一种核壳型磁性多色荧光探针的制备及可视化检测方法

摘要

本发明属于纳米复合材料制备技术领域，具体涉及一种核壳型磁性多色荧光探针的制备及可视化检测方法。其中稀土掺杂的核壳型磁性多色荧光探针的制备，包括三个步骤：（1）用水热法让荧光素负载到磁性多水高岭土上，此时，磁性高岭土就会在三用紫外分析仪下显示出绿色荧光；（2）为了防止荧光素从磁性多水高岭土内泄露出来，采用APTES+TEOS混合液，滴加氨水，发生反应让氨基取代产品的羟基，从而形成一层保护膜；（3）接下来接枝乙二胺四乙酸衍生物，进而与稀土离子配位形成鳌合物，制得荧光探针。另外涉及一种可视化检测方法，将上述荧光探针与Tris‑HCl缓冲溶液混合后对不同浓度的被检测物DPA进行荧光测定，得到多色荧光变化说明该荧光探针的识别性能。

说明书

技术领域

本发明属于纳米复合材料制备技术领域，具体涉及一种稀土掺杂的核壳型磁性纳米多色荧光探针的制备及可视化检测方法。

背景技术

炭疽是一种急性传染病，在人畜之间传播，主要由炭疽芽胞杆菌引发。该细菌通过呼吸道和损伤的皮肤进入人体，首先在局部繁殖，之后产生毒素而致组织及脏器发生出血性浸润、坏死和高度水肿，形成原发性皮肤炭疽、肠炭疽、肺炭疽等。对炭疽芽孢杆菌的探究是科学界的一个热点，现在探究的方法是对DPA（2,6-吡啶二甲酸）的检测，因为DPA是芽孢的核心成分。常用方法有高效液相色谱法，电化学检测法和荧光分析法等。其中荧光分析法由于检测方便、快速而显现出优越性。

荧光分析法通常采用稀土离子荧光变化来检测。稀土离子自身的f-f跃迁是禁阻跃迁，导致其摩尔消光系数小，发光效率低。而DPA可以作为有机配体有效的将激发态能量通过无辐射跃迁的形式传递给中心稀土离子，从而敏化稀土离子发光，所得稀土配合物激发寿命长且荧光大大增强，因此可通过稀土离子与DPA螯合时荧光的增强来实现对DPA的检测。

但是单一的稀土离子对DPA的检测会受到其他有机羧酸的干扰，特异性差且形成的配合物量子产率低。易受配位水分子的影响，且其化学和热稳定性一直是难以解决的问题。其次，产物往往无法大量生产，限制了其实际应用范围。将稀土配合物负载于磁性无机纳米材料基质表面，有望提高配合物的稳定性和传感器的重复利用率，使无机纳米基质的荧光传感器在离子检测方面表现更加优良的性能。将多色荧光探针用于荧光方法测定中还有助于消除光漂白、探针负载和留存及设备因素引起的数据的失真，提高检测灵敏度，有利于实验多色可视化检测。因此，设计合成灵敏度高的比率多色荧光传感器成为研究目标。

发明内容

本发明所解决的在现有技术中的问题是单一的稀土离子对DPA的检测容易受到其他分子和离子的干扰，造成的特异性差，产量低，限制应用的问题；希望研究一种采用廉价易得且性能优异的天然矿物多水高岭土作为基质的探针，通过合成磁性高岭土，获得具有磁性的基质，有效提高材料的分离效率与材料的重复利用率；由于多水高岭土具有管状结构，且管内部带有正电荷，易吸附阴离子型染料，且磁性四氧化三铁附着在管外，利用多水高岭土的天然屏障有效地避免了磁性物质对荧光的影响，有效地引入荧光内标分子荧光素；以吸附了荧光素分子的磁性多水高岭土作为荧光内标，通过荧光比率测定法，实现了对DPA的检测，解决并消除光漂白、探针负载和留存及设备因素引起的数据的失真；实现对DPA的高灵敏性特异性识别，有效地防止了其它分子及离子的干扰；实现了对DPA的可视化检测，通过荧光颜色的改变，可以初步确定DPA的浓度，为实现实际应用了奠定基础。

本发明为解决其技术问题所采用的技术方案是

一种稀土掺杂的核壳型磁性多色荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

第一步，磁性多水高岭土吸附荧光素：

称取磁性多水高岭土(Fe₃O₄-Hal)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和阴离子型发光染料荧光素（FL），均匀混合之后，进行研磨处理，再加入去离子水搅拌，然后装入反应釜在一定温度下放入烘箱反应，然后冷却并进行离心处理，即用水热法让荧光素吸附到磁性多水高岭土上，最后清洗、干燥后得到第一步的产物Fe₃O₄-Hal-荧光素；

