一种烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal L4/L1及其克隆方法与应用

摘要

本发明公开了一种烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal L4/L1，所述基因编码一种调控烟草尼古丁含量的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示；所述烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal L4/L1包含的核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示本发明还公开了所述调控基因Ribosomal L4/L1的克隆方法及其应用。在烟草植株内抑制Ribosomal L4/L1基因的表达，可以明显降低烟叶中尼古丁的含量，在实际生产中拥有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，进一步属于涉及烟草尼古丁的合成及调控相关基因，具体涉及一种烟草尼古丁含量的调控基因Ribosomal>及其克隆方法与应用。

背景技术

研究烟草尼古丁的代谢调控是非常有意义的一项工作，通过基因调控可以提供不同尼古丁含量的烟草品种，为烟草商业生产个性化尼古丁烟草产品提供原材料。尼古丁对人体有很强的生理刺激作用，是烟草商业性使用的物质基础。许多世界顶级烟草公司如菲利普莫里斯，帝国烟草、日本烟草、英美烟草等公司都投入巨资对烟草尼古丁的代谢途径、调控机制进行研究。

尼古丁是一种吡啶类生物碱，主要存在于茄科烟草属(Nicotiana)植物中，是烟草体内的一种重要的次生代谢产物。烟草尼古丁的合成和转运受到多个因素的调控，目前已经鉴别和克隆出来了一些尼古丁合成途径中的关键基因，如QPT、PMT、MPO、JAZ、MYC2a等。

从分子生物学角度对尼古丁的合成代谢途径研究尚未完全透彻。通过氯离子通道调控尼古丁合成基因，从而影响尼古丁含量的研究未见报道。尼古丁调控基因对于烟草商业生产至关重要，目前大多数的尼古丁合成基因相关专利都掌握在国外烟草公司手中。因此，研究尼古丁合成途径相关调控基因对中国烟草企业改良烟草产品中尼古丁含量具有重要意义。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal>，所述基因编码一种调控烟草尼古丁含量的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。

本发明的第二目的在于提供所述烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal>包含的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID：No.1所示。

本发明的第三目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal>的克隆方法，包括以下步骤：

（1）烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；

（2）Ribosomal> 基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据Ribosomal>基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物，并测序。

本发明的第四目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal>的应用，即在烟草植株体内抑制所述Ribosomal>基因的表达，可降低烟草中尼古丁的含量。

本发明的第五目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal>的重组载体。

本发明的第六目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal>的表达盒。

本发明的第七目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal>的转基因细胞系。

本发明的第八目的在于提供一种所述烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal>的重组菌。

附图说明

图1 Ribosomal>的PCR产物电泳图；

图中，M-分子量标记；1- PCR产物；

图2 中间载体pdonr-zeo图；

图3 Ribosomal>基因植物RNAi干扰载体pHellsgate12图；

图4 转Ribosomal>基因RNAi干扰载体的烟草株系基因表达水平柱状图；

图中，K326-野生型对照；RNAi-1和RNAi-1为转基因烟株；

图5 Ribosomal>基因RNAi干扰烟草植株的尼古丁含量；

图中，K326-野生型对照；RNAi-1和RNAi-1为转基因烟株。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所做的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal>编码一种调控烟草尼古丁含量的多肽，所述多肽包含的氨基酸序列如SEQ ID：No.2所示。所述多肽还可能为由SEQID No：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加而形成，且具有调控烟草尼古丁含量的衍生多肽。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

本发明所述烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal>包含的核苷酸序列如SEQID：No.1所示。或者在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；或者与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

本发明所述烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal>的克隆方法包括以下步骤：

（1）烟草叶片cDNA合成：提取烟草RNA，反转录得到第一链cDNA；

（2）Ribosomal> 基因的PCR扩增：以烟草叶片cDNA为模板，根据Ribosomal>基因序列设计引物，进行PCR扩增，回收和纯化PCR扩增产物并测序。

作为本发明的一种优选，所述引物为：

正向引物：5’- CCGCTGCCGCCATTCCCACCACCACCGTTC -3’

