一种快速分析甲壳动物血淋巴细胞类群和数量的方法及应用

摘要

本发明公开了一种用于快速检测多种常见甲壳动物血淋巴细胞种类和数量的方法。其原理为凡纳滨对虾、克氏原螯虾以及中华绒螯蟹等甲壳动物血淋巴细胞内的颗粒结构可以作为分类参考，利用具有图像辅助功能的多维全景分析仪，以样点所在分区和辅助图像为依据，可甄别不同类群血淋巴细胞并自动完成统计分析。本方法的特点为:不用染色，避免常规染色及显微镜观察等述诸多人工环节的影响；利用高灵敏度检测器的自动化信号分析，重复性好；多维全景检测仪具有高通量检测能力，数万细胞样点的结果可靠性也远超过人工计数；微量检测所用试剂耗材很少，成本低。本方法不但可用于科学分析、日常监测，还可为分类收集血淋巴细胞提供技术支持，有巨大应用价值。

说明书

本专利申请由天津师范大学生命科学学院/天津市动植物抗性重点实验室完成，得到国家自然科学基金（31472299），天津市应用基础与前沿技术研究计划（15JCZDJC33800），天津市水产生态及养殖重点实验室开放基金(TJAE2015005) ，“十二五”农村领域国家科技计划课题（2011BAD13B04）的资助。

技术领域

本发明属于检测技术领域，以胞内颗粒特征为基础，结合多维全景检测仪的图像辅助分析功能对凡纳滨对虾、克氏原螯虾及中华绒螯蟹等常见甲壳动物的血淋巴细胞进行准确分类和比例分析，建立一种适用于依据胞内颗粒差异进行分类的高效血象检测方法。

背景技术

甲壳动物血淋巴的功能与脊椎动物的血液类似，其中的各类细胞承担着重要的免疫职责，因此对各类血淋巴细胞进行准确分类、统计是开展科学研究及客观评价健康状况的重要支撑。人类等高等动物的血细胞研究技术十分成熟，通过各种单克隆抗体不但能够对每类细胞进行辨识区分，还能精确分析细胞所处的不同分化时期以及生理状态，因此，各种特异性抗体的生产是血细胞研究的重要保障。反观甲壳动物，专用抗体的缺乏成了制约血淋巴研究的瓶颈。

单克隆抗体的淘选有赖于足量纯化的抗原性物质的制备，就甲壳动物血淋巴而言，需要辨识和分离出来足量的各类细胞。从19世纪开始，国内外学者就利用光镜染色、电镜切片、组织化学等技术对虾蟹等甲壳动物的血淋巴进行分类研究。但由于都是基于不同研究者的人工观察和判定，因此所描述的分类特征和判定依据不尽相同，迄今对甲壳动物血淋巴细胞的分类尚存在争议。Cornick等（1978）根据细胞内所含颗粒的大小、与染料的亲和性以及折光性，将鳌龙虾血细胞划分为前透明细胞、透明细胞、嗜伊红颗粒细胞和嫌色细胞四类。Hose等（1990）对美洲鳌龙虾、短沟龙虾和大弯吻蟹的血细胞形态进行细胞化学性质研究，并结合电镜和光镜结果，将甲壳类血细胞分为透明细胞、大颗粒细胞和小颗粒细胞。叶燕玲等（1993）和于建平（1993）分别对中国对虾和日本对虾血淋巴细胞进行了分类研究，并将其分为透明（或无颗粒）细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞。陈平等（1998）则通过电镜观察将中国对虾、日本对虾、长毛对虾和草虾的血淋巴细胞分为四类：透明细胞、小颗粒细胞、大颗粒细胞和“浆样细胞”。战文斌等（2001）收集中国对虾混合血淋巴细胞免疫小鼠后筛选到三株单克隆抗体，并利用自制单克隆抗体对中国对虾的血细胞分类进行了初步尝试，结果也仅估计透明细胞占比约60%，小颗粒细胞占比约30%，而且未能给出其它种类细胞类型和所占比例的统计。孙敬锋等（2008）尝试用流式细胞仪对三种虾类血细胞进行分类，但只能区分出三类细胞，而且类群边界不甚清晰。有鉴于此，冼建安等（2015）不对血淋巴细胞加以分类，而是以流式细胞仪直接测量混合血淋巴细胞总数，并据此判断健康状况。由此可见，虽然在甲壳动物血淋巴细胞分类方面有很多前期研究，但都因没有适合的仪器和普遍适用的方法而进展缓慢，所以迫切需要一种新的快速、准确、重复性好的自动化分类统计方法。

