一株具有抗真菌活性的北极假单胞菌

摘要

本发明提供一株具有抗真菌活性的北极假单胞菌，其保藏编号为CGMCC No.14505。本发明所筛选的假单胞菌在制备植物病原抑制剂制品中的应用。本发明提供的北极假单胞菌Pseudoalteromonas sp.BJ01，其抑菌实验表明，杀菌制剂对多种植物病原具有抑制作用，在低温条件10‑15℃下对大棚黄瓜灰霉病的防治效果高达66.7％。本发明中的菌株在植物病害的无公害生物防治中具有潜在的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于微生物筛选技术领域，具体涉及一株具有抗真菌活性的北极假单胞菌。

背景技术

由真菌引起的农作物病害已成为威胁全球粮食安全的重要问题。农作物种植种类和数量的增加、农作物全球化贸易和运输、全球气候和环境的变化、以及病原真菌对新的生态系统的适应，都导致了真菌病害日益严重。目前，人工合成的杀菌剂仍是防治农作物真菌病害主要的和最为有效的手段，但同时也造成对人体和环境的危害。微生物防治农作物真菌病害具有安全、高效、对环境友好等优势，已成为国内外广泛关注的化学杀菌剂的替代途径。为了获得新颖、高效的活性菌株及其代谢产物，国内外学者也将菌株筛选的范围从中温、低盐等常规环境扩展到一些极端环境。北极具有低温、高盐和强辐射的地理环境特征,微生物在长期的适应过程中,形成了独特的分子生物学机制和生理生化特性,具有产生新型的活性物质和先导化合物的潜力。

近年来，随着大棚蔬菜面积扩大，并且重茬黄瓜棚增多，黄瓜灰霉病发病日趋来重。特别是在冬暖棚低温高湿、通风条件差的情况下，一旦发病，不能及时防治，就会造成严重损失。针对灰霉病的发病特点，本发明从北极沉积物中筛选出具有高抑菌活性的菌株，并对其抑菌活性特别是在低温环境下对黄瓜灰霉病的抑制效果进行了研究，以期为黄瓜灰霉病的防治提供新型、绿色、环保的生物制剂。

发明内容

本发明提供一株具有抗真菌活性的北极假单胞菌，能应用于农药领域。

本发明所提供的交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)，于2017年8月8日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14505；

本发明所筛选的假单胞菌在制备植物病原抑制剂制品中的应用；

所述的植物病原，例如辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici Leonian)或番茄叶霉病菌(Fulvia fulva(Cooke))；

本发明还提供一种发酵菌液，是使用筛选的假单胞菌进行发酵制备的；

所述的发酵菌液，是将筛选的假单胞菌先用种子培养基进行培养获得种子液，再将种子液加入到发酵培养基中发酵获得目的菌液；

其中所述的种子培养基，其一种具体组成如下：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，陈海水150ml；水850ml；pH值7.2；

所述的发酵培养基，其一种具体组成如下：蛋白胨0.5％，酵母粉0.1％，陈海水150ml；水850ml；pH值7.2；

所述的发酵菌液，其中假单胞菌菌株数量可达10⁹cell/ml。

本发明再一个方面提供发酵菌液制备抗真菌制品的应用。

本发明的优点在于：

1.首次以北极假单胞菌Pseudoalteromonas sp.BJ01作为生防菌抑制植物病原，建立菌株的发酵生产工艺。

2.提供了北极假单胞菌Pseudoalteromonas sp.BJ01的潜在用途：抑菌实验表明，杀菌制剂对多种植物病原具有抑制作用，在低温条件10-15℃下对大棚黄瓜灰霉病的防治效果高达66.7％。本发明中的菌株在植物病害的无公害生物防治中具有潜在的应用前景。

附图说明

图1：BJ01菌株的筛选图。

图2：Pseudoalteromonas sp.BJ01对病原真菌生长的抑制作用图；其中1.多隔链格孢菌(Alternaria alternata(Fr.)Keissl.)，2.拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides Sherb.)，3.葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea(Moug.ex Fr.)Ces.et de Not.)，4.黄瓜专化型尖镰孢(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)，5.细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)，6.番茄专化型尖镰孢(Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做详细的说明。