反向引物：5’- GTGAAACAGCTCGTCCGGTACCCCATG -3’。

本发明所述烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal>的应用为在烟草植株体内抑制所述Ribosomal>基因的表达，可降低烟草中尼古丁的含量。可通过由RNA介导的多种方法抑制Ribosomal>基因的表达，如：植物病毒载体介导基因沉默的方法、农杆菌介导转化RNAi干扰载体、优化修改基因编码匡、优化基因启动子等方法。本发明所述的抑制基因表达的方法并不限于上述几种方法，只要能抑制Ribosomal>表达即可。

本发明的Ribosomal>基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜蓿等。携带有本发明Ribosomal>基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。

含有本发明所述Ribosomal>基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、和重组菌等基因工程产品均属于本发明的保护范围。

本发明的烟草尼古丁调控相关蛋白及其编码基因为农作物尤其是烟草尼古丁含量育种提供基因与技术的支持。

本发明中，在烟草植株内抑制烟草内源基因Ribosomal>的表达，会使烟草烟叶的尼古丁含量明显降低，在植物尼古丁育种领域具有广阔的应用前景，其经济效益潜力巨大。

下面将结合具体实施例，对本发明进行进一步的说明。

实施例中所有的植物组织材料取自烤烟（Nicotiania>)品种‘K326’及RNAi干扰Ribosomal>基因表达的K326转基因植株。烟草植株的生长和发育阶段都是在人工气候室中，并保持生长温度在22-25℃之间，以尽量减少外界环境因素对烟草尼古丁合成过程中的影响。实验选取的烟草材料为旺长期，发育表型相近的非转基因烟株及转基因烟株。采取非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。对于另一组，对非转基因烟株及转基因烟株进行打顶处理，然后采取非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。将这些烟草材料杀青以进行尼古丁含量检验。

实施例1：克隆Ribosomal>基因

以烟草叶片cDNA为模板，根据烟草基因组数据库信息设计引物，进行Ribosomal>基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物。设计引物如下所示：

正向引物：5’- CCGCTGCCGCCATTCCCACCACCACCGTTC -3’；

反向引物：5’- GTGAAACAGCTCGTCCGGTACCCCATG -3’。

PCR反应体系和扩增条件如表1所示。

表1 PCR反应体系与条件

将扩增获得的PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳结果如图1所示。电泳结束后，采用Qiagen公司PCR产物纯化试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR产物，并送Invitrogen测序，验证序列结果。

实施例2: 植物RNAi载体的构建

以实施例1中Ribosomal>全长片段为模板，用含有gateway接头序列的引物进行PCR扩增，扩增产物经PCR产物纯化后，经过BP反应插入到invitrogen公司pdonr-zeo载体（图2）中。将构建好的BP反应载体通过LR反应将Ribosomal>片段置换到pHellsgate12RNAi干扰载体（图3）中。

（1）gateway反应引物序列如下：

Ribosomal>_F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCATGGAGGAGCCAACTCGATTAGTAG -3’；

Ribosomal>_R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAGTTCCCCTTTTTACCGCTTTTTG-3’。

（2）PCR反应均采用Phusion高保真聚合酶进行PCR克隆。

PCR反应体系与条件与实施例1相同。

（3）BP反应：

（a）在200 μL离心管中准备8 μL的反应体系，包括：1-7 μL的attB-PCR产物（约15 ~150 ng，质量浓度≥10 ng/μL）、1 μL 150 ng/μL的pdonr-zeo载体和适量的TE缓冲液（pH8.0），在室温下混匀；

（b）将BP Clonase™ II酶混合物在冰上静置2 min融化，轻轻震荡2次，混匀待用；

（c）向（1）准备的样品中加入2 μL的BP Clonase™ II酶混合物，轻轻地将体系混匀；

（d）将BP Clonase™ II酶混合物放回到-20°C或者-80°C保存；

（e）将反应体系放在25°C温浴1 h；

（f）向反应体系中加入1 μL的蛋白酶K溶液，轻轻震荡，然后将样品放在37°C温浴10min，以便终止BP反应；

（g）将混合液转化大肠杆菌后，取转化菌液涂在含Zeacin抗性的LB平板上，挑取菌落至含相应抗生素培养基溶液中摇菌培养，确认后提取阳性克隆的pDONR-Zeocin质粒（图2）备用。

