多肽Lycosin‑Ⅰ在制备抗炎和抗弓形虫药物中的应用

摘要

本发明属于生物医药研发领域，具体涉及多肽Lycosin‑Ⅰ在制备抗炎和抗弓形虫药物中的应用。本发明中抗炎和抗弓形虫药物含有有效剂量多肽Lycosin‑Ⅰ，Lycosin‑Ⅰ采用Fmoc固相化学合成法合成，利用高效液相色谱法进行纯化，Lycosin‑Ⅰ能够抑制单核细胞THP‑1与血管内皮细胞的粘附，也能抑制TNF‑α诱导的炎症因子细胞间黏附分子‑1、白介素‑6和白介素‑8的表达，还能抑制转录因子NF‑κB的激活和入核，此外，还能明显降低弓形虫速殖子的侵入力和繁殖力。本发明的多肽Lycosin‑Ⅰ在制备抗炎和抗弓形虫药物中的应用具有明显的抗炎效果和杀灭弓形虫的作用，并能够减轻急性弓形虫病产生炎症所导致对宿主细胞的损害，为预防和治疗弓形虫病奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明属于炎症药物研发技术领域，具体涉及多肽Lycosin-Ⅰ在制备抗炎和抗弓形虫药物中的应用。

背景技术

炎症是活体组织对各种损伤因子所产生的一种防御性反应，如物理性因素、化学性因素、机械性因素、生物性因素和免疫反应等。炎症的基本特征为红、肿、热和痛。红和热是由于局部毛细血管扩张、血流速度加快所致，肿是由于血管扩张导致的血液成份渗出导致，痛是由于血液的渗出成分及一些炎症介质刺激神经末梢所致。不仅炎症细胞在整个过程中起着重要作用，并且由其分泌的大量炎症因子也起着至关重要的作用，在这些炎症因子中，有着代表性的一类主要是白介素家族、肿瘤坏死因子家族和粘附分子等。

血管内皮细胞的活化是促进炎症发生发展的始动因素，当内皮细胞受到刺激后可分泌粘附分子（如细胞间黏附分子-1、血管细胞粘附分子-1）来加强单核细胞对内皮细胞的粘附作用，从而进一步激活内皮细胞，与此同时，一些炎症因子（如白介素-6、白介素-8）的分泌也会同样增加，而这一类炎症因子的分泌继而会进一步诱导炎症的放大。

核转录因子-κB (NF-κB) 信号通路的激活在调控炎症方面起着重要作用，它可调节上述细胞间黏附分子-1、白介素-6、白介素-8等炎症因子的分泌，因此可通过抑制核转录因子-κB的激活来达到控制炎症发生发展。

弓形虫（Toxoplasma>）是一种单细胞真核原生动物，广泛寄生于人和各种动物，由它所引起的弓形虫病是一种重要的人畜共患寄生虫病；全球大约有1/3的人口感染弓形虫，虽然我国弓形虫的人群平均感染率大约为7.9%，但是随着我国饲养宠物家庭数量的增多，人们饮食习惯的改变，弓形虫病的感染率有急剧上升的趋势。孕妇感染弓形虫后，可通过胎盘垂直把虫体传给胎儿，从而可致流产、早产、畸胎和死胎，对我国的优生优育工作造成重大影响。在免疫功能严重受损时，脑弓形虫病是艾滋病等患者最常见的机会性疾病，引发致死性病变。家畜也受到弓形虫病的严重威胁，家畜的弓形虫感染率为10%-50%，给畜牧业造成重大损失。目前没有预防弓形虫病的疫苗，治疗弓形虫病的药物也主要有磺胺嘧啶、乙胺嘧啶、螺旋霉素、阿奇霉素、青蒿素、蒿甲醚等。但是治疗弓形虫病的药物仍然存在可选药物少、治疗周期长、复发率高、药物毒副作用大、产生抗药性等难题，特别是尚无杀灭弓形虫包囊内的缓殖子和清除包囊的药物，这是抗弓形虫药物研发的重点和难点。

弓形虫也是一种常见的致炎因子。弓形虫感染宿主，会导致宿主产生急性和慢性的炎症反应，其中以导致局部组织坏死并伴有单核细胞浸润为主的急性炎症反应，是弓形虫病的最基本病理改变。弓形虫感染宿主以后，诱导宿主通过T细胞和巨噬细胞产生多种细胞因子发挥抗弓形虫的免疫调节作用。

多肽Lycosin-Ⅰ是由24个氨基酸残基、8个阳离子构成的具有α-螺旋二级结构的线性肽类物质，且为两性分子，羧基端酰胺化，与其他阳离子两性分子抗菌肽结构高度相似。目前对其报道主要有抗菌及抗肿瘤的作用，但在抗炎和抗弓形虫方面未见任何报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供一种多肽Lycosin-Ⅰ在制备抗炎和抗弓形虫药物中的应用，目的是拓展多肽的应用范围，为抗炎和抗弓形虫提供新型药物。

