶液：配制15mg/mL吉西他滨溶液待用。

向实施例2中构建的小鼠气囊膀胱癌模型中注入上述吉西他滨溶液1mL，48小时后剥离皮肤可见气囊炎性反应明显，有显著的红肿及渗出，说明该模型可以用于反应化疗药物灌注治疗的副作用。

本实施例中吉西他滨是膀胱癌常用化疗药，本实验的目的是说明实施例2所构建的模型可以用于评价化疗药的副作用，正如上述实施例所述，可见气囊明显炎症反应，由此可见该模型可以用于反应化疗药物灌注治疗的副作用。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。