基于金鲫鱼生物节律的在线生物水质监测模型及其构建方法

摘要

本发明公开了一种基于金鲫鱼生物节律的在线生物水质监测模型及其构建方法，基于金鲫鱼的生物节律的在线生物水质监测模型的构建方法，包括以下步骤：(1)受试生物的选择；(2)痕量污染物溶液的配制，根据中华人民共和国地表水环境质量标准，确定实验用药品的浓度；(3)设置空白组和实验组，每组设置至少3个平行组，将空白组和实验组的受试生物放入到生物在线行为检测仪的不同的传感器中，向空白组的传感器中加入曝气水，向实验组的传感器中加入配制的痕量污染物溶液；对水生生物在线行为检测仪进行校准后，向每个传感器中分别加入至少2条金鲫鱼，进行流水试验，系统自动采集并记录数据；(4)数据的处理及结果分析：(5)生物钟模型的构建。

说明书

技术领域

本发明属于环境监测领域，具体涉及一种基于金鲫鱼生物节律的在线生物水质监测模型及其构建方法。

背景技术

随着社会经济的发展，水污染问题日益突出，严重影响着生态系统的平衡稳定和人类的生存发展。水质监测逐渐成为水污染治理的关键步骤。金鲫鱼对水质的适应性较广但不能耐受水质的急剧变化，因此，金鲫鱼被广泛应用于水质监测。

目前水质监测的主要方法包括理化分析方法(如滴定、分光光度分析等)、现代仪器分析方法(色谱分析、光谱分析等)、生物监测法等。对于水中痕量有毒有害物质的监测，传统的理化方法和仪器分析法操作复杂、耗时长，只能反映水质的单项指标而不能直接反映水中有毒物质对生物体的影响。传统的生物监测方法具有综合性、敏感性、时效性和操作简单的特点，能综合反映整个时期中环境因素的改变。而近年来发展起来的在线生物水质监测技术，实现了远程原位连续动态的自动监测，其监测结果具有预见性。

然而，目前的鱼类生物在线生物水质监测技术主要以鱼类鳃呼吸、游泳活动、耗氧率等方面为监测指标，都是通过水生生物的外在表现来判定水质污染，参数值的获得受污染物以外的环境因素干扰较大。

发明内容

发明人通过研究发现，生物钟是生物体生命活动的内在节律性，生物钟的改变往往是机体内稳态紊乱的征兆。褪黑激素因为能使皮肤变白而得名，是由脑松果体分泌的激素之一。褪黑激素是生物钟的物质基础，同时也是一种内源性自由基清除剂。松果体细胞接受去甲肾上腺素(仅在夜间产生)的刺激，产生和释放褪黑激素。当受试生物暴露于痕量化学物质中时，痕量化学物质一般会通过两种方式与褪黑激素联系，进而对生物钟产生影响。一方面，痕量化学物质会促进去甲肾上腺素的释放从而促进褪黑激素的合成过程；另一方面，痕量化学物质损伤抗氧化酶系统，直接导致活性自由基的增加，诱导褪黑激素发挥作用，清除自由基，保护机体免受伤害。因此，当水质发生变化时，不同的污染物会诱发不同的生物钟模型。

针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于金鲫鱼生物节律的在线生物水质监测模型及其构建方法。本发明的监测方法克服了传统水质监测方法不能从生物体的内部机制直观反映水质变化的缺陷，降低了环境因素对监测结果的干扰，提高了监测结果的准确性和说服力。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

基于金鲫鱼的生物节律的在线生物水质监测模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)受试生物的选择；

(2)痕量污染物溶液的配制，根据中华人民共和国地表水环境质量标准，确定实验用药品的浓度，使其不高于地表水的浓度；

(3)利用水生生物在线行为检测仪进行实验：

设置空白组和实验组，每组设置至少3个平行组，将空白组和实验组的受试生物放入到生物在线行为检测仪的不同的传感器中，向空白组的传感器中加入曝气水，向实验组的传感器中加入配制的痕量污染物溶液；

