一种基于G‑四联体核酸适配体荧光探针检测牛奶中环丙氨嗪的方法

摘要

本发明公开了一种基于G‑四联体核酸适配体荧光探针检测牛奶中环丙氨嗪的方法。当检测体系中没有环丙氨嗪时，修饰在适配体上的荧光素FAM会在520nm处释放出荧光；当体系中加入环丙氨嗪后，环丙氨嗪和功能核酸上的胸腺嘧啶结合，促进功能核酸形成G‑四联体结构，抑制了520nm处的荧光释放，基于释放出的荧光信号与环丙氨嗪浓度呈反比，通过测定荧光信号可实现牛奶中环丙氨嗪的定量检测。本方法可用于牛奶中环丙氨嗪的检测，检测灵敏度高，最低检测限0.68ppb，选择性好，操作简便，前处理简单，不需要大型仪器。

说明书

技术领域

本发明属于环丙氨嗪检测技术领域，特别涉及一种基于G-四联体核酸适配体荧光探针检测牛奶中环丙氨嗪的方法。

背景技术

环丙氨嗪(Cyromazine，Cyr)的化学名为2-环丙胺基-4，6-二氨基三嗪，与阿特拉津、西玛津、莠灭津、扑灭津等同属三嗪类或均三氮苯化合物，是一种高效抑制昆虫生长剂、杀寄生虫类杀虫剂，在畜禽养殖过程中作为饲料添加剂使用。研究表明环丙氨嗪进入动物体内绝大部分以原药或代谢物形式通过奶或者粪尿排泄，随后再经由畜禽粪便暴露在土壤和水环境中。土壤或水环境中的环丙氨嗪通过环境转归再次进入食物链，对不同营养级生物和人体的健康造成潜在隐患。环丙氨嗪在动物和植物体内经脱烷基化作用代谢为三聚氰胺(Melamine，Mel)，而三聚氰胺的主要代谢产物为三聚氰酸(Cyanuric acid，CA)、三聚氰酸一酰胺(Ammelide，Amd)和三聚氰酸二酰胺(Ammeline，Amn)。长期涉入三聚氰胺会导致膀胱结石，膀胱癌的发生率明显提高。

对牛奶中环丙氨嗪及其代谢产物的快速检测，可以有效避免有毒有害物质进入人体。环丙氨嗪及其代谢物三聚氰胺是一组分子量小、且极性强的化合物，要想将环丙氨嗪及其相关代谢物从实际样品中提取出来非常困难。美国EPA严格规定了环丙氨嗪必须作为饲料添加剂且只能放置在厩舍喂饲槽中使用，但仍有通喷洒用于饲养场所、堆肥、垃圾等处的灭蝇。环丙氨嗪经动物口服后绝大部分以原药或代谢产物三聚氰胺形式经动物尿粪排泄，在动物体内残留很少。美国EPA和PRC制定了环丙氨嗪在一系列动植物食品中的最高残留标准，其中牛奶为0.05mg/kg。

根据环丙氨嗪及其代谢产物三聚氰胺在食品中的限量标准要求，目前常用于环丙氨嗪及其代谢产物残留检测的方法有容量分析法；色谱分析方法，包括高效液相色谱法；免疫化学分析法；光学分析法等。在GB 29704-2013中采用超高效液相色谱-串联质谱法来测定动物性食品中环丙氨嗪的残留。随着环丙氨嗪类兽药残留检测列入生乳收购及乳制品产品出厂必检项目，而由于上述检测方法和条件的限制，面对庞大的检测数量会导致成本巨大且工作量重，难以满足现场快速检测的需求，这就在客观上要求改进现有的检测方法，开发出高通量、快速、高灵敏的环丙氨嗪检测方法，用于日常监控。

核酸适配体是通过指数富集配体系统体外进化(SELEX)技术，从大量寡聚核苷酸库中筛选出对靶物质具有高特异性和高结核性的核酸片段。但与蛋白质类抗体和生物酶相比，核酸适配体具有更高的亲和力、稳定性和特异性，且易于标记设计出传感器，已经用于核酸、蛋白、无机金属离子及病毒颗粒和细胞的检测。尽管胸腺嘧啶可以与环丙氨嗪的代谢产物三聚氰胺通过氢键结合已有报道，但可与环丙氨嗪特异性结合形成G-四联体的适配体还未有筛选或合成出来，并且基于此使用荧光分光光度计用于检测也未见报道。