本发明的多肽Lycosin-Ⅰ在制备抗炎和抗弓形虫药物中的应用，其中所述的多肽Lycosin-Ⅰ的氨基酸序列为：RKGWFKAMKSIAKFIAKEKLKEHL-NH₂，-NH₂表示C末端残基酰胺化修饰；

该抗炎和抗弓形虫药物含有有效剂量多肽Lycosin-Ⅰ；

所述的Lycosin-Ⅰ采用Fmoc固相化学合成法合成，利用高效液相色谱法进行纯化；

所述的Lycosin-Ⅰ抑制TNF-α诱导的炎症因子的mRNA的表达。

所述的炎症因子包括细胞间黏附分子-1、白介素-6和白介素-8。

与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：

现有技术中对于Lycosin-Ⅰ应用的报道主要有抗菌及抗肿瘤的作用，但在抗炎和抗弓形虫方面未见任何报道。

本发明的Lycosin-Ⅰ在抗炎和抗弓形虫药物中，通过抑制TNF-α诱导的核转录因子-κB抑制蛋白降解和核转录因子-κB 激活及核转录因子-κB p65 核转位从而减少炎症因子表达，能够抑制TNF-α诱导的HUVECs 白介素-6 、白介素-8 mRNA和 细胞间黏附分子-1的表达，从而达到抗炎的效果，同时Lycosin-Ⅰ具有明显的抑制弓形虫速殖子侵入宿主细胞HFF，减轻急性弓形虫病产生炎症所导致对宿主细胞的损害。

附图说明

图1是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ高效液相色谱纯化和质谱分析结果；

其中：A：高效液相色谱纯化图；B：质谱分析图；

图2是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ抑制TNF-α诱导的单核THP-1细胞对HUVECs的黏附实验图；

其中：A黏附的单核细胞THP-1在光学显微镜（×200）下照片；B：每组取6个视野对黏附的THP-1进行统计学分析；

图3是本发明实施例中不同浓度的Lycosin-Ⅰ干预下细胞存活率图；

图4是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ干预HUVECs不同时间细胞间黏附分子-1的mRNA的表达变化；

图5是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ干预HUVECs不同时间白介素-6的mRNA的表达变化；

图6是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ干预HUVECs不同时间白介素-8的 mRNA的表达变化；

图7是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ干预HUVECs不同时间转录因子信号通路中核转录因子-κB mRNA的表达变化；

图8 是本发明实施例中TNF-α干预HUVECs不同时间白介素-6 mRNA的表达变化；

图9 是本发明实施例中TNF-α干预HUVECs不同时间白介素-8 mRNA的表达变化；

图10 是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ和地塞米松磷酸钠分别干预HUVECs后再以TNF-α处理后 白介素-6 mRNA的表达变化；

图11是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ和地塞米松磷酸钠分别干预HUVECs后再以TNF-α处理后 白介素-8 mRNA的表达变化；

图12是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ和地塞米松磷酸钠分别干预HUVECs后再以TNF-α处理后细胞上清白介素-8含量的变化；

图13是本发明实施例中TNF-α干预HUVECs不同时间时细胞间黏附分子-1的mRNA表达变化；

图14是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ和地塞米松磷酸钠分别干预HUVECs再以TNF-α处理后 细胞间黏附分子-1的蛋白表达变化和灰度值统计分析；

图15是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ和地塞米松磷酸钠分别干预HUVECs再以TNF-α处理后细胞间黏附分子-1的mRNA表达变化；

图16是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ和地塞米松磷酸钠分别干预HUVECs再以TNF-α处理后，核转录因子-κB抑制蛋白的蛋白表达变化和灰度值统计分析；

图17是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ和地塞米松磷酸钠分别干预HUVECs再以TNF-α处理后，p65的蛋白表达变化和灰度值统计分析；