对水生生物在线行为检测仪进行校准后，向每个传感器中分别加入至少2条金鲫鱼，进行流水试验，系统自动采集并记录数据；

(4)数据的处理及结果分析：

由于所采集数据具有明显周期性，以环境压力(E)为自变量构建函数，取该函数某一周期内的全部数据，以环境压力为自变量，分析该周期、振幅函数特征；

(5)生物钟模型的构建：

总结在各种环境下生物钟模型的规律，根据相应的变化，构建基于金鲫鱼的生物节律的在线生物水质监测模型，保证可以由生物体当前的生物节律特征反映当前水质状况。

国家规定按照地表水质量标准对各类水域进行监督管理，因此，实验用药品的浓度要不高于地表水的标准，从而在这种情况下可以得出一个正常水质下的监测模型。

步骤3)中，流水试验，即为流水式毒性实验，是在不断流动的溶液中检验毒物对水生生物毒性影响的实验，通过恒流装置，使试验溶液、对照溶液不断流出含有受试生物的实验槽，整个实验过程中试液毒物浓度保持恒定。

步骤4)中，环境压力E由化学物质浓度C和暴露时间t决定。在地表水浓度下得出的实验结果被认为是水生生物对各类化学物质的正常毒性反应。本专利中的举例是在地表水浓度的前提下，金鲫鱼对不同化学物质的反应。

优选的，步骤1)中，受试生物选择的方法为：随机选取试验条件下的成年金鲫鱼若干进行实验，使雌雄比例为1:1，实验前24h停止喂食。

(1)控制雌雄比例，是为了使实验结果更具有说服力，说明监测结果不会因性别差异而有所不同。

(2)实验前24小时停止喂食，是为了让受试金鲫鱼排除体内的粪便等。粪便等排泄物中氨氮等物质的含量很高，需要减少这些物质对实验结果的干扰。

进一步优选的，所述试验条件为：温度22±2℃；光周期:16h光照，04:00-20:00，光照强度 4000lx；8h黑暗，20:00-04:00；每天8:30和16:30各喂食一次。

进一步优选的，选择的成年金鲫鱼的躯干长为5-7cm，尾长2-3cm。

鱼的身体包括头、躯干和尾三部分，头部是指吻端到鳃盖后缘，躯干部是指鳃盖骨后缘至泄殖孔一段，泄殖孔以后至尾鳍基为尾部。

优选的，步骤2)中，所述痕量污染物溶液配制时，使用适量体积的DMSO进行溶解，使 DMSO在水中的浓度小于0.5％。

DMSO是一种水溶性的化合物，能溶解绝大多数有机化合物，甚至对无机盐也能溶解。其优点在于毒性极低，选用DMSO作为有机溶剂，能最大限度地促进痕量污染物的溶解，且最大限度地避免有机溶剂对实验结果的干扰。

进一步优选的，用于污染痕量污染物的DMSO的体积为4-6ml。

优选的，步骤3)中，每个传感器中液体的液面与传感器的上沿齐平。

这一要求是由传感器的构造决定的，该传感器的内壁上有四个电极片，在运行过程中产生磁场。当受试生物在磁场内活动时，会产生磁场的变化，系统自动记录数据。液面与传感器的上沿齐平，以保证磁场的完整性和监测数据的完整性。

优选的，步骤3)中，系统自动采集并记录数据时，以实验开始后30分钟的实验数据为准。前30分钟，整个体系未达到稳定状态，数据缺乏准确性和说服力。

上述构建方法构建得到的水质监测模型。

进一步的，固定阿特拉津的浓度为地表水浓度，构建的金鲫鱼行为强度与暴露时间的关联模型为f(x)＝a₀+a₁cosωx+b₁sinωx+a₂cos2ωx+b₂sin2ωx，其中，f(x)是行为强度，x为时间，

a₀＝0.4248(0.411,0.4387)，a₁＝-0.01963(-0.04233,0.003063)，b₁＝0.04136(0.02167,>2＝0.0987(0.07883,0.1186)，b₂＝0.00709(-0.03308,0.04726)，w＝0.1285>