发明内容

本发明的目的是利用不同浓度的环丙氨嗪可以不同程度的淬灭检测液中荧光素的荧光强度的现象，提供一种灵敏度高、选择性好、成本低的牛奶中环丙氨嗪的检测方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种利用荧光素FAM修饰的可形成G-四联体的核酸适配体检测液检测牛奶中环丙氨嗪的方法。荧光素FAM修饰在核酸适配体的5’端，形成稳定检测液，在激发光波长为480nm时，会在520nm处释放出稳定的荧光。

本发明的原理是：根据环丙氨嗪的结构特征，结合环丙氨嗪可以和胸腺嘧啶通过氢键相结合的性质，设计合成以胸腺嘧啶为主，富含鸟嘌呤的环丙氨嗪高特异性适配体并在5’端修饰荧光素FAM。环丙氨嗪的存在会使适配体空间结构改变，形成稳定的G-四联体结构。由于适配体空间结构的改变，导致上面连接的荧光基团与环丙氨嗪的距离变小，从而淬灭荧光。通过环丙氨嗪的浓度和荧光淬灭率的关系，即淬灭率F₀/F的值与一定范围内环丙氨嗪的浓度呈线性关系，所以通过分析荧光淬灭率F₀/F的变化，可以实现牛奶中环丙氨嗪的定量检测。

本发明的技术方案具体介绍如下。

本发明提供一种基于G-四联体核酸适配体荧光探针检测牛奶中环丙氨嗪的方法，具体步骤如下：

(1)将若干相同浓度的检测液和若干经前处理的添加了不同浓度环丙氨嗪标准液的牛奶样品在24～26℃的温度下，混合2min后，得到环丙氨嗪含量维持在0-10ppb之间的标准溶液；其中：所述检测液由Tris-乙酸缓冲液将FAM修饰的核酸适配体稀释得到，所述FAM修饰的核酸适配体为5’-FAM-GGTTGGTTGGTTGGTTTT-3；

(2)取上述制备的标准溶液，置于比色皿中，设置激发波长为480nm后，用荧光分光光度计测定其在520nm处的荧光强度；检测体系中存在环丙氨嗪测得的荧光强度记作F，不存在环丙氨嗪测得的荧光强度记作F₀，计算淬灭率(F₀-F)/F₀；

(3)将不同浓度的环丙氨嗪与对应的淬灭率(F₀-F)/F₀作图，绘制标准曲线；

(4)将待检测牛奶样品前处理后，与步骤(1)相同浓度的检测液混合，充分混匀后反应1～3min，用荧光分光光度计在480nm的激发波长下测试混合液在520nm处的荧光强度，再计算其淬灭率(F₀-F)/F₀；

(5)根据待检测牛奶样品的淬灭率(F₀-F)/F₀，查标准曲线，求得待检测牛奶样品中环丙氨嗪含量。

本发明中，检测液的浓度为20～30nmol/L。

本发明中，牛奶样品的前处理的步骤如下：牛奶样品的前处理的步骤如下：先将4～6mL的1wt％醋酸和1.0mL的牛奶样品混合，静置5分钟；然后8000～12000r/min离心8～12分钟，取上清后，用1.5～2.5mol/L NaOH调节pH到8.0。

和现有技术相比，本发明的有益效果在于：本方法提供的检测手段灵敏度高选择性好，最低检测限0.68ppb，操作简便，前处理简单，不需要大型仪器，可用于牛奶中环丙氨嗪的检测。

附图说明

图1是基于G-四联体核酸适配体荧光探针快速检测环丙氨嗪的原理示意图。

图2是检测体系的圆二色谱图。

图3是温度对检测体系的影响图示。

图4是反应时间和K⁺对检测体系的影响图示。

图5是体系选择性实验结果。

图6是环丙氨嗪浓度与荧光淬灭率(F₀-F)/F₀的关系。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细介绍。

图1是基于G-四联体核酸适配体荧光探针快速检测环丙氨嗪的原理示意图。当检测体系中没有环丙氨嗪时，修饰在适配体上的荧光素FAM会在520nm处释放出荧光；当体系中加入环丙氨嗪后，环丙氨嗪和功能核酸上的胸腺嘧啶结合，促进功能核酸形成G-四联体结构，抑制了520nm处的荧光释放，基于释放出的荧光信号与环丙氨嗪浓度呈反比，通过测定荧光信号可实现牛奶中环丙氨嗪的定量检测。

实施例1

(1)体系圆二色谱检测：准备两个离心管，分别加入核酸适配体，核酸适配体混合环丙氨嗪，再通过圆二色谱在220nm～320nm波长上进行扫描，证明G-四联体结构的形成。图2是检测体系的圆二色谱图。