（4）LR反应：

（a）在200 μL离心管中准备8 μL的反应物，包括：1-7 μL的获得的pDONR-Zeocin质粒（50-150 ng）、1 μL150 ng/μL的目的载体和适量的TE缓冲液（pH 8.0），在室温下混匀；

（b）将LR Clonase™ II酶混合物静置在冰上2 min融化，轻轻震荡2次以混匀；

（c）加入2 μL的LR Clonase™ II酶混合物，轻轻震荡将体系混匀；

（d）将LR Clonase™ II酶混合物放回到-20℃ 或者-80℃冰箱保存；

（e）将反应体系放在 25℃温浴反应1 h；

（f）向反应体系中加入1 μL的蛋白酶K溶液以终止LR反应，轻轻震荡后，将样品放在37℃ 静置10 min；得到pHellsgate12 RNAi干扰载体。

实施例3：农杆菌介导的烟草转化及转基因植株的鉴定

（1）冻融法转化农杆菌

将1 μg（200 ng/μL）PB2GW7重组载体加入到100 μL感受态农杆菌LBA4404中，混匀后在冰上静置5 min，放入液氮中冷冻5 min，然后从液氮中取出，放入37℃水浴锅中水浴5 min，再在冰上静置5 min后，加入500 μL LB溶液，在28℃、充分震荡条件下恢复培养4 h，最后将菌液均匀涂抹于选择性平板培养基上，28℃下培养48 h。

(2) 叶盘法转化烟草品种K326。

具体方法如下:

(a) 无菌条件下，将烟草K326种子放入EP管中用无菌水冲洗2-3次；

(b) 于75%的酒精中浸泡30-60 s；

(c) 再用0.1%的升汞处理5min，最后用无菌水冲洗5次；

(d) 播种于MS培养基上，培养在云南烟草农业科学研究院组织培养室中，暗培养4 d,25℃光照培养20-30 d。

(e ) 待烟草苗长至3-5cm时（20-30d），取顶芽放于MS+BA 0.2 mg/L（壮芽，使其快速成长）培养基上，继代培养。

(f) 继代培养14天后（有小叶片即可），取叶片，大小1cm×1cm，切去叶柄，叶片表面及叶边缘划伤，放入MS+ BA1.0mg/L pH 6.0-6.5的预培养培养基上，正面朝下紧贴培养基放置，于黑暗条件下预培养2-3 d。

(g) 然后取出预培养的叶片或茎段，放入农杆菌侵染液中进行侵染。侵染前一天晚上，摇菌农杆菌2瓶。将2 mL离心管装满菌液，4000 r/min离心5min，用悬菌液清洗两次。以1:10比例（10 mL悬菌液放1管1.5 mL菌体）放入悬菌液，加入As 25 mg/L（40 mL中加40 μL As）不断摇晃侵染液，使其与叶片及茎段切口处充分接触，10 min后，取出，放于灭过菌的干燥滤纸上吸干菌液。

其中，农杆菌侵染液的制备方法如下：

1) 取-80℃冰箱保存的已被转化的农杆菌，划平板培养，LB固体平板中加入50mg/Lspec和50mg/L Rif；

2) 挑取单菌斑到含50mg/L spec和50mg/L Rif的5mL LB液体培养基中，放入摇床中28℃、200 r/min培养过夜（12-16h）；

3) 保存菌种，750 μL菌液加入灭过菌的甘油250 μL，-80℃冰箱保存备用。

4) 摇菌，LB液体培养基10 mL加spec（所需浓度50mg/L）10 μL、Rif（所需浓度50mg/L）10 μL及菌液10 μL，28℃、200r/min过夜培养（12-16h）。