图18是本发明实施例中Lycosin-Ⅰ和地塞米松磷酸钠分别干预HUVECs再以TNF-α处理后，核转录因子-κB的mRNA表达变化；

图19是本发明实施例中不同的干预HUVECs条件下荧光显微镜下的荧光信号图；

图20是本发明实施例中实验小鼠死亡情况图；

图21是本发明实施例中实验小鼠体重变化图；

图22是本发明实施例中台盼蓝染色计数图及弓形虫速殖子死亡率统计图；

图23是本发明实施例中MTT法检测lycosin-Ⅰ对HFF细胞的毒性作用图；

图24是本发明实施例中lycosin-Ⅰ抑制弓形虫速殖子入侵宿主细胞HFF结果统计图；

图25是本发明实施例中lycosin-Ⅰ作用24小时和48小时后弓形虫速殖子的繁殖率；

图26是本发明实施例中lycosin-Ⅰ作用24小时后含有不同弓形虫速殖子的纳虫泡数量图；

图27是本发明实施例中lycosin-Ⅰ作用48小时后含有不同弓形虫速殖子的纳虫泡数量图；

图28是本发明实施例中400 μΜ的磺胺嘧啶对照组纳虫泡中含有的弓形虫速殖子图；

图29是本发明实施例中阴性对照组纳虫泡中含有的弓形虫速殖子数图；

图30是本发明实施例中20 μΜ的lycosin-Ⅰ组纳虫泡中含有弓形虫速殖子数图；

图31是本发明实施例中lycosin-Ⅰ延长弓形虫感染小鼠存活时间对比图；

图32是本发明实施例中lycosin-Ⅰ处理感染弓形虫宿主细胞后白介素-6和白介素-8的表达变化图。

具体实施方式

本发明实施例中多肽Lycosin-Ⅰ在制备抗炎和抗弓形虫药物中的应用，所述的多肽Lycosin-Ⅰ的氨基酸序列为：RKGWFKAMKSIAKFIAKEKLKEHL-NH₂，-NH₂表示C末端残基酰胺化修饰，其具体应用方法是：

1．多肽Lycosin-Ⅰ的合成及纯化

通过Fmoc固相化学合成法合成多肽Lycosin-Ⅰ，利用高效液相色谱法（HighPerformance Liquid Chromatography ，HPLC）进行纯化，如图1A所示，并通过质谱分析（mass spectrum，MS），检验其纯度达到98%以上，如图1B所示， MS分子量鉴定为413.5×7-7=2887.5 Da (B)。

．HUVECs细胞（人脐静脉内皮细胞）总RNA的提取及qRT-PCR实验

2.1 HUVECs总RNA的提取

（1）在光学显微镜下观察细胞密度，待细胞增殖到占培养瓶的80%左右时，弃去培养基，用PBS清洗3次，加入0.25%胰蛋白酶消化，放入培养基2分钟后观察其形态，待内皮细胞的形态变圆后，在超净工作台中弃去胰蛋白酶，再加入培养基吹匀，将细胞接种于6孔板中，待细胞增殖至80%时对细胞进行TNF-α干预，后用PBS清洗3次，每孔加入500μl trizol裂解液进行消化，然后转移至1.5mlEP管中，放置-80℃储存备用；

（2）取出EP管冰浴冷却至室温后每管加入100μl氯仿，用涡旋混匀器震荡混匀15s，室温静至5min，4℃低温12,000 r/min离心15min；

（3）离心后观察到管中液体分为3层，吸取上层液体转移至无RNA酶的EP管中，每管加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，冰上静至10min，4℃低温12,000r/min离心15min；

（4）此时管底有少许白色沉淀，即RNA，倒去上清液，每管加入1ml用DEPC水配制的75%的乙醇溶液，上下颠倒混匀，4℃低温12,000 r/min离心5min；

（5）倒去上清液，再次4℃低温12,000 r/min离心1min；

（6）用微量移液枪吸净上清，可见管底沉淀的RNA，每管加入10μl DEPC水，吹匀，使得RNA完全溶解，将提取出的RNA置于冰上，待检测其纯度及计算浓度；

2.2 采用OD₂₆₀/OD₂₈₀法检测RNA的纯度及浓度的计算操作：

（1）用DEPC水清洗点样槽并将其作为空白对照组，调零OD₂₆₀，用干净滤纸擦净点样槽；

（2）吸取1μl RNA母液置于点样槽中，检测其OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值；

（3）通过比值检测其RNA的纯度，比值≥1.8即达到逆转录要求，可对其进行下一步实验操作；

2.3 逆转录RNA为cDNA

采用逆转录试剂盒，按照其说明书，选择20μl 体系来进行逆转录，说明书操作如下：

表1-1 逆转录体系（20μl）

成分体积（μl）

Total RNA 3μg（aμl）

Oligo（dT） 2.5μl

DEPC H₂O10-a>

5X RT buffer4μl

RNA Rnase Inhibitor 0.5μl

dNTP mix（10mmol/μl） 2μl

RNA reverse transcriptase 1μl

70℃ 5min，42℃ 60min，70℃ 10min,chill on ice

2.4 引物的设计

根据引物数据库中人的GAPDH、白介素-6、白介素-8和细胞间黏附分子-1基因序列，经由上海生工生物工程有限公司合成序列见下表：

表1-2 qRT-PCR引物序列

引物序列（5’->3’）

GAPDH 上游GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT

下游GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG

白介素-8上游TTTTGCCAAGGAGTGCTAAAGA

下游AACCCTCTGCACCCAGTTTTC

白介素-6上游GAAGAGCGCCGCTGAGAAT

下游GTGCAGAGGGTTTAATGTCAACT

细胞间黏附分子-1上游TTGGGCATAGAGACCCCGTT

下游GCACATTGCTCAGTTCATACACC

2.5以逆转录生成的cDNA为模板进行qRT-PCR扩增检测

将上述逆转录所得的cDNA做为模板，GAPDH基因作为内参，使用qRT-PCR技术，按照说明书进行操作，反应体系详见下表：

（1）选择适当体系进行作为qRT-PCR体系，体系见下表

表1-3 qRT-PCR（10μl体系）

成分 体积

cDNA 0.2μl

ddH₂O4.2μl

Primer A 0.3μl

Primer B 0.3μl

1X SYBR Green mix5.0μl

（2）进行 qRT-PCR实验

将装有上述混匀液体的pcr管放入伯乐qRT-PCR仪器中，总反应分为三步（见下表），反应完成后观察其曲线并进行分析，每个pcr管中达到设定的阈值所对应的即为Ct值，对其进行记录，通过Ct值来对基因的表达量进行间接评估，计算方法为：目的基因的ΔCt/内参基因的ΔCt，每组取3个复孔，计算出目的基因表达量。