第二步，吸附氨基制作保护膜：

取第一步的产物溶于无水乙醇当中，在搅拌的同时加入APTES与TEOS混合液，再滴加氨水，发生反应让氨基取代磁性多水高岭土表面的羟基，并形成一层保护膜，防止荧光素的泄露，得到第二步的产物Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂；

第三步，多色探针制备：

将第二步的产物分散在乙酸与乙醇的混合液中，再加入EDTAA 进行搅拌接枝，然后离心收集产物，并和Eu(NO₃)₃·6H₂O共同溶解在无水乙醇中，保温搅拌形成与稀土离子配位的螯合物，得到最终的稀土掺杂的核壳型磁性纳米多色荧光探针Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂-EDTAA-Eu。

作为优选的制备方法，所涉及的具体步骤如下：

第一步，磁性多水高岭土吸附荧光素：称取0.8g磁性多水高岭土、0.08gPVP和0.01g荧光素，均匀混合之后，进行研磨处理，再加入15mL的去离子水，并搅拌4小时；然后装入反应釜，放入烘箱，在温度为160℃条件下反应10h；然后冷却至室温，取出产物进行离心处理，在离心处理过程中用无水乙醇清洗3次，在60℃真空干燥后得到第一步的产物Fe₃O₄-Hal-荧光素；

第二步，吸附氨基制作保护膜：取第一步的产物0.2g，溶于60mL无水乙醇当中；在混合物搅拌的同时加入APTES与TEOS 按1：1比例的混合液100uL，再滴加1mL氨水，搅拌2h，得到第二步的产物Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂；

第三步，多色探针制备：将第三步的产物分散在乙酸与乙醇的60mL混合液中，其中乙酸与乙醇的比例为1：1，再加入EDTAA 0.1g，搅拌5h；然后离心收集产物，并和11.1mg 物质的量为0.025mmoL的Eu(NO₃)₃·6H₂O共同溶解在15mL无水乙醇中，在60℃下搅拌5h，得到最终的稀土掺杂的核壳型磁性纳米多色荧光探针Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂-EDTAA-Eu。

作为优选的制备方法，所涉及的具体步骤如下：

第一步，磁性多水高岭土吸附荧光素：称取1g磁性多水高岭土、0.1g PVP和0.05g的荧光素，均匀混合之后，进行研磨处理，再加入15mL的去离子水，并搅拌5小时；然后装入反应釜，放入烘箱，在温度为180℃条件下反应8h；然后冷却至室温，取出产物进行离心处理，在离心处理过程中用无水乙醇清洗3次，60℃真空干燥后得到第一步的产物；

第二步，吸附氨基制作保护膜：取第一步的产物0.2g，溶于60mL无水乙醇当中；在产物搅拌的同时加入APTES和 TEOS按照 1：2比例的混合液100uL，然后慢慢滴加1mL氨水，搅拌5h，得到第二步的产物Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂；

第三步，多色探针制备：将第二步的产物分散在乙酸与乙醇的60mL混合液中，其中乙酸与乙醇的比例为1：2，再加入EDTAA 0.15g，搅拌6h；然后离心收集产物，并和11mg物质的量为0.025mmoL的Eu(NO₃)₃·6H₂O共同溶解在15mL无水乙醇中，在室温下搅拌5h，得到最终的稀土掺杂的核壳型磁性纳米多色荧光探针Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂-EDTAA-Eu。

作为优选的制备方法，所涉及的具体步骤如下：

第一步，磁性多水高岭土吸附荧光素：称取1.5g磁性多水高岭土、0.15g PVP和0.08g的荧光素，均匀混合之后，进行研磨处理，再加入25mL的去离子水，并搅拌6小时；然后装入反应釜，放入烘箱，在温度为200℃条件下反应7h；然后冷却至室温，取出产物进行离心处理，在离心处理过程中用无水乙醇清洗3次，60℃真空干燥后得到第一步的产物Fe₃O₄-Hal-荧光素；

第二步，吸附氨基制作保护膜：取第一步的产物0.25g，溶于60mL无水乙醇当中；在产物搅拌的同时加入APTES和TEOS按照 1：3比例的混合液200uL；再慢慢滴加1mL氨水，搅拌8h，得到第二步的产物Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂；