5) 当菌液浓度达到OD₆₀₀=1.5左右时，取2mL菌液加入到离心管中，4000r/min离心5min；

6) 倒掉上清液，吸1mL新的MS液体培养基，重悬农杆菌，4000 r/min离心5min。

7) 重复步骤（6）1次；

8) 用1mL的MS液体培养基重悬菌后，再加入到40mL的MS的液体培养基中（含40 μL25mg/L的As），即为侵染液。放置2h以上，再侵染。

200 mL悬菌液的配制如下：

20×大量元素 10 mL

200×有机元素1ml

200×铁盐1mL

200×微量元素1mL

蔗糖5.6g

(h) 将叶片及茎段放回到预培养基上，28℃黑暗条件下共培养2-3天，至叶片切口周围有微菌斑形成；

(i) 洗菌，取出共培养的烟草叶片及茎段，用添加500 mg/L Cef的无菌水冲洗5次，第一次放置于摇床摇30 min，后面每次5 min，以洗去外植体表面的农杆菌；

(j) 取出后，用滤纸吸干，转移到烟草诱芽培养基上，诱芽培养基为MS+ BA 1.0mg/L +Hyg 25mg/L + Cef 500 mg/L pH 5.8；过2周观察，如果发现不长菌，则降低Cef浓度。如果长菌，则继续保持Cef浓度。

(k) 每2周更换1次培养基，直至长出不定芽（一般情况为2周）。切下再生的小苗（1cm 左右），转入继代培养基MS+ BA 0.2-0.1mg/L+ Hyg 25mg/L + Cef 500mg/L pH 5.8；

(l) 至小苗长至2cm长时（有小芽即可），转接入生根培养基MS+ NAA 0.2-0.1mg/L上，24 士1℃、12h 光照、1500 lx 培养3周左右, 长出粗壮根系。

(m) 待根生长至2-3cm。苗高7-10cm左右时，移出三角瓶洗去根部培养基，移栽于花盆中，温室培养。

（3）得到稳定的转基因株系

采用Qiagen公司DNA提取试剂盒，提取转基因烟草幼苗的基因组DNA，设计Kan抗性基因引物进行PCR扩增，筛选阳性植株,检测到25株阳性植株。

Kan抗性基因引物为

Kan F：TCTGGACGAAGAGCATCAGG

Kan R：ATGAATCCAGAAAAGCGGCC

按照实例2中所述方法提取野生型植株和25株转Ribosomal>的RNA

基因T0代植株的总RNA，进行Real time-PCR分析，内参基因为26s，分析不同株系的表达情况。选取表达量最低的2株植株（图4）。单株收取种子分别播种，用Kan抗生素筛选Tl代植株的分离情况，如此重复直至T3代获得遗传稳定的转基因株系。

Ribosomal> qRT-PCR引物为：

Ribosomal>_qRT_F：5’- AGGTCCAGTCTGTTGTGAGG-3’；

Ribosomal>_qRT_R：5’- TTTGCCTTAACCCGTTGAGC-3’。

26s内参基因引物为：

26s_F：5’-GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3’；

26s_R：5’-TCTCCCTTTAACACCAACGG-3’。

实施例4：测定烟叶中尼古丁含量

依据标准YC/T 160-2002检测中烟草材料的尼古丁含量。选取的烟草材料为旺长期，发育表型相近的非转基因烟株及转基因烟株为处理对象，以野生型烟草K326为对照。取5株非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。对于另一组，对5株非转基因烟株及转基因烟株进行打顶处理，然后采取非转基因烟株及转基因烟株的上部、中部及下部叶片。

用5%乙酸水溶液萃取烟草样品，萃取液中的总植物碱（以尼古丁计）与对氨基苯磺酸和氯化氰反应，氯化氰由氰化钾和氯胺T 在线反应产生。反应产物用比色计在460nm测定。

主要仪器设备：连续流动分析仪(美国API) (德国SEAL AA3) (法国ALLIANCE)。

配置试剂：

Brij 35 溶液（聚乙氧基月桂醚）：水中加5滴22% Brij35，搅拌均匀。

缓冲溶液A：称取2.35g氯化钠(NaCl)，7.60g硼酸钠(Na₂B₄O₃·10H₂O)，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，加入1>