表1-4 qRT-PCR 扩增程序

温度时间作用

95.0℃2min预变性

95.0℃5s变性

X.0℃ 30s 40Cycles扩增 ，退火

95.0℃5s延伸

65.0℃5s延伸

95.0℃5s延伸

+0.5℃/cycle5s溶解曲线生成

4.0℃ ∞保存

（注：X为不同引物的退火温度）

3. 细胞总蛋白的提取及Western Blot实验

3.1 HUVECs总蛋白的提取（RIPA法）

（1）将已用药物干预的6孔板中的细胞收集，用冰PBS清洗3次，用细胞刮分别将各个孔中的细胞刮下并转移到1.5ml EP管中；

（2）将EP管放入低温离心机中离心，4℃，1000r/min，离心3分钟，取出EP管，可见管底沉淀的细胞团；

（3）弃去上清，每管加入80ul含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液（比例为：1:1:100）， 吹匀，放冰上摇床30min；

（4）将EP管放入低温离心机，4℃，12000r/min，离心15分钟；

（5）取出EP管，将上清分别转移至新的EP管中；

3.2 蛋白浓度的测定

（1）用BCA法检测所提取蛋白质浓度，先将样品稀释20倍，将BCA A液与B液1:50混匀，再向稀释好的样品中每孔加入180ul，放入温箱（37℃）孵育30分钟；

（2）在紫外分光光度计下测定562nm处每孔的吸光光度值，绘制标准曲线，通过标准方程式计算待测样品浓度；

（3）计算浓度后将蛋白液与5X蛋白质上样缓冲液以1:4混匀，随后放入100℃水浴锅加热变性30min；

（4）将变性的蛋白样品放入-80℃保存备用。

3.3 Western Blot实验

（1）洗板：取两块配套的玻璃板，清洗并擦净，用配胶夹夹紧，然后在配胶架子上固定；

（2）制胶：先制备底层的分离胶，根据目的蛋白分子量的大小选择合适的分离胶，分离胶制好后注入玻璃板间至合适高度，随后，每个板子间加入1ml无水乙醇进行封闭，加速胶的凝固，约15min后，倒去无水乙醇并用吸水纸吸干，制备浓缩胶，注入玻璃板间后立即插入上样梳，约15min后浓缩胶凝固，拔出梳子，胶配方如下：

12%的分离胶配方

成分 体积（15ml）

双蒸水 4.8 ml

30%的甲叉丙烯酰胺溶液6.0 ml

1.5M Tris-HCl pH 8.8 3.9 ml

10% SDS溶液0.15 ml

10% 过硫酸铵溶液 0.15 ml

TEMED0.006 ml

（3）上样：从-80℃取出蛋白样品，震荡混匀，根据已计算出的浓度进行上样，向电泳槽中导入事先配置好的电泳液，检测是否漏液，做出适当调整，然后装上电源，再次检测整个电泳装置是否连接通畅；

（4）电泳：浓缩胶电泳条件，恒压80V，30min，待样品达到浓缩胶与分离胶的交界处时，将电压增至120V，时间为60min，直至样品跑到电泳槽的最下方，取出胶，用清水冲洗残余的电泳液；

（5）转膜：

① 根据目的蛋白分子量的大小来选择合适的转膜条件，剪切与胶大小相仿的PVDF膜，用少许甲醇湿润活化，再放入已配制好的转膜缓冲液中浸泡5min；转膜装置的顺序为：黑色板子、海绵垫、3层滤纸、胶、PVDF膜、3层滤纸、海绵垫、白色板子，放好后将板子夹紧，每放一层都需用玻璃棒反复碾压以防气泡残留；

② 将转膜装置放进转膜槽中，随后倒入转膜缓冲液，放入一小块冰袋，连接整个装置，并检查电路是否通畅，将整个转膜装置放入已装有碎冰的泡沫盒中，以防转膜过程中产生大量热从而影响转膜效果；

③ 转膜条件：恒压100V，70min；

（6）抗体孵育

① 取出转膜装置，依次打开并取出与蛋白结合的PVDF膜，用双蒸水浸泡1min，随后放入用PBST配制的5%的脱脂牛奶中，放置摇床上，室温封闭约2h，可将膜上非特异性蛋白位点封闭；