具有图像辅助功能的多维全景检测仪可用于分析液流中的各种颗粒物质。对于细胞而言，可以把细胞大小、颗粒度等多种物理特征的测量结果与同时采集到的各个通道的显微图像结合，从新的视角和更多的参考维度对各类细胞之间的差异加以区分，具有“眼见为实”的巨大优势。常规流式细胞仪利用标记抗体等技术手段可以快速测量悬浮在液体中的分散细胞的一系列生物物理、生物化学特征参量，并可以通过预设的参量范围把特定类群的细胞从中分选出来。但是，由于缺乏图像参考，对于没有特殊标记的筛选物，只能通过上样-回收-分析的流程反复检测。在这一过程中，细胞不能重复使用，而且由于其缺乏对单个细胞的回收分析能力，而边界细胞和低丰度细胞的数量往往都很少，所以需要大量样品反复尝试。而这种试错操作却往往因为费时费力，且结果的重复性欠佳而被放弃。由于上述诸多因素的局限，利用常规流式细胞仪开展甲壳动物血淋巴细胞分析的研究一直处于尝试阶段，迄今未见有通用的方法及商业化的辅助检测产品报道。多维全景检测仪，把流式的高通量能力与各种新型的检测模式相结合，创造了一种新颖的分析平台，尤其是能够同步储存每个样点在每个检测通道的图像，使得边界细胞的划分变得简便易行，只需一次上样，即可随时定点查看每个细胞的各项检测信息，借助图像辨识结果调整不同细胞类群的分析参数和范围。“眼见为实”让结果更为精准，基于高灵敏检测器测得的数万样点的高通量统计分析结果也较以往缺乏统一评价标准的分类和有限人工计数更为可靠，为今后形成统一的规范和进一步开发商业产品提供了基础性的技术支撑。

本发明针对凡纳滨对虾、克氏原螯虾以及中华绒螯蟹等常见甲壳动物血淋巴细胞内具有明显颗粒状亚细胞结构的特征，结合全景检测仪图像辅助分析功能，建立了一种快速、准确、高通量的血淋巴细胞分类计数方法。微创采集10-100微升血淋巴，不用染色，即可把4类血淋巴细胞完全分开，且分群边界十分清晰（参见附图1）。本发明的分析结果是基于高灵敏度检测器对数万样点的准确测量，而且有原始图像佐证，因此精准、可靠；另外，本方法操作及其简便，借助高通量的进样模块，耗时很短，从样品采集到分析完成不超过一小时，如果连续批量作业，每小时可以检测15-30个样本。本发明以应用为目的，因此特别注重保证测量结果准确性的前提下，节约成本；本方法所用的试剂只有柠檬酸钠抗凝剂和PBS缓冲液等常规试剂耗材，同时由于是微创检测，因此用量也很少，每个样本检测成本不足1元。

综上所述，本发明建立了一种操作简便，速度快，可靠性高，成本低的血淋巴细胞分类统计方法，可以对各类以胞内颗粒特征为分类依据的血淋巴细胞进行自动化分析。能够用于多种甲壳动物血象分析、养殖监测以及免疫学研究等领域；也可以作为技术支撑，服务于批量回收单一种类的细胞用于单克隆抗体的制备、筛选以及相关检测产品的研发，因此拥有广阔的市场前景。