缓冲溶液B：称26g磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)，10.4g柠檬酸[COH(COOH)(CH₂COOH)₂·H₂O]，7g对氨基苯磺酸(NH₂C₆H₄SO₃H)，用水溶解，然后转入1L容量瓶中，加入1>

氯胺T溶液（N-氯-4-甲基苯硫酰胺钠盐）[CH₃C₆H₄SO₂N（Na）Cl·3H₂O]：取8.65g氯胺T，溶于水中，然后转入500mL的容量瓶中，用水定容至刻度。使用前用定性滤纸过滤。

0.22 mol/L NaOH缓冲液：NaOH 8.8g，Na₂HPO₄>6H₈O₇•H₂O(一水柠檬酸)10.4g，用水溶解并定容至1000mL。

对氨基苯磺酸缓冲液：称取C₆H₇NO₃S(对氨基苯磺酸)>2HPO₄>6H₈O₇•H₂O(一水柠檬酸)>

氯胺T：称取氯胺T 1.2g，用纯水溶解定容至100mL，用棕色试剂瓶保存。

氰化钾：KCN 0.4g， 用纯水溶解定容至100mL。

NaCO_{3>溶液：10 g NaCO3，>}

分析步骤：称取0.3g烟样于150mL三角瓶或塑料瓶中（精确至0.0001g）；加入50 mL5%乙酸溶液盖上塞子；在普通摇床上振荡萃取30min，转速控制170 r/min，用滤纸过滤上机。（如样品液浓度超出工作标准液的浓度范围，则应稀释）。

结果的计算与表述：

以干基计的总植物碱的含量，由下面公式得出：

式中：

C——样品液总植物碱的仪器观测值，单位为mg/mL;

V——萃取液的体积，单位为mL；

m——试料的质量，单位为mg；

W——试样的水分含量，单位为%。

以两次测定的平均值作为测定结果，结果精确至0.01%。

试验结果表明：实验结果表明RNAi-1及RNAi-2打顶上部叶的尼古丁含量约为非转基因烟株的一半，而RNAi-1及RNAi-2打顶下部叶的尼古丁含量约为对照的75%（图 5）。打顶烟株的上中下部烟叶尼古丁含量都表现出明显的降低。说明Ribosomal>基因能够影响打顶后烟草尼古丁含量。

序列表

<110>云南省烟草农业科学研究院

<120> 一种烟草尼古丁含量调控基因Ribosomal L4/L1及其克隆方法与应用

<130>2017

<160>1

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>6090

<212>DNA

<213>Nicotiana sp.

<400>1

atggctaccg ctgccgccat tcccaccacc accgttcaag ccctagaaaa tgacatggct60

actgacggcg ccgtccctct ccccgccgtc atgaaagctc cgatccgtcc cgacgttgta 120

acctacgtcc actccaacat ttccaaaaac gcccgtcaac cttatgctgt atcaaaaaaa 180

gccggccacc aaacctcagc tgagtcatgg ggtaccggac gagctgtttc acgtattccc 240

cgtgttcccg gtggtggtac ccaccgcgcc ggtcaagctg ctttcggtaa catgtgtcgt 300

ggtggtcgaa tgtttgctcc gacgaagatc tggcgccgat ggcaccgtaa gattcccgtg 360

aaccaaaaac gatatgccgt tgcttcagct atcgccgctt cttcagttcc atcccttgtc 420

ctcgcacgtg gccatcgtat cgagaccgtc cccgagcttc ctctcgttgt ttctgattcg 480

atcgaaggga ttgaaaagac taacaacgct atcaaggctt tgaagcaagt cggcgcttat 540

ccagatgctg aaaaggctaa ggacagtcac gctattcgtc ccggaaaggg aaaaatgcgt 600

aaccgtcgct acatttcccg caaaggccca ctgattgtgt acggaacaga aggtgcaaag 660

ctcgtgaaag cttttaggaa cattcccggt gttgaaattt gccacgtgga tcgattgaac 720

ttactcaagc ttgctccagg tggtcactta ggaaggtttg ttatttggac taaatcggct 780

tatgagaaat tagattcgat ttatggatca ttcgataagc cttcggagaa aaagaagggg 840

tatttattgc caaggcccaa aatggttaat gctgatttgg ctagaattat aaactcggat 900

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aagaatccat tgaagaaccc gaatgtgtta ctgaagctca atccttatgc taagactgct1020