② 用已配制好的一抗稀释液按照说明书来稀释一抗，通常配制5ml，放入15ml离心管备用；

③ 取出封闭完的PVDF膜，用PBST清洗3次，每次1min，将膜裁剪后分别放入装有抗体的离心管中孵育，4℃冰箱摇床过夜；

④ 取出敷完一抗的PVDF膜，放入PBST溶液中，摇床上清洗3次，每次10min，按照二抗说明书用PBST进行配制，将膜放入二抗中孵育1h；

（7）显影

① 二抗封闭完后，取出膜，同样用PBST溶液清洗3次，每次10min；

② 将ECL显影液的A液和B液以1:1比例混匀，避光备用；

③ 将膜放入显影器上，滴加混匀的显影液，选取合适的曝光时间进行显影；

（8）数据处理

用Image J软件对显影出来的蛋白条带处理并分析。

细胞与HUVECs粘附实验

（1）将长满HUVECs的6孔板中的培养基弃去，用PBS清洗3次；

（2）细胞分别用lycosin-Ⅰ（3.75-15μg/ml）和地塞米松磷酸钠（5μg/ml）预处理24h，弃去培养基，再用PBS清洗3次；

（3）将细胞用TNF-α（20ng/ml）干预，对照组不做处理，用等量的DMEM；

（4）把6孔板放入细胞培养箱中孵育6h，条件：37℃ 5% CO₂；

（5）弃去上清，用PBS清洗3次，将等量THP-1细胞分别接种于各孔中与HUVECs共同孵育1h，孵育条件同上。

（6）弃上清，PBS清洗3次，用4%多聚甲醛冰上固定20min，弃上清，PBS清洗3次，每孔加入适量PBS，然后在倒置光学显微镜下进行拍照，如图2A所示，每个孔随机选取6个视野拍照，对粘附的THP-1细胞进行计数和统计分析，如图2B所示，从图中可以看出，lycosin-Ⅰ能有效的减少TNF-α引起的THP-1细胞对HUVECs的粘附（n=3；^#p<0.01与对照组相比；^*p<0.05,^**p<0.01与TNF-α组相比）。

实验

采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法，实验原理主要为：在活细胞的线粒体内存在着琥珀酸脱氢酶，它能够将外源性的黄色MTT溶液还原成不溶于水的紫蓝色结晶甲臢并沉积在细胞内，而死细胞的线粒体无此酶，因此不能使MTT还原，在一定细胞数目范围内，MTT结晶的形成与细胞数目成正相关，可用酶标仪在490nm或570nm波长处检测细胞的吸光度，并根据所测吸光度值（OD值）来判断所剩活细胞的数目，OD值越大所对应的细胞活性便越强；

（1）将培养瓶中的细胞进行消化并计数，按1×10⁵个/孔接种于96孔板中，置于细胞培养箱中过夜，培养条件：37℃>2；

（2）待细胞增殖至80%左右后，弃上清，PBS清洗3次，随后加入不同浓度的lycosin-Ⅰ（0-500μg/ml），每个浓度3个复孔，将96孔板放入37℃ 5%CO2的细胞培养箱中孵育24h；

（3）将5×MTT用DMSO稀释成1×备用；

（4）取出96孔板，弃去上清，用PBS清洗3次，每孔加入50μl 1×MTT溶液，置于37℃温箱中孵育4h，使得MTT还原成甲臢；

（5）从温箱中取出96孔板，每孔加入150μl DMSO溶液溶解甲臢，将板放在摇床上摇10min；

（6）将板置于酶标仪上，检测每孔在570nm处的吸光度（OD值）；

（7）对OD值进行处理并分析结果，算出细胞存活率，细胞存活率%=（实验组OD值/空白对照组OD值）×100%。，如图3所示， lycosin-Ⅰ对HUVECs的细胞毒性作用，IC₅₀=64.53±（4.70μg/ml）。

法测定细胞上清白介素-8量

采用酶联免疫吸附剂测定法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 通过检测待测样品中的抗原或抗体与固相板中的抗体或抗原结合起反应，以此达到检测目的。将纯化过的白介素-8抗体包埋在微孔板内，制备成固相抗体备用，向已包埋抗体的微孔依次加入待测样品和生物素标记的抗体，此时，微孔中便形成抗体-抗原-生物素标记抗体的复合物，用PBS清洗后，随后便加入过氧化物酶标记的亲和素反应，再次用PBS清洗，随后用底物TMB显色，TMB可在过氧化物酶的催化下转变成蓝色，随后在酸性条件下彻底转化为黄色。微孔中颜色的深浅变化反映出待测样品中白介素-8的含量，并呈正相关。在酶标仪450nm波长处测定待测微孔的吸光度（OD值），通过绘制的标准曲线计算出样品中的白介素-8的浓度；