发明内容

针对缺乏特异性抗体辅助分类的现状，本发明的方法利用多维全景分析仪检测细胞大小、颗粒度等物理特征的差异，并根据同步采集图像的佐证，对血淋巴细胞进行分类。

为此，本发明公开了一种快速检测甲壳动物血淋巴细胞种类和数量的方法， 其特征在于以胞质颗粒的多少和复杂度差异为依据，结合多维全景分析仪的图像辅助功能，区分不同血淋巴细胞类群，对划分的各个类群细胞进行准确鉴定分析并自动完成分类计数和统计分析；按如下的步骤进行：

（1）微创抽取10-1000微升血淋巴，用4%多聚甲醛室温固定5分钟，PBS重悬细胞，用70微米细胞筛过滤去除黏连细胞；

（2）取20-200微升经上述处理的细胞样品，中流速连续采集30000个样点，以Intensity和Area为横、纵坐标作图即可把各类血淋巴细胞按照颗粒分布和复杂度区分为4个类群；所述的甲壳动物指的是：凡纳滨对虾、克氏原螯虾及中华绒螯蟹等。

本发明优选的方法如下：

（1）样品制备：根据采血量需要，使用微量进样器或一次性注射器吸取抗凝剂，从待测动物步足基部的血窦处抽取10-1000微升血淋巴，混匀后迅速移入固定液，室温固定5分钟；所述抗凝剂：0.14M NaCl、0.1M 葡萄糖、10mM EDTA、30mM 柠檬酸钠、26mM 柠檬酸；所述固定液：含4%的多聚甲醛的PBS溶液；

（2）检测和分析：前述固定的细胞经70微米细胞筛过滤后上机，中速收集30000个样点数据，将单细胞样点测量数据作图，一步即可分出无颗粒，小颗粒，中颗粒以及大颗粒4种不同的细胞类群。

本发明更进一步公开了快速检测甲壳动物血淋巴细胞种类和数量的方法在检测甲壳动物健康状况方面的应用。特别是在其它以胞内颗粒为辨识依据的甲壳动物血淋巴细胞分群及筛选方面的应用。实验结果证明：对于监测养殖的凡纳滨对虾、克氏原螯虾以及中华绒螯蟹等甲壳动物健康状况方面有很好的指导意义。通过特定类群血淋巴细胞比例的变化可以获得养殖对象健康水平的客观评价。

本发明更加详细的描述如下：

1 样品制备

（1）本发明所用试剂如下

抗凝剂：0.14M NaCl、0.1M 葡萄糖、10mM EDTA、30mM 柠檬酸钠、26mM 柠檬酸

固定液：含4%的多聚甲醛的PBS缓冲液

（2）采血方法

样品制备：根据采血量需要，用微量进样器或一次性注射器吸取适量抗凝剂，按体重0.1-1%，从克氏原螯虾步足基部的血窦处抽取血淋巴，混匀后迅速移入固定液，室温固定5分钟后重悬于PBS中；

2 检测和分析

前述处理的细胞经70微米细胞筛过滤去除黏连细胞后上机，收集3万个样点数据，将单细胞样点测量数据以Intensity和Area为横、纵坐标作图，即可分出无颗粒R1，小颗粒R2，中颗粒R3以及大颗粒R4共计4种不同的细胞类群。R1：R2：R3：R4，其比例为79.2%：8.7%：8.0%：1.7%。（图1）

各类细胞判定标准如下：

依据图1所示的显著差异，结合图2-5的图像辅助，将全部血淋巴细胞清晰地划分为4个类群。

R1细胞群体没有明显的颗粒信号被检测到，因此属于透明细胞。R2和R3群体在颗粒总量和复杂程度上都明显低于R4群体，但具有明确的分界，其中R2类群胞内含有复杂度较低的颗粒，属于小颗粒细胞；R3表现为颗粒少但复杂度高，属于中颗粒细胞。R4类群散射面积大强度高，从明场亦可见胞内充满不透明颗粒物，符合目前对甲壳动物大颗粒细胞的描述特征，因此归属于大颗粒细胞（图1-5）。

本发明公开的适用于血淋巴细胞快速分类计数的方法所具有的积极效果在于：

（1）本发明依据甲壳动物血淋巴细胞内含有颗粒性结构的特征，建立了一种利用多维全景分析仪甄别颗粒含量及复杂度的方法，不需染色，即可把血淋巴细胞清晰分为4个类群，避免了诸多人工环节的影响。