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tatgctgtat caaaaaaagc cggccaccaa acctcagctg agtcatgggg taccggacga1440

gctgtttcac gtattccccg tgttcccggt ggtggtaccc accgcgccgg tcaagctgct1500

ttcggtaaca tgtgtcgtgg tggtcgaatg tttgctccga cgaagatctg gcgccgatgg1560

caccgtaaga ttcccgtgaa ccaaaaacga tatgccgttg cttcagctat cgccgcttct1620

tcagttccat cccttgtcct cgcacgtggc catcgtatcg agaccgtccc cgagcttcct1680

ctcgttgttt ctgattcgat cgaagggatt gaaaagacta acaacgctat caaggctttg1740

aagcaagtcg gcgcttatcc agatgctgaa aaggctaagg acagtcacgc tattcgtccc1800

ggaaagggaa aaatgcgtaa ccgtcgctac atttcccgca aaggcccact gattgtgtac1860

ggaacagaag gtgcaaagct cgtgaaagct tttaggaaca ttcccggtgt tgaaatttgc1920

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gacaacttca caaagtggct tggagtttct cagtgaatgg ctaccgctgc cgccattccc2460

accaccaccg ttcaagccct agaaaatgac atggctactg acggcgccgt ccctctcccc2520

gccgtcatga aagctccgat ccgtcccgac gttgtaacct acgtccactc caacatttcc2580

aaaaacgccc gtcaacctta tgctgtatca aaaaaagccg gccaccaaac ctcagctgag2640

tcatggggta ccggacgagc tgtttcacgt attccccgtg ttcccggtgg tggtacccac2700

cgcgccggtc aagctgcttt cggtaacatg tgtcgtggtg gtcgaatgtt tgctccgacg2760

aagatctggc gccgatggca ccgtaagatt cccgtgaacc aaaaacgata tgccgttgct2820

tcagctatcg ccgcttcttc agttccatcc cttgtcctcg cacgtggcca tcgtatcgag2880

accgtccccg agcttcctct cgttgtttct gattcgatcg aagggattga aaagactaac2940

aacgctatca aggctttgaa gcaagtcggc gcttatccag atgctgaaaa ggctaaggac3000

agtcacgcta ttcgtcccgg aaagggaaaa atgcgtaacc gtcgctacat ttcccgcaaa3060

ggcccactga ttgtgtacgg aacagaaggt gcaaagctcg tgaaagcttt taggaacatt3120

cccggtgttg aaatttgcca cgtggatcga ttgaacttac tcaagcttgc tccaggtggt3180

cacttaggaa ggtttgttat ttggactaaa tcggcttatg agaaattaga ttcgatttat3240

ggatcattcg ataagccttc ggagaaaaag aaggggtatt tattgccaag gcccaaaatg3300

gttaatgctg atttggctag aattataaac tcggatgagg tccagtctgt tgtgaggccg3360

attaagaagg atgttaataa gagggctacg ttgaagaaga atccattgaa gaacccgaat3420

gtgttactga agctcaatcc ttatgctaag actgctagga ggatgtcgct tttggccgag3480

gctcaacggg ttaaggcaaa gaaagagaag ctagacaaga agaggcatca aattacaaag3540

gaggaggcat ccgctatcag gtctgcaagc cattcgtggt acaagacaat gatctcagat3600

tccgactatg cagagttcga caacttcaca aagtggcttg gagtttctca gtgaatggct3660

accgctgccg ccattcccac caccaccgtt caagccctag aaaatgacat ggctactgac3720

ggcgccgtcc ctctccccgc cgtcatgaaa gctccgatcc gtcccgacgt tgtaacctac3780