第三步，多色探针制备：将第二步的产物分散在乙酸与乙醇的60mL混合液中，其中乙酸与乙醇的比例为1：3，再加入EDTAA 0.2g，搅拌8h；然后离心收集产物，并和15mg 物质的量为0.033mmoL的Eu(NO₃)₃·6H₂O共同溶解在15mL无水乙醇中，在60℃下搅拌5h，得到最终的稀土掺杂的核壳型磁性纳米多色荧光探针Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂-EDTAA-Eu。

一种稀土掺杂的核壳型磁性多色荧光探针的制备及可视化检测方法，利用上述的一种稀土掺杂的核壳型磁性纳米多色荧光探针的制备方法所得到荧光探针Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂-EDTAA-Eu，按如下步骤进行：

首先，取一定质量的Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂-EDTAA-Eu分散在蒸馏水中形成荧光探针溶液；然后，在石英比色皿中加入pH=7.1的Tris-HCl缓冲溶液，再加入荧光探针溶液，混合均匀；最后，滴加DPA溶液，放入荧光分析仪中进行荧光测定，并根据数据进行分析。

进一步，所述待测DPA溶液浓度为0.05-5微摩尔，所述荧光探针最低检测限为8.3纳摩尔。

本发明与现有技术相比所具有的有益效果是：（1）本发明涉及的荧光探针以绿色发光染料荧光素掺杂的磁性多水高岭土为核层，将EDTA的衍生物共价嫁接在磁性多水高岭土上，配位稀土铕离子，形成壳层；通过炭疽芽孢杆菌特异性成分DPA的加入，引起荧光由绿经黄、橙向红色的改变，最终通过荧光的改变实现可视化检测；（2）本发明巧妙地利用的多水高岭土特殊的管状结构，将磁性成分与阴离子型荧光素用管壁隔开，既有效的防止了磁性物质对荧光的淬灭，又提高了基质材料的分离效率及重复利用率；（3） 本发明以发绿光染料荧光素掺杂的磁性高岭土为核层，作为该比率探针的内参比，有效地消除由于方法及设备等原因引起的数据误差，显著提高了检测灵敏度，且响应时间快，整个检测过程仅需20秒；（4）本发明涉及材料的主体基质为天然矿石，廉价易得且性能优异，其他配料价格适中，所以我们的产物可以进行大量生产，且探针用量少，实现了微量低成本检测，可以在社会中广泛应用。

附图说明

图1为本发明中荧光探针的制备及检测原理图；

图2为本发明中荧光探针的透射电镜图；

图3为本发明中荧光探针用于检测DPA的荧光变化图谱；

图4为本发明中荧光探针对DPA的定量分析图。

具体实施方式

本发明公开了一种稀土掺杂的核壳型磁性多色荧光探针的制备方法，以绿色发光染料荧光素掺杂的磁性多水高岭土作为核层材料，如图1所示，将乙二胺四乙酸二酐（EDTAA）共价嫁接在核层上，并将硝酸铕与之配位，形成的壳层，即为稀土配合物；由于乙二胺四乙酸并不能很好的将能量传递给稀土铕离子，得到的纳米材料能发射出荧光素分子所特有的荧光，并没有出现铕的特征红色荧光；当有炭疽芽孢杆菌的特异性成分2,6-吡啶二甲酸（DPA）存在时，DPA可以有效的将能量传递给稀土离子，铕的红色特征荧光将大大增强，而位于核层的染料荧光并不会受影响，可作为比率荧光的内参考，随着DPA浓度的不断增加，荧光会由绿色经历黄色，橙色，最终变为红色。

实施例一

一种稀土掺杂的核壳型磁性多色荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

第一步，磁性多水高岭土吸附荧光素：称取0.8g磁性多水高岭土(Fe₃O₄-Hal)>3O₄-Hal-荧光素；

第二步，吸附氨基制作保护膜：取第一步的产物0.2g，溶于60mL无水乙醇当中；在混合物搅拌的同时加入APTES与TEOS 按1：1比例的混合液100uL，再滴加1mL氨水，搅拌2h，得到第二步的产物Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂；

第三步，多色探针制备：将第三步的产物分散在乙酸与乙醇的60mL混合液中，其中乙酸与乙醇的比例为1：1，再加入EDTAA 0.1g，搅拌5h；然后离心收集产物，并和11.1mg 物质的量为0.025mmoL的Eu(NO₃)₃·6H₂O共同溶解在15mL无水乙醇中，在60℃下搅拌5h，得到最终的稀土掺杂的核壳型磁性纳米多色荧光探针Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂-EDTAA-Eu。