（1）将试剂盒从-20℃冰箱取出，室温下平衡20-30min，将多余的微孔放入密封袋中避光冷冻保存；

（2）收集待测细胞上清放入1.5ml EP管中，放入低温离心机中，4℃ 2000r/min 离心20min；

（3）吸取上清装入新的1.5ml EP管中，置于冰上备用；

（4）将标准品牛血清白蛋白依次稀释为10,000pg/ml、5000 pg/ml、2500 pg/ml、1250pg/ml、625 pg/ml、312 pg/ml、156 pg/ml，并将其加入第一排的7孔中，留一控作为调零孔，其余各孔加入待测样品，每孔各加100μl；

（5）酶标板用封板膜封闭，放入37℃温箱中孵育30min；

（6）按照说明书将洗涤液用双蒸水稀释为1×备用；

（7）取出酶标板，撕掉封板膜，弃上清，轻轻甩干，每个微孔中加入300μl 1×洗涤液清洗3次，每次5min，甩干；

（8）每个微孔中加入过氧化物酶结合物100μl，空白孔不做处理；

（9） 步骤同5；

（10）步骤同7；

（11） 每个微孔加入显色底物TMB100μl，震荡混匀，锡箔纸封住整个酶标板后放入37℃温箱中孵育15min；

（12）取出酶标板，每个微孔中加入100μl反应终止液，微孔中液体的颜色立即由蓝色转变成黄色，反应终止；

（13）15min内，用酶标仪在450nm波长处检测各个微孔的吸光度（OD值）；

（14）根据标准孔所得OD值绘制标准曲线，将待测孔的OD值代入标准曲线算出浓度白介素-8。

免疫荧光测定核转录因子-κB核转位

免疫荧光技术（Immunofluorescence technique，IF ）是通过标记法测定的免疫技术中最早的一种，是在生物化学、免疫学及显微镜技术基础上建立的一项检测技术，通过利用抗原抗体结合来反应细胞内特定抗原的定位；

（1）将培养瓶中细胞用0.25%胰蛋白酶消化后接种在6孔板中，每孔1×10⁵个；

（2）待细胞长至80%左右时加入不同浓度的lycosin-Ⅰ（3.75-15μg/ml）干预24h；

（3）弃上清，PBS清洗3次，加入TNF-α（10μg/ml）刺激1h；

（4）弃去上清，PBS清洗3次，细胞用4%多聚甲醛在冰上固定20-30min；

（5）弃上清，PBS清洗3次，每次5min，加入0.5% Triton X-100 破细胞膜，10min；

（6）PBS清洗3次，每次5min，加入5%BSA溶液，将板放在摇床上室温封闭30min；

（7）PBS清洗3次，每次5min，加入用1%BSA溶液稀释的核转录因子-κB一抗，将板置于4℃低温冰箱摇床孵育过夜；

（8）取出6孔板，回收一抗，PBS清洗3次，每次5min，每孔加入带有红色荧光标记的二抗（1%BSA溶液稀释），用锡箔纸封板，室温避光摇床封闭30min；

（9）回收二抗，PBS清洗3次，每次5min，每孔加入用甲醇配制的10%DAPI染料，5min；

（10）弃上清，甲醇清洗3次，每次5min；

（11）加入PBS，在倒置荧光显微镜下选择合适的激发光及曝光时间进行拍照。

Ⅰ抑制HUVECs 的白介素-6和白介素-8 mRNA表达

在以上实验的基础上，根据MTT预实验结果，我们选取lycosin-Ⅰ（15μg/ml）作为最高工作浓度探讨其抗炎功能，检测相关的炎症标志物细胞间黏附分子-1、 白介素-6 、白介素-8以及炎症相关的信号通路核转录因子-κB变化水平，如图4~图7所示，据此我们推测lycosin-Ⅰ可通过调节IκB/核转录因子-κB信号通路发挥抗炎作用（n=3，^*p<0.05,>#p,>**p<0.01与对照组相比）。

Ⅰ抑制TNF-α诱导的HUVECs 白介素-6和白介素-8 mRNA的表达

在炎症过程中，细胞因子白介素-6和白介素-8能促进单核细胞与内皮细胞之间的黏附。实验结果表明，在单独用20ng/ml 的TNF-α (20 ng/ml) 干预HUVECs不同时间（0, 2,4, 6, 8, 10h）时，白介素-6（图 8）和白介素-8（图 9）mRNA表达水平呈时间依赖性增加；以lycosin-Ⅰ（3.75-15μg/ml）和地塞米松磷酸钠（5μg/ml）分别干预HUVECs 24h，再用TNF-α(20ng/ml) 处理6h，结果显示：lycosin-Ⅰ 能够有效抑制TNF-α诱导的白介素-6（图 10）和白介素-8（图11）mRNA的表达，并且能降低细胞上清白介素-8含量（图 12）（n=3；^#p<0.05,>##p<0.01,^*p<0.01与对照组相比，^**p<0.05,>***p<0.05与TNF-α组相比）。