gtccactcca acatttccaa aaacgcccgt caaccttatg ctgtatcaaa aaaagccggc3840

caccaaacct cagctgagtc atggggtacc ggacgagctg tttcacgtat tccccgtgtt3900

cccggtggtg gtacccaccg cgccggtcaa gctgctttcg gtaacatgtg tcgtggtggt3960

cgaatgtttg ctccgacgaa gatctggcgc cgatggcacc gtaagattcc cgtgaaccaa4020

aaacgatatg ccgttgcttc agctatcgcc gcttcttcag ttccatccct tgtcctcgca4080

cgtggccatc gtatcgagac cgtccccgag cttcctctcg ttgtttctga ttcgatcgaa4140

gggattgaaa agactaacaa cgctatcaag gctttgaagc aagtcggcgc ttatccagat4200

gctgaaaagg ctaaggacag tcacgctatt cgtcccggaa agggaaaaat gcgtaaccgt4260

cgctacattt cccgcaaagg cccactgatt gtgtacggaa cagaaggtgc aaagctcgtg4320

aaagctttta ggaacattcc cggtgttgaa atttgccacg tggatcgatt gaacttactc4380

aagcttgctc caggtggtca cttaggaagg tttgttattt ggactaaatc ggcttatgag4440

aaattagatt cgatttatgg atcattcgat aagccttcgg agaaaaagaa ggggtattta4500

ttgccaaggc ccaaaatggt taatgctgat ttggctagaa ttataaactc ggatgaggtc4560

cagtctgttg tgaggccgat taagaaggat gttaataaga gggctacgtt gaagaagaat4620

ccattgaaga acccgaatgt gttactgaag ctcaatcctt atgctaagac tgctaggagg4680

atgtcgcttt tggccgaggc tcaacgggtt aaggcaaaga aagagaagct agacaagaag4740

aggcatcaaa ttacaaagga ggaggcatcc gctatcaggt ctgcaagcca ttcgtggtac4800

aagacaatga tctcagattc cgactatgca gagttcgaca acttcacaaa gtggcttgga4860

gtttctcagt gaatggctac cgctgccgcc attcccacca ccaccgttca agccctagaa4920

aatgacatgg ctactgacgg cgccgtccct ctccccgccg tcatgaaagc tccgatccgt4980

cccgacgttg taacctacgt ccactccaac atttccaaaa acgcccgtca accttatgct5040

gtatcaaaaa aagccggcca ccaaacctca gctgagtcat ggggtaccgg acgagctgtt5100

tcacgtattc cccgtgttcc cggtggtggt acccaccgcg ccggtcaagc tgctttcggt5160

aacatgtgtc gtggtggtcg aatgtttgct ccgacgaaga tctggcgccg atggcaccgt5220

aagattcccg tgaaccaaaa acgatatgcc gttgcttcag ctatcgccgc ttcttcagtt5280

ccatcccttg tcctcgcacg tggccatcgt atcgagaccg tccccgagct tcctctcgtt5340

gtttctgatt cgatcgaagg gattgaaaag actaacaacg ctatcaaggc tttgaagcaa5400

gtcggcgctt atccagatgc tgaaaaggct aaggacagtc acgctattcg tcccggaaag5460

ggaaaaatgc gtaaccgtcg ctacatttcc cgcaaaggcc cactgattgt gtacggaaca5520

gaaggtgcaa agctcgtgaa agcttttagg aacattcccg gtgttgaaat ttgccacgtg5580

gatcgattga acttactcaa gcttgctcca ggtggtcact taggaaggtt tgttatttgg5640

actaaatcgg cttatgagaa attagattcg atttatggat cattcgataa gccttcggag5700

aaaaagaagg ggtatttatt gccaaggccc aaaatggtta atgctgattt ggctagaatt5760

ataaactcgg atgaggtcca gtctgttgtg aggccgatta agaaggatgt taataagagg5820