上述水质监测模型在监测水质中的应用。

利用上述水质监测模型进行水质监测的方法，包括如下步骤：

以环境压力为自变量，待测水生生物的行为强度为因变量，认为控制环境压力的变化，采集相对应的待测水生生物的行为强度，并对行为强度进行傅里叶变换，获得对应的频谱函数；

将频谱函数与环境压力相关联，构建出环境压力与生物节律之间的关联模型；

检测待测水生生物行为强度，并分析其生物节律性，从而获得当前的水体环境压力，实现对环境水体的检测。

本发明反应机理为：去甲肾上腺素受调于视交叉上核，仅在夜间由节后交感神经纤维释放，进一步引起褪黑激素的释放。不同的污染物对褪黑激素有不同的调节机制。例如，溴氰菊酯作为一种具有神经毒性的杀虫剂，能抑制乙酰胆碱酯酶的活性，同时促进去甲肾上腺素的释放。这一作用促进了去甲肾上腺素的释放，能够促进生物钟现象。而氯化镉和阿特拉津能抑制抗氧化酶的活性，导致活性自由基的增多，褪黑激素作为内源性自由基清除剂会指直接清除多余的自由基，同时促进抗氧化酶基因的表达，以保护机体免收氧化应激的伤害。因而，氯化镉和阿特拉津等水质污染物通过抗氧化酶系统间接地影响着褪黑激素的生成，促进生物钟现象的发生。通过将行为监测仪采集的数据进行作图处理，从而直观地反映生物体的生物钟现象，并以此判断水质的变化。

构建完整的水质监测模型后，我们可以实现水生生物行为强度与水体质量环境压力的相互关联，具体为利用水生生物行为强度在时域上表现出的周期性特征，通过傅里叶变换转化为频域尺度的频谱分析，如前文所述，生物的周期性特征会因环境压力的变化而改变，而体现周期性变化的主要信息都包含在函数的频谱中，通过分析水生生物行为强度的频谱函数与环境压力的相关性，可以得知环境压力与生物节律之间的数量关系并构建相应模型。当然，起初的实验阶段，行为强度的周期性节律与环境压力之间的模型构建主要以行为强度为因变量，环境压力为自变量，人为控制环境压力的变化，以采集到相对应的行为强度信息，并对行为强度函数进行傅里叶变换，获得对应的频谱函数，进一步将行为强度的频域函数与环境压力相关联，构建出环境压力与生物节律的关联模型。一旦我们获得了二者一一对应的关系，后期就可以通过检测水生生物行为强度，并分析其生物节律性，从而得知当前的水体环境压力，实现环境检测的作用。

本发明的有益效果为：

(1)本发明克服了传统水质监测方法不能从生物体的内部机制直观反映水质变化的缺陷，降低了环境因素对监测结果的干扰，首次提出使用水生生物的生物钟测定水质的变化；

(2)从痕量化学物质对生物钟影响的内在作用机制，再结合金鲫鱼行为变化方面的研究，最终形成基于金鲫鱼的生物节律的在线生物水质监测模型，能够实现对水质的实时在线评估与监测。

(3)采用生物钟作为监测指标，以污染物对生物钟的影响的分子机制为依据，扩展了样本采集空间，更好的解决了生物监测中的降噪问题，这将会在很大程度上排除外界环境因素的干扰，从而达到用鱼类生命活动的内部机制表征水质污染的目的。另外，建立生物钟模型可以对污染状况进行量化，不仅可以提高监测结果的准确性，而且使监测结果更具有说服力。

附图说明

图1为金鲫鱼的照片；

图2为金鲫鱼循环养殖装置；

图3为水生生物行为检测仪；

图4为金鲫鱼在不同处理(空白对照、阿特拉津、氯化镉)中的行为强度对比图；

图5为金鲫鱼在不同处理(空白对照、阿特拉津、氯化镉)中的行为反应的自相关图；

图6为构建的模型曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

一、受试生物的选择

随机选取实验室培养条件(温度：22±2℃；光周期:16h光(04:00-20:00，4000lx)和8h黑暗(20:00-04:00)；每天8:30和16:30各喂食一次，如图2所示，在循环养殖装置中可以提供上述养殖环境)下的成年金鲫鱼(躯干长5-7厘米，尾长2-3厘米，如图1所示，雌雄比例1:1)若干进行实验，实验前24h停止喂鱼。