实施例二

一种稀土掺杂的核壳型磁性多色荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

第一步，磁性多水高岭土吸附荧光素：称取1g磁性多水高岭土(Fe₃O₄-Hal)、0.1g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和0.05g发光染料荧光素（FL），均匀混合之后，进行研磨处理，再加入15mL的去离子水，并搅拌5小时；然后装入反应釜，放入烘箱，在温度为180℃条件下反应8h；然后冷却至室温，取出产物进行离心处理，在离心处理过程中用无水乙醇清洗3次，60℃真空干燥后得到第一步的产物；

第二步，吸附氨基制作保护膜：取第一步的产物0.2g，溶于60mL无水乙醇当中；在产物搅拌的同时加入APTES和 TEOS按照 1：2比例的混合液100uL，然后慢慢滴加1mL氨水，搅拌5h，得到第二步的产物Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂；

第三步，多色探针制备：将第二步的产物分散在乙酸与乙醇的60mL混合液中，其中乙酸与乙醇的比例为1：2，再加入EDTAA 0.15g，搅拌6h；然后离心收集产物，并和11 mg物质的量为0.025mmoL的Eu(NO₃)₃·6H₂O共同溶解在15mL无水乙醇中，在室温下搅拌5h，得到最终的稀土掺杂的核壳型磁性纳米多色荧光探针Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂-EDTAA-Eu。

实施例三

一种稀土掺杂的核壳型磁性多色荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

第一步，磁性多水高岭土吸附荧光素：称取1.5g磁性多水高岭土(Fe₃O₄-Hal)、0.15g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和0.08g的发光染料荧光素（FL），均匀混合之后，进行研磨处理，再加入25mL的去离子水，并搅拌6小时；然后装入反应釜，放入烘箱，在温度为200℃条件下反应7h；然后冷却至室温，取出产物进行离心处理，在离心处理过程中用无水乙醇清洗3次，60℃真空干燥后得到第一步的产物Fe₃O₄-Hal-荧光素；

第二步，吸附氨基制作保护膜：取第一步的产物0.25g，溶于60mL无水乙醇当中；在产物搅拌的同时加入APTES和TEOS按照 1：3比例的混合液200uL；再慢慢滴加1mL氨水，搅拌8h，得到第二步的产物Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂；

第三步，多色探针制备：将第二步的产物分散在乙酸与乙醇的60mL混合液中，其中乙酸与乙醇的比例为1：3，再加入EDTAA 0.2g，搅拌8h；然后离心收集产物，并和15mg 物质的量为0.033mmoL的Eu(NO₃)₃·6H₂O共同溶解在15mL无水乙醇中，在60℃下搅拌5h，得到最终的稀土掺杂的核壳型磁性纳米多色荧光探针Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂-EDTAA-Eu。

本发明还提出了稀土掺杂的核壳型磁性纳米材料能够实现对炭疽芽孢杆菌标志物DPA的多色荧光检测，如图3和图4所示，其中稀土掺杂的核壳型磁性纳米材料为采用本发明中的制备方法所得的荧光探针Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂-EDTAA-Eu，其透射电镜图如图2所示。

实施例四

一种稀土掺杂的核壳型磁性多色荧光探针的可视化检测方法，利用由一种稀土掺杂的核壳型磁性纳米多色荧光探针的制备方法所得到的一种稀土掺杂的核壳型磁性多色荧光探针Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂-EDTAA-Eu，按如下步骤进行：

称取5mg的Fe₃O₄-Hal-荧光素@SiO₂-EDTAA-Eu分散在5mL蒸馏水中形成荧光探针溶液；然后，在石英比色皿中加入1900uL的pH=7.1的Tris-HCl缓冲液和100uL的荧光探针溶液，混合均匀；最后，滴加不同浓度的DPA溶液（0.05-5微摩尔），放入荧光分析仪中进行荧光测定，每隔20秒测试一次，并根据数据进行分析，利用荧光光谱说明该荧光探针的识别性能。

结果表明，随着DPA量的逐渐增加，Eu(III) 615 nm处的发射与荧光素位于430 nm的内参比荧光发射峰发光强度比值与DPA的浓度呈线性关系，计算所得最低检测浓度为8.3纳摩尔，具有较高的灵敏度。在紫外灯254 nm 激发下，可见溶液颜色由绿色经历黄色，橙色，直到红色的变化，体系实现了对DPA的荧光比率检测和肉眼可视化的检测。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出更动或修饰等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，均仍属于本发明技术方案的范围内。