实施例1.菌株的筛选

北极假单胞菌Pseudoalteromonas sp.BJ01源自中国第6次北极科学考察采集的海泥样品，采用佐贝尔2216E培养基进行划线筛选、纯化，并进行16S rDNA种属鉴定。纯化后的菌株分别接入装有2216E液体培养基的三角瓶，25℃、150rpm振荡培养24h，做菌悬液用。

抑菌菌株的筛选，选择尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)等常见植物病原菌为指示菌，植物病原真菌接种于PDA固体培养基，25℃培养48h后，取一块菌丝体，加至含无菌水的试管中充分振荡，用两层灭菌纱布过滤菌丝后，稀释获得植物病原真菌孢子悬浮液(10⁵cell/mL)。采用平板扩散法测定菌株抑菌活性。

采用平板扩散法测定菌株抑菌活性。将PDA培养基融化后冷却至45℃，以1:100(v/v)倒入各种植物病原真菌的孢子悬浮液，混匀后倾注到平皿中，每皿约20mL。冷却后，用打孔器呈十字形打孔(直径0.7cm)；再用冷却至适当温度的PDA培养基封底，每孔加入50μL菌株发酵液，22℃培养48h后，测量抑菌圈大小。结果表明假单胞菌Pseudoalteromonassp.BJ01菌株对辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici Leonian)和番茄叶霉病菌(Fulviafulva(Cooke))有较强的抑菌作用；对黄瓜专化型尖镰孢(Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum)、番茄专化型尖镰孢(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)和细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)的抑菌生长率均在50％及以上(表1，图2)。

表1假单胞菌Pseudoalteromonas sp.BJ01菌株对植物病原真菌的抑菌范围

实施例4.假单胞菌Pseudoalteromonas sp.BJ01菌株的生化特征

经过多次划线分离，获得纯化的BJ01(见图1)，经鉴定为假单胞菌属Pseudoalteromonas sp.。该菌为革兰氏阴性，白色、圆润、潮湿的菌落。然后采用API 20NE鉴定条对代表菌株进行生理生化测定，培养温度设为10℃，判读结果时间为48h，结果表明，该菌能够利用多种底物(见表2)。

表2北极菌株BJ01API生理生化测定结果

NO3TRPGLUADHUREESCGELPNPGGLUARAMNEMANNAGMALGNTCAPADIMLTCITPACOX+----+-++-++--++-++-+

实施例4.假单胞菌Pseudoalteromonas sp.BJ01菌株的在不同温度下的生防效果

假单胞菌Pseudoalteromonas sp.BJ01菌株的发酵液，适当添加植物生长必需的营养元素后，制成杀菌剂，4℃保存备用。杀菌制剂为淡黄色液体，活菌数量达10⁹cell/ml。

假单胞菌Pseudoalteromonas sp.BJ01发酵液(1:1稀释)用喷雾器喷施药，将药液均匀喷施于染病黄瓜全株，将喷药后的黄瓜分别置于10℃、20℃和30℃的光照培养箱中，试验共喷药2次，相隔7d。“霉止”50ml+“大蒜油”15-20ml兑水15公斤倍液稀释为阳性对照，以清水为空白对照，每处理重复三次。

表3 Pseudoalteromonas sp.BJ01发酵液不同温度下对黄瓜灰霉病防治效果

防治结果表明(表3)，采用菌株1:1稀释的发酵液喷施染病黄瓜，在不同温度继续生长11d后，黄瓜灰霉病的病情指数显著低于清水对照组，其防治效果分别为67.2％、63.2％和62.9％。该结果表明，BJ01发酵液在低温环境下具有较好的防治黄瓜灰霉病的效果，鉴于黄瓜灰霉病易发于冬季低温高湿环境，因而该菌株在防治黄瓜灰霉病领域，具有潜在的应用价值。