Ifit3‑eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用

摘要

本发明涉及一种建立Ifit3‑eKO1基因敲除小鼠模型的方法，属于生物技术领域，所述的方法包括以下步骤：步骤一、确定Ifit3‑eKO1小鼠待敲除基因的特异性靶位点sgRNA1，sgRNA2，并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA；步骤二、将有活性的sgRNA和Cas9RNA显微注射入小鼠受精卵中，获得Ifit3‑eKO1基因敲除小鼠。其优点表现在：本发明使用CRISPR/Cas9基因敲除技术，首次建立了Ifit3‑eKO1基因敲除的小鼠动物模型，为研究Ifit3在肿瘤发生、发展中的作用提供便捷、可靠、经济的动物模型。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用。

背景技术

Ifit3基因，又称为RIG-G基因(维甲酸诱导基因G，retinoic acid.induced geneG)是从急性早幼粒细胞性白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)细胞系NB4中克隆到的一个可以被全反式维甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)诱导表达的基因，位于10号染色体q24，编码一个含490个氨基酸残基的蛋白质，分子量约为60000。

尽管Ifit3最初是由急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4中克隆得到的，但生物信息学分析表明Ifit3是干扰素诱导基因家族中的一员。有研究报道，Ifit3除了在NB4细胞中能够被ATRA显著诱导表达以外，还能在多种肿瘤细胞中被干扰素快速的诱导表达，包括NB4，HL-60、U937等髓系白血病细胞系以及宫颈癌细胞系Hela、非小细胞肺癌细胞系H460、A549和头颈鳞状癌细胞等实体瘤细胞。目前，有关基因功能研究最直接有效的方法是建立转基因和(或)基因敲除动物模型。

规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)技术是基于对细菌和古细菌中的免疫系统改造而建立，通过导向RNA(sgRNA)介导核酸内切酶Cas9蛋白进行目标DNA序列识别并造成DNA双链断裂，促进以同源重组或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而对目标位点实现基因的定点敲除、敲入以及基因修正等多种修饰。

由于其具有特异性高，分子构建简单，流程短的特点，近年来CRISPR/Cas9技术获得了快速发展。使用CRISPR/Cas9技术进行基因敲除需要两个关键因素，首先是有效的sgRNA引导序列，再就是Cas9蛋白的存在。与锌指核酸酶(ZFN)技术和类转录样效应因子核酸酶(TALEN)技术相比，因其靶向编辑目标基因的特异性、高效性和设计的简便性等诸多优点得到越来越广泛的应用，在细菌、哺乳动物细胞以及斑马鱼、小鼠、大鼠等都表现出很强的基因组编辑活性。

因此本研究通过CRISPR/Cas9技术通过体外转录的方式，获得Cas9mRNA和sgRNA构建稳定敲除Ifit3-eKO1基因小鼠模型，为进一步研究Ifit3的功能奠定了良好的基础。

中国专利文献CN107043787A公开了一种基于CRISPR/Cas9获得MARF1定点突变小鼠模型的构建方法。中国专利文献CN104293831A公开了一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立高血压小鼠模型的方法。中国专利文献CN105950639A公开了一种金黄色葡萄球菌CRISPR/Cas9系统的制备方法及其在构建基因修饰小鼠模型中的应用。中国专利文献CN106172238A公开了一种利用Crispr/cas9基因敲除技术建立miR-124基因敲除小鼠动物模型的方法。但是关于Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法。

本发明的第二个目的是，提供一种Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法的应用。

本发明的第三个目的是，提供一种敲除Ifit3-eKO1基因的细胞。

本发明的第四个目的是，提供一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建Ifit3-eKO1基因敲除小鼠模型的sgRNA。

本发明的第五个目的是，提供上述sgRNA的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种建立Ifit3-eKO1基因敲除小鼠模型的方法，所述的方法基于CRISPR/Cas9基因敲除技术，所述的方法包括以下步骤：