二、痕量化学物质的选择及其溶液的配制

阿特拉津是使用最广泛的除草剂，也是最常见的地表水污染物之一。

氯化镉是最重要的重金属污染物之一。

根据中华人民共和国地表水环境质量标准(GB3838-2002)，阿特拉津的地表水浓度为 0.003mg/L，设定实验浓度为0.003mg/L；氯化镉的地表水浓度为0.005mg/L，设定实验浓度为 0.005mg/L。用电子天平称取40mg阿特拉津粉末，溶于995mL曝气水中，再加入5mLDMSO，配制成母液(40mg/L)。用移液枪量取0.75mL母液于10L曝气水中，配制成0.003mg/L的阿特拉津溶液。用电子天平称取50mg氯化镉粉末，溶于995mL曝气水中，再加入5mLDMSO，配制成母液(50mg/L)。用移液枪量取1mL母液于10L曝气水中，配制成0.005mg/L的氯化镉溶液。

三、利用水生生物在线行为检测仪进行实验(如图3所示)

1、设置空白组和实验组，每组四个平行(四个传感器)。

2、仪器校准：向空白组的4个传感器中加入曝气水，使液面与传感器上沿齐平。向实验组(以阿特拉津为例)的4个传感器中分别加入0.003mg/L的阿特拉津溶液，使液面与传感器上沿齐平。启动水生生物在线行为检测仪程序，10分钟后进行校准。氯化镉的操作同阿特拉津。

3、校准结束后，向每个传感器中加入各加入2条金鲫鱼，进行流水试验，系统自动采集并记录数据(以实验开始后30分钟的实验数据为准)。

四、数据的处理及生物钟模型的构建

黑色的阴影部分代表持续6天暴露中的黑暗时期。从图4可以看出，金鲫鱼在空白处理、阿特拉津处理和氯化镉处理六天后，其行为强度均表现出了一定的规律性，总体上行为强度值在白天较高，而在夜间较低，呈现出昼夜周期性的变化趋势。具体地，在行为强度的最大值、最小值及平均值上不同的处理组之间存在差异，表明不同的痕量化学物质对金鲫鱼行为强度的变化有着不同的影响。这将形成不同的周期性模型。

如图5所示，对6天的暴露数据进行自相关处理，黑色的阴影部分代表持续6天暴露中的黑暗时期。自相关反映了数据在不同的时间序列上与自身的相关性，例如，在空白组中，0h和 24h均出现正峰值，这意味着在经过24小时后，数据与其自身相似，这表明存在生物钟现象。虽然不同痕量化学物质处理下的自相关图像不同，但是它们存在一个共同的特点，即它们的第一个正峰值均出现在24h，然后在48h、72h、96h等时间点出现其他的正峰值。这表明在不同的处理中，金鲫鱼均表现出了生物钟现象，同时，空白组和不同的痕量化学物质处理得到的生物钟模型存在差异。

因此，我们可以进一步处理所得数据，以环境压力(E)为自变量，从而得到不同的生物钟模型y_i＝f(E)。取该函数某一周期内的全部数据，以环境压力为自变量分析该周期内的周期、振幅等函数特征。总结阿特拉津、氯化镉存在时的生物钟模型的规律，图4分别显示了金鲫鱼在阿特拉津和氯化镉中行为强度(BS)随时间的变化。虚线代表空白对照组，实线代表实验组。其中，阴影部分表示黑夜，横坐标的0h表示的时刻是中午12点。从图中可以看出，阿特拉津处理组表现出十分明显的昼夜节律，在白天有明显的行为强度(BS)的峰值。氯化镉处理组也表现出昼夜节律，但相对来说，不如阿特拉津处理组明显。他们有一个共同的特征：在实验早期，痕量化学物质对昼夜节律的影响较大，这种现象一直持续到第二天。而根据图4，二者在早期(0-48h)的行为模式也有差异。氯化镉处理组，在前两天的黑暗早期出现峰值，而在后期昼夜节律恢复后峰值主要在白天出现，并且白天的行为强度(BS)要高于夜间的行为强度(BS)。阿特拉津处理组，在接触药物不久后(特别是第一天)出现了峰值，第二天的低行为强度(BS)的时期相对较长。氯化镉和阿特拉津有着不同的行为模式，但是都包括刺激，适应，调整，再适应，再调整等过程。例如，使用阿特拉津和氯化镉，最初在初始阶段观察到峰化，表明刺激。随后，BS值迅速下降，然后连续增加，以具有强峰，表明调节。BS达到峰值之后，便开始下降直到48h,期间上升和下降交替出现。