（2）本方法微创采血，采血部位为步足基部，对重要组织器官影响很小；采血量为体重的0.1-1%，不影响动物生长；

（3）本方法利用多维全景检测仪的高通量检测能力，1分钟即可获取数万细胞样点信息，确保了检测结果的可信、可靠；最简化的操作流程和高灵敏的测量模块是检测结果重现性好的重要支撑。

（4）本发明所用试剂耗材均为易于获取的常规市售商品，由于用量少，因此成本极低；

（5）本发明从应用出发，建立的简便、可靠的血细胞分类统计方法可以用于凡纳滨对虾、克氏原螯虾以及中华绒螯蟹等甲壳动物的血淋巴细胞分析。分析结果可用于科学研究，生产监测。

（6）本方法也可为今后分类收集血淋巴细胞用于各自类群单克隆抗体制备体重基础性的技术支持。

附图说明

图1克氏原螯虾血淋巴4个类群细胞的分布；

图2克氏原螯虾血淋巴中R1类群的无颗粒细胞；

图3克氏原螯虾血淋巴中R1类群的小颗粒细胞；

图4克氏原螯虾血淋巴中R1类群的中颗粒细胞；

图5克氏原螯虾血淋巴中R1类群的大颗粒细胞；

图6凡纳滨对虾血淋巴细胞分类分析；

图7 克氏原螯虾血淋巴细胞分类分析；

图8中华绒螯蟹血淋巴细胞分类分析。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行进一步说明，本发明以凡纳滨对虾、克氏原螯虾以及中华绒螯蟹等甲壳动物血淋巴细胞内特有的颗粒结构作为甄别特征，因此不但适用于前述的克氏原螯虾样本，同样适用于凡纳滨对虾，中华绒螯蟹等甲壳动物，因此这里所述的实施例方案不限本发明，本领域的专业人士可按照本发明的精神加以改进，所述的这些改进应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。特别加以说明的是，本发明使用的试剂材料均为常规产品，健康克氏原螯虾，凡纳滨对虾以及中华绒螯蟹均来源于天津市王顶堤水产批发市场。

实施例1

凡纳滨对虾血淋巴细胞应答急性失血刺激分析

（1）实验设计

本方法以虾蟹等甲壳动物胞内的颗粒结构作为血淋巴细胞分类参考，因此也适用于胞内含有颗粒的凡纳滨对虾血淋巴细胞分类分析。随机选取10尾体重25±3g的健康凡纳滨对虾，其中5只为对照组，5只为实验组。实验开始时刻按体重3%（v/w）抽取实验组各只动物血淋巴，建立急性大量失血模型。12小时后分别抽取对照组和实验组每只动物血淋巴样品，按照本发明所述方法检测各类血淋巴细胞的比例变化，分析各类血细胞生成速度以及在失血应激反应中的功能。

（2）样品制备

用含有抗凝剂的注射器小心抽取对照组和实验组每只动物血淋巴约50微升，迅速移入固定液混匀，室温固定5分钟

（3）样品检测

将前述固定的细胞样品经70μm细胞筛过滤去除黏连细胞，中流速收集3万个细胞样点数据及图像信息。

（4）数据分析

将采集的各个通道数据按照本发明所述方法进行分析，以散点图区分R1-R4各个类群细胞，以每个样点的明场及侧散图像作为佐证，根据随机软件计算即可获知各类细胞数量及比例分别为59.6%，12.3%，3.54%，24.2%（图6）。将失血刺激前后各类血淋巴细胞类群丰度与对照组比较，分析各类群细胞比例变化。细胞总量有所下降，表明机体尚未从大量失血中完全恢复；R1类群细胞比例上升，其原因可能与R2类群大幅下降有关，即R2类群恢复较慢，可能跟其胞内含有复杂的内膜系统，并承担重要生产功能有关，因此推测较其它类群细胞承担更多的免疫功能。R4类群细胞比例升高很大，可能与其跟其他细胞或者其幼稚状态转化有关，即R4可能系另外某个类群的成熟状态。上述结果提示各个类群在大量失血的应激过程中承担了不同的功能，其发育和分化能力亦有差异，深层次的调控机理还需要进一步的实验分析。