步骤一、确定Ifit3-eKO1小鼠待敲除基因的特异性靶位点sgRNA1，sgRNA2，并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA；

步骤二、将有活性的sgRNA和Cas9RNA显微注射入小鼠受精卵中，获得Ifit3-eKO1基因敲除小鼠。

进一步地，sgRNA1如SEQ ID NO:2，sgRNA 2如SEQ ID NO:3所示。

进一步地，所述的方法中步骤二为以下步骤：

(1)、小鼠促排卵和体外受精，培育受精卵；

(2)、将有活性的sgRNA和Cas9RNA显微注射到小鼠受精卵的中；

(3)、受精卵体外培养、植入受体及靶向基因修饰动物的培育。

进一步地，所述的方法包括以下步骤：

(1)、确定Ifit3-eKO1基因待敲除的靶点，并将sgRNA与Cas9核酸酶mRNA体外转录；

(2)、小鼠促排卵、体外受精，受精卵显微注射；

(3)、取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0代小鼠；

(4)、提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物送测序；

(5)、将阳性小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠；

(6)、将F1代杂合子小鼠杂交获得F2代纯合子小鼠，即为小鼠动物模型。

进一步地，所述的方法还包括步骤三，步骤三为：鉴定Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型。

进一步地，所述的方法中步骤三为以下步骤：

取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，即为F0代小鼠；

提取F0代小鼠尾部DNA，PCR扩增并将产物送测序；

将阳性小鼠与野生型异性小鼠交配获得F1代杂合子小鼠；

将F1代杂合子小鼠杂交获得F2代纯合子小鼠，即为小鼠动物模型。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的方法在肿瘤研究中的应用。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的方法获得的小鼠动物模型的敲除Ifit3-eKO1基因的细胞。

为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术构建Ifit3-eKO1基因敲除小鼠模型的sgRNA，sgRNA1如SEQ ID NO:2，sgRNA2如SEQID NO:3所示。

为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是：所述的sgRNA在建立基因缺陷小鼠中的应用

本发明优点在于：

本发明使用CRISPR/Cas9基因敲除技术，首次建立了Ifit3-eKO1基因敲除的小鼠动物模型，项目的成功实施为研究Ifit3在肿瘤发生、发展中的作用提供便捷、可靠、经济的动物模型。

附图说明

附图1是CRISPR/Cas9基因敲除小鼠模型建立示意图。

附图2是CRISPR/Cas9基因敲除设计策略示意图。

附图3是体外转录Cas9、sgRNA电泳结果。

附图4是F1代1型小鼠基因敲除前后测序结果比对。

附图5是F1代2型小鼠基因敲除前后测序结果比对。

附图6是F2代小鼠PCR鉴定电泳条带图。

附图7是F2代小鼠PCR测序鉴定图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

一、本实施类涉及一种基于CRISPR/Cas9基因敲除技术建立Ifit3-eKO1基因敲除小鼠模型的方法，其技术路线如图1所示。

二、确实敲除基因的基本信息

1.敲除基因名称(MGI号)：Ifit3(1101055)

2.敲除基因MGI网址链接：http://www.informatics.jax.org/marker/MGI:1101055

3.敲除基因名称(Ensembl)：Ifit3(ENSMUSG00000074896)

4.敲除基因Ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/Mus_musculus/Gene/Summary？g＝ENSMUSG00000074896；r＝19:34583531-34588731；t＝ENSMUST00000102825

5.敲除针对的转录本(Ensembl号)：Ifit3-001(ENSMUST00000102825.3)

敲除针对的exon：exon 2

三、为CRISPR/Cas9基因敲除设计策略示意图，如图2所示。

四、确认基因敲除位点上下游序列信息，如SEQ ID NO:1所示。

五、确定Ifit3-eKO1小鼠待敲除基因的特异性靶位点sgRNA1，sgRNA2，线性化及纯化DNA并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA；纯化sgRNA至适合转基因注射的纯度。所述sgRNA1的序列如SEQ ID NO:2所示；所述sgRNA2的序列如SEQ ID NO:3所示；体外转录Cas9、sgRNA电泳结果如图3所示。