Ⅰ抑制TNF-α诱导的细胞间黏附分子-1 mRNA和蛋白的表达

细胞间黏附分子-1表达增加同样能促进单核细胞与内皮细胞的黏附。实验结果显示，在单独用TNF-α (20 ng/ml)处理HUVECs时，细胞间黏附分子-1的mRNA表达变化整体上呈时间（0, 2, 4, 6, 8, 10h）依赖性增加（图 13）；以Iycosin-Ⅰ（3.75-15μg/ml）和地塞米松磷酸钠（5μg/ml）分别干预HUVECs 24h，再用TNF-α (20ng/ml)处理6h，Western-blot显示细胞间黏附分子-1的蛋白表达变化和灰度值统计分析，表明lycosin-Ⅰ可抑制TNF-α诱导的细胞间黏附分子-1 蛋白的表达（图14）和mRNA的表达（图 15）（n=3，^#p<0.05,>##p<0.01,>*p<0.01与对照组相比；^**p<0.05,>***p<0.01>

Ⅰ能通过抑制TNF-α诱导的核转录因子-κB抑制蛋白降解和核转录因子-κB 激活从而减少炎症因子表达

核转录因子-κB在固有免疫及获得性免疫方面起着重要作用，核转录因子-κB的激活依赖于抑制蛋白IκB的降解，核转录因子-κB 激活后可促进细胞间黏附分子-1、白介素-6和白介素-8等炎症因子的表达。

我们以lycosin-Ⅰ（3.75-15μg/ml）和地塞米松磷酸钠（5μg/ml）分别干预HUVECs24h，再用TNF-α (20ng/ml) 处理1h，核转录因子-κB抑制蛋白的蛋白表达变化和灰度值统计分析如图16所示，p65蛋白的表达变化和灰度值统计分析如图17所示，从图中可以看出lycosin-Ⅰ能有效抑制TNF-α诱导的核转录因子-κB抑制蛋白蛋白降解和核转录因子-κBp65蛋白激活。核转录因子-κB 的mRNA表达变化如图18所示，从图中可以看出lycosin-Ⅰ能有效抑制核转录因子-κB 的mRNA表达（n=3；^*p<0.01>**p<0.05,>***p<0.01与TNF-α组相比）。

Ⅰ抑制TNF-α诱导的核转录因子-κB p65 核转位

生理状态下，核转录因子-κB与IκB结合并以无活性形式存在细胞质中，当受到炎症刺激时（如TNF-α），核转录因子-κB抑制蛋白会降解并释放核转录因子-κB，后者随即激活并转入细胞核中来调控炎症因子的表达。

我们以lycosin-Ⅰ（3.75-15μg/ml）和地塞米松磷酸钠（5μg/ml）分别干预HUVECs24h，再用TNF-α (20ng/ml) 处理1h，荧光显微镜下观测荧光信号强度，代表蛋白表达量，如图19所示，结果表明，在TNF-α刺激下，HUVECs核的核转录因子-κB p65表达明显增强，而在lycosin-Ⅰ的干预下p65表达会有所降低，说明lycosin-Ⅰ能降低TNF-α诱导的核转录因子-κB p65 核转位。

对炎症小鼠模型生存的影响

（1）选取24只健康的雄性C57BL/6（B6）小鼠，8周龄左右，体重18-20g，将小鼠随机分为三组，每组8只，随后在中南大学基础医学院动物实验室中同等条件喂养1周来适应环境。实验室温度控制在27℃，安全级别为SPF级；

（2）用生理盐水配制LPS（1mg/ml）及lycosin-Ι（1mg/ml）备用，将上三组小鼠分别进行称重后实验备用；

Lycosin-Ι+LPS组：每只尾静脉注射lycosin-Ι（5.5 mg/kg）约30min后，再注射LPS（20mg/kg）；

LPS组：每只尾静脉注射生理盐水（5.5mg/kg）约30min后，再注射LPS（20mg/kg）；

对照组：每只采取尾静脉注射等量生理盐水；

（3）放入动物房继续观察小鼠的基本活动、死亡情况以及体重的变化，每12h查看一次，总共统计7天。

如图20所示，LPS组在5天内死亡7只，而Lycosin-Ι+LPS组仅死亡一只，两者存在统计学差异（P＜0.05），对照组无死亡。LPS和Lycosin-Ι+LPS两组小鼠在注射LPS>

由此可见， Lycosin-Ι可有效降低LPS所诱导的内毒素休克引起的小鼠死亡率。

抗弓形虫的Lycosin-Ι的初步筛选

弓形虫RH株-70℃复苏后，昆明小鼠传代保种。把一定浓度的蜘蛛lycosin-Ι加入含有一定数量弓形虫速殖子的1.5ml离心管中，混匀，37℃培养2小时后，再混匀取样，用台盼蓝染色后，在光学显微镜下观察计数：随机取5个视野，统计被台盼蓝染成蓝色（弓形虫死亡）和未染色（弓形虫存活）的弓形虫速殖子数；弓形虫死亡率=被台盼蓝染成蓝色的弓形虫速殖子数（即弓形虫死亡数）/(被台盼蓝染成蓝色的弓形虫速殖子数+未染色的弓形虫速殖子数)；