实施例2

克氏原螯虾血淋巴应答白斑杆状病毒（WSSV）感染分析

白斑杆状病毒系危害对虾养殖的主要病原，长期以来给对虾养殖带来巨大损失，克氏原螯虾亦为该病原的宿主，因此通过定量感染分析可以获知该病毒主要侵染的血淋巴细胞类群。

（1）实验设计

随机选取体重20±2g的健康克氏原螯虾10只，设置一个对照组和一个注射WSSV病毒的实验组，每组5只实验动物，1周后取样，分析血淋巴四类细胞的数量比例变化。

（2）样品制备

用含有抗凝剂的注射器小心抽取对照组和实验组每只动物血淋巴约100微升，迅速移入固定液混匀，室温固定5分钟

（3）上样品检测

将前述固定的细胞样品经70μm细胞筛过滤去除黏连细胞，中流速收集3万个细胞样点数据及图像信息。

（4）数据分析

将采集的各个通道数据按照本发明所述方法进行分析，以散点图区分R1-R4各个类群细胞，根据随机软件计算即可获知R1-R4类群类细胞比例依次为77.4%，9.0%，2.4%，11.1%（图7）。可见经WSSV感染后，血淋巴细胞总量有所降低，各类细胞比例变化明显，其中无颗粒细胞和小颗粒细胞变化幅度较小，推测与占比最大的无颗粒细胞可能参与携氧而非免疫功能有关，中颗粒细胞降幅最大，大颗粒细胞增幅最大，均为极显著差异，因此这两类细胞参与了WSSV感染的应答过程，但其增加与减少与抗病毒或被病毒破坏的相关性还需进一步的实验探讨。据前述结果推测，WSSV刺激后，无颗粒细胞核中粒细胞发生了转化，主要的转化方向为大颗粒细胞。无颗粒细胞作为克氏原螯虾血淋巴中最大的细胞类群，首先应当承担类似脊椎动物红细胞的携氧功能，但由于无脊椎动物血淋巴细胞分化程度不高，因此存在一种细胞多种功能的情况，也不能排除无颗粒细胞包含不止一个类群，亦包括是另外三类细胞的幼稚状态，在病毒攻击后发生应激反应，调动胞内组分，形成抗御病原的大颗粒细胞。

实施例3

中华绒螯蟹血象血淋巴细胞分类分析

通过批量随机测定健康中华绒螯蟹血淋巴细胞各个类群比例可以获得其正常范围，并用于养殖监测评估。

（1）实验设计

随机选取10只体重20±2g的中华绒螯蟹，外形完整，活力良好。

（2）用含有抗凝剂的注射器小心抽取对照组和实验组每只动物血淋巴约100微升，迅速移入固定液混匀，室温固定5分钟

（3）样品制备

用含有抗凝剂的注射器小心抽取对照组和实验组每只动物血淋巴约100微升，迅速移入固定液混匀，室温固定5分钟

（4）样品检测

将前述固定的细胞样品经70μm细胞筛过滤去除黏连细胞，中流速收集3万个细胞样点数据及图像信息。

（5）数据分析

将采集的各个通道数据按照本发明所述方法进行分析，以area对intensity作图，用散点图区分R1-R4各个类群细胞，以每个样点的明场及侧散图像作为佐证，根据随机软件计算即可获知各类细胞比例为R1，45.1±3.76%； R2，36.53±2.97%；R3，6.94±0.49%；R4,8.53±1.32%（图8）。上述比例范围系来自体重20g左右的个体的统计分析，可以在一定程度上作为该发育阶段的中华绒螯蟹健康血淋巴特征的参考范围。由于中华绒螯蟹生长周期长达两年，因此其他发育阶段或者生理状况下的健康范围还需要进一步深入分析。