SEQ ID NO:2：GGGTCATGGGTATAGAACCGG

SEQ ID NO:3：CTAGGAGAGGCCAAGAAATCAGG

六、将步骤五所述的sgRNA与Cas9核酸酶mRNA体外转录后，注射到受精卵中，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，胚胎移植的小鼠出生即为F0代小鼠。

七、待小鼠出生3周后剪尾提取DNA并进行PCR扩增，产物经T-vector连接，测序，阳性F0代阳性小鼠为：22号(突变后的基因组序列如SEQ ID NO:4)和42号(突变后的基因组序列如SEQ ID NO:5)。

八、阳性F0代小鼠PCR鉴定方法：

1.引物信息：

引物序列5'-->3'引物类型ICACCTGGCCCCTTCTGGATAForwardIIGCTGGCCTGCTGCTTACCTTAReverse

2.反应体系：

反应组分体积(μl)ddH2O31PrimeStar GXL PCR Buffer102.5mMdNTP4Primer I(20pmol/μl)1Primer II(20pmol/μl)1PrimeStar GXL DNA Polymerase*2Tail genomic DNA1合计50

*PrimeStar GXL(TaKaRa，Code No：R050A)

3.反应条件：

步骤温度(℃)时间备注1982分钟-29810秒-36315秒-4684分钟步骤2-4，重复35次5685分钟-612-保持

九、F1代小鼠获得及基因型鉴定

选取阳性的F0代小鼠22号和42号分别与野生型C57BL/6J小鼠交配，获得的F1代杂合子小鼠有2种类型，分别为：敲除类型1，缺失2513个碱基对；敲除类型2，缺失2527个碱基对；鉴定方法同F0代小鼠鉴定。

敲除类型1：缺失2513个碱基对

鼠号基因型性别出生日期亲代26He(-2513)♀2017-1-922#

敲除类型2：缺失2527个碱基对

鼠号基因型性别出生日期亲代34He(-2527)♂2017-1-942#37He(-2527)♀2017-1-942#

十、基因敲除F1代小鼠基因型比较分析：

1.在该品系小鼠中，基因敲除前后，目的基因exon2全缺失，从而造成基因功能缺失；

2.敲除类型1(缺失2513个碱基对)基因型敲除后序列分析，如SEQ IDNO:6所示。敲除后测序结果如图4所示；

3.敲除类型2(缺失2527个碱基对)基因型敲除后序列分析，如SEQ IDNO:7所示。敲除后测序结果如图5所示；

4.Sbjct为野生型基因组序列，Query为实际测序结果。

十一、将F1代杂合子小鼠杂交获得F2代纯合子小鼠，即为小鼠动物模型。

十二、F2代纯合子小鼠的鉴定：

1.由于基因Ifit3和Ifit3b序列及上下游序列相似度极高，几乎无法单独扩增出Ifit3片段。

2.鉴定方案为：使用引物I，II扩增小鼠基因组，野生型小鼠只有大条带。杂合子和纯合子小鼠均有大小两条带，由于缺失片段达2.5kb，大小片段区别很大，如图6所示。

十三、要区分杂合子和纯合子，需回收大条带测序，判读的依据是测序结果的“峰形图”，不是测序结果的序列信息；测序引物为CACAGCTGAAGTGCCATTTC，测序结果为单一的Ifit3b基因峰型的为纯合子小鼠；测序结果有Ifit3基因和Ifit3b基因混合峰型的为杂合子小鼠，如图7所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>上海市同济医院

<120>Ifit3-eKO1基因敲除小鼠动物模型的构建方法和应用

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<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>2907

<212>DNA

<213>小鼠（Mus