(2)温度对检测体系的影响：配制环丙氨嗪最终浓度分别为0ppb,6ppb,15ppb,40ppb,100ppb，200ppb的环丙氨嗪检测液混合体系，设置激发波长为480nm后用荧光分光光度计分别在25℃,35℃,45℃和55℃的条件下测定其在520nm处的荧光强度。检测体系中存在环丙氨嗪测得的荧光强度记作F，不存在环丙氨嗪测得的荧光强度记作F₀，计算F₀/F。图3是温度对检测体系的影响图示，由图所示温度在25℃最佳。

(3)K⁺对检测体系的影响：分别配制0、10、50、100ppb>+溶液，与25nM的核酸适配体混合，与检测液反应时间在0～360秒的过程中，设置激发波长为480nm用荧光分光光度计测定其在520nm处的荧光强度。检测体系中存在K⁺测得的荧光强度记作F，不存在K⁺测得的荧光强度记作F₀，计算淬灭率(F₀-F)/F₀。图4所示，K⁺对检测体系的影响图，K⁺浓度的增大并不影响体系的荧光淬灭率。

(4)反应时间对检测体系的影响：分别配制0、10ppb、50ppb、100ppb的环丙氨嗪溶液，与检测液反应时间在0～360秒的过程中，设置激发波长为480nm用荧光分光光度计测定其在520nm处的荧光强度。检测体系中存在环丙氨嗪测得的荧光强度记作F，不存在环丙氨嗪测得的荧光强度记作F₀，计算淬灭率(F₀-F)/F₀。图4所示为反应时间和对检测体系的影响图，由图可知体系最佳反应时间在2分钟以后。

(5)检测体系的选择性测试：在牛奶样品中分别添加15ppb环丙氨嗪，以及50ppb的牛奶中常见残留污染物土霉素、甲砜霉素、绿霉素、双甲脒、氯羟吡啶、阿维菌素、左旋咪唑、土霉素，设置激发波长为480nm用荧光分光光度计测定其分别在520nm处的荧光强度。检测体系中存在兽药测得的荧光强度记作F，空白测得的荧光强度记作F₀，计算淬灭率(F₀-F)/F₀。图5是检测体系选择性测定结果图，由图可知本检测体系有较好的选择性。

实施例2

(1)制备检测液：在序列为GGTTGGTTGGTTGGTTTT的ssDNA的5’端连接荧光素FAM，得到最终的环丙氨嗪核酸适配体5’-FAM-GGTTGGTTGGTTGGTTTT-3’。用Tris-乙酸缓冲液(10mM,pH 8.0)将适配体含量稀释到浓度为25nM，得到检测液。

(2)牛奶样品的前处理：在10mL的离心管中，添加5mL 1％醋酸和1.0mL的牛奶样品，静置5分钟。然后10000r离心10分钟，取上清后，用2.0mol/L NaOH调节pH到8.0。

(3)制备已知环丙氨嗪浓度的检测体系：取10支包含检测液的离心管，分别加入前处理后的添加了不同浓度环丙氨嗪标准液的牛奶样品，使得整个检测体系中环丙氨嗪含量维持在0-10ppb，在25℃反应2min后测定。

(4)取制备的标准溶液，置于比色皿中，设置激发波长为480nm后用荧光分光光度计测定其在520nm处的荧光强度。检测体系中存在环丙氨嗪测得的荧光强度记作F，不存在环丙氨嗪测得的荧光强度记作F₀，计算淬灭率(F₀-F)/F₀。

(5)以不同浓度的环丙氨嗪与对应的淬灭率(F₀-F)/F₀作图，绘制标准曲线。图6是环丙氨嗪浓度与荧光淬灭率(F₀-F)/F₀的标准曲线图，其中环丙氨嗪浓度分别为0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,15,20,40,60,80,100and>

(6)制备样品待测体系：前处理后，与检测液混合，充分混匀后反应2min，按步骤(4)测定其淬灭率(F₀-F)/F₀。

(7)根据样品所得淬灭率(F₀-F)/F₀，查标准曲线，可以求得样品中环丙氨嗪含量。

(8)验证：用本发明方法测定四份含环丙氨嗪浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0ppm的牛奶，得到的回收率分别为120％、95％、106％、106％，证明了本方法的可靠性。

(9)本发明方法测定牛奶中环丙氨嗪的最低检测限为0.68ppb。