gctacgttga agaagaatcc attgaagaac ccgaatgtgt tactgaagct caatccttat5880

gctaagactg ctaggaggat gtcgcttttg gccgaggctc aacgggttaa ggcaaagaaa5940

gagaagctag acaagaagag gcatcaaatt acaaaggagg aggcatccgc tatcaggtct6000

gcaagccatt cgtggtacaa gacaatgatc tcagattccg actatgcaga gttcgacaac6060

ttcacaaagt ggcttggagt ttctcagtga 6090

<210>2

<211>405

<212>PRT

<213>Nicotiana sp.

<400>2

Met Ala Thr Ala Ala Ala Ile Pro Thr Thr Thr Val Gln Ala Leu Glu

1 5 1015

Asn Asp Met Ala Thr Asp Gly Ala Val Pro Leu Pro Ala Val Met Lys

202530

Ala Pro Ile Arg Pro Asp Val Val Thr Tyr Val His Ser Asn Ile Ser

354045

Lys Asn Ala Arg Gln Pro Tyr Ala Val Ser Lys Lys Ala Gly His Gln

505560

Thr Ser Ala Glu Ser Trp Gly Thr Gly Arg Ala Val Ser Arg Ile Pro

65707580

Arg Val Pro Gly Gly Gly Thr His Arg Ala Gly Gln Ala Ala Phe Gly

859095

Asn Met Cys Arg Gly Gly Arg Met Phe Ala Pro Thr Lys Ile Trp Arg

100 105 110

Arg Trp His Arg Lys Ile Pro Val Asn Gln Lys Arg Tyr Ala Val Ala

115 120 125

Ser Ala Ile Ala Ala Ser Ser Val Pro Ser Leu Val Leu Ala Arg Gly

130 135 140

His Arg Ile Glu Thr Val Pro Glu Leu Pro Leu Val Val Ser Asp Ser

145 150 155 160

Ile Glu Gly Ile Glu Lys Thr Asn Asn Ala Ile Lys Ala Leu Lys Gln

165 170 175

Val Gly Ala Tyr Pro Asp Ala Glu Lys Ala Lys Asp Ser His Ala Ile

180 185 190

Arg Pro Gly Lys Gly Lys Met Arg Asn Arg Arg Tyr Ile Ser Arg Lys

195 200 205

Gly Pro Leu Ile Val Tyr Gly Thr Glu Gly Ala Lys Leu Val Lys Ala

210 215 220

Phe Arg Asn Ile Pro Gly Val Glu Ile Cys His Val Asp Arg Leu Asn

225 230 235 240

Leu Leu Lys Leu Ala Pro Gly Gly His Leu Gly Arg Phe Val Ile Trp

245 250 255

Thr Lys Ser Ala Tyr Glu Lys Leu Asp Ser Ile Tyr Gly Ser Phe Asp

260 265 270

Lys Pro Ser Glu Lys Lys Lys Gly Tyr Leu Leu Pro Arg Pro Lys Met

275 280 285

Val Asn Ala Asp Leu Ala Arg Ile Ile Asn Ser Asp Glu Val Gln Ser

290 295 300

Val Val Arg Pro Ile Lys Lys Asp Val Asn Lys Arg Ala Thr Leu Lys

305 310 315 320

Lys Asn Pro Leu Lys Asn Pro Asn Val Leu Leu Lys Leu Asn Pro Tyr

325 330 335

Ala Lys Thr Ala Arg Arg Met Ser Leu Leu Ala Glu Ala Gln Arg Val

340 345 350

Lys Ala Lys Lys Glu Lys Leu Asp Lys Lys Arg His Gln Ile Thr Lys

355 360 365

Glu Glu Ala Ser Ala Ile Arg Ser Ala Ser His Ser Trp Tyr Lys Thr

370 375 380

Met Ile Ser Asp Ser Asp Tyr Ala Glu Phe Asp Asn Phe Thr Lys Trp

385 390 395 400

Leu Gly Val Ser Gln

405

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