为了检测BS值在时间序列中的周期性，在不同的化学品中进行了自相关测试，如图5。结果表明，空白对照组显示出典型的昼夜节律模式，有着长期的谐波振荡，相应地出现负峰和正峰，第一负峰在12小时左右，第一正峰在24小时左右。阿特拉津处理组与空白对照组显示出类似的规律，都在12h和24h分别显示负峰值和正峰值。但是长周期中观察到的负振幅与对照组有差别。随着处理中的时间推进，阿特拉津处理组的负侧振幅增加，表明周期性变强。振幅在第四天(黑暗期)增加到最大，并且随后逐渐减少。氯化镉处理组和空白对照组、阿特拉津组的结果有着明显的不同。它的振幅在较小的范围内振动。12h的负峰值相对清楚，但没有观察到24h的正峰值，但是观察到两个较小的峰值，表明光周期中由行为强度呈现的昼夜节律受到很大的影响。与阿特拉津不同，氯化镉不显示负侧峰值逐渐增加的趋势。这表明对行为强度的周期性分析可以推断水生生物对不同化学物质生理/ 生态响应的差异。一般的建模主要考虑的是从分子机制层面详细表达生物钟完整的表现过程，而我们的模型则主要研究根据环境压力的变化对生物节律影响，通过研究生物钟的频率、幅度等判断生物对目前环境胁迫的反应。因此，首先我们要先提取出生物在某特定环境压力下的生物钟特征参数，根据我们的行为数据(图4)，生物的行为表现出明显的周期性特征。

一般的建模主要考虑的是从分子机制层面详细表达生物钟完整的表现过程，而我们的模型则主要研究根据环境压力的变化对生物节律影响，通过研究生物钟的频率、幅度等判断生物对目前环境胁迫的反应。因此，首先我们要先提取出生物在某特定环境压力下的生物钟特征参数，根据我们的行为数据(图4)，生物的行为表现出明显的周期性特征。由高等数学及信号与系统知识可知，任何一个满足狄利克雷条件的周期信号都可以展开成三角函数形式的傅里叶级数：

于是，我们通过大量实验，获得足够的拟合数据，经过MATLAB的拟合分析，发现前两级级数能比较完美的代表当前的生物节律行为强度，如图6所示，因此，我们构建的模型为f(x)＝a₀+a₁cosωx+b₁sinωx+a₂cos2ωx+b₂sin2ωx，其中，f(x)是行为强度，自变量x为时间。该公式是通过固定阿特拉津污染物浓度为地表水浓度作为标准统计行为强度值。

代入相关的实验数据，不断对参数进行拟合，最终可得各系数值为

a₀＝0.4248(0.411,0.4387)

a₁＝-0.01963(-0.04233,0.003063)

b₁＝0.04136(0.02167,0.06106)

a₂＝0.0987(0.07883,0.1186)

b₂＝0.00709(-0.03308,0.04726)

w＝0.1285(0.1261,0.1309)

其中，每个数据后面括号中的数据是指95％的置信区间。

构建完整的水质监测模型后，我们可以实现水生生物行为强度与水体质量环境压力的相互关联，具体为利用水生生物行为强度在时域上表现出的周期性特征，通过傅里叶变换转化为频域尺度的频谱分析，如前文所述，生物的周期性特征会因环境压力的变化而改变，而体现周期性变化的主要信息都包含在函数的频谱中，通过分析水生生物行为强度的频谱函数与环境压力的相关性，可以得知环境压力与生物节律之间的数量关系并构建相应模型。当然，起初的实验阶段，行为强度的周期性节律与环境压力之间的模型构建主要以行为强度为因变量，环境压力为自变量，人为控制环境压力的变化，以采集到相对应的行为强度信息，并对行为强度函数进行傅里叶变换，获得对应的频谱函数，进一步将行为强度的频域函数与环境压力相关联，构建出环境压力与生物节律的关联模型。一旦我们获得了二者一一对应的关系，后期就可以通过检测水生生物行为强度，并分析其生物节律性，从而得知当前的水体环境压力，实现环境检测的作用。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。