以浓度为20μΜ的lycosin-Ⅰ作用于弓形虫速殖子2小时后，用台盼蓝染色计数法，计算弓形虫速殖子的死亡率，如图22所示，图22A-B为光镜下放大40×10倍，C-D为光镜下放大100×10倍。DMEM组（A和C），lycosin-Ⅰ组（B和D），多肽作用后，弓形虫速殖子死亡率的统计（E）（n=3，^***p﹤0.001与对照组DMEM组比），初步观察，20>

对弓形虫速殖子活力的影响

弓形虫体外培养的宿主细胞为HFFs，首先采用MTT法（方法同前）测定蜘蛛多肽对宿主细胞HFF的细胞毒性。然后分别采用MTT法测定蜘蛛多肽对弓形虫速殖子活力的影响。96孔板中每孔包含弓形虫速殖子（5×10⁶)，使用不同浓度的蜘蛛多肽预处理，在37℃细胞培养箱培养2小时，然后用MTT法（方法同前）检测，我们利用MTT法检测，lycosin-Ⅰ对HFF细胞的IC₅₀为34.69>

对弓形虫速殖子侵入力的影响

不同浓度的lycosin-Ι预处理弓形虫速殖子，培养时间为2小时，磺胺嘧啶作为阳性对照药。然后离心去除药物后，分别感染24孔板中已贴壁的HFF细胞（弓形虫与宿主细胞的比值为20:1），细胞培养2小时后，吸弃每孔培养基，用PBS洗2遍；吉姆萨染色；在放大40×10倍的光镜下随机计数200个细胞中，有多少个感染了弓形虫的细胞，即为弓形虫的侵入率，实验重复三次。DMEM为空白对照组，磺胺嘧啶为阳性对照组（n=3，^{>p﹤0.05；**p﹤0.01；***p﹤0.001与空白对照组比），如图24所示，1.25>}

对弓形虫速殖子繁殖力的影响

弓形虫速殖子加入到装有盖玻片的单层HFFs的培养皿中（弓形虫与宿主细胞的比值为20:1），培养2小时后，吸弃培养基，去除未进入宿主细胞的弓形虫速殖子。分别用不同浓度的lycosin-Ⅰ处理已感染弓形虫的宿主细胞，磺胺嘧啶作为阳性对照药，培养24、48小时后，取盖玻片染色镜检。计算100个纳虫泡内的虫体总数，同时分别记录有1、2、4、8、16、32、64个弓形虫速殖子的纳虫泡数目，然后进行统计学分析，抑制率= (对照组繁殖率-实验组繁殖率) ÷对照组繁殖率，空白对照组为不加lycosin-Ι处理，实验重复三次。

如图25～27所示，采用t检验法统计，5-10>*p﹤0.05，^**p﹤0.01，^***p﹤0.001与空白对照组比）。

Ⅰ对弓形虫感染小鼠生存的影响

收集从昆明小鼠传代的毒力恢复的弓形虫速殖子，10 μΜ的lycosin-Ⅰ处理弓形虫速殖子，室温培养2小时后，去除lycosin-Ⅰ，计数并调整弓形虫数量，每只小鼠通过腹腔接种2.5×10⁴个速殖子，设置lycosin-Ⅰ组和生理盐水空白对照组，每组6只小鼠，记录小鼠的生存状态和存活时间。

统计学分析显示，经过lycosin-Ⅰ处理的弓形虫速殖子接种小时后，感染小鼠的存活时间能够延长，如图31所示（n=6，^**p﹤0.01与生理盐水空白对照组比）。

Ⅰ对感染弓形虫的HFF细胞分泌白介素-6和白介素-8的影响

HFF细胞感染弓形虫速殖子后，用10 μΜ的lycosin-Ⅰ作用48小时后，提取总RNA，然后逆转录为cDNA，通过QRT-PCR，检测白介素-6和白介素-8 mRNA的表达量；对照组为感染弓形虫速殖子后的HFF细胞（T.g），未做处理的HFF细胞（-），用lycosin-Ⅰ处理的HFF细胞（lycosin-Ⅰ），用lycosin-Ⅰ处理已感染弓形虫速殖子的HFF细胞（lycosin-Ⅰ+ T.g）。

弓形虫速殖子感染宿主细胞后，诱导宿主细胞产生大量的致炎因子白介素-6和白介素-8。当用蜘蛛多肽lycosin-Ⅰ处理感染了弓形虫速殖子的宿主细胞后，致炎因子白介素-6和白介素-8的分泌受到明显的抑制，如图32所示（n=3，^{>p﹤0.01，***p﹤0.001与对照组比），表明Lycosin-Ⅰ可能有助于减轻急性弓形虫病产生炎症所导致对宿主细胞的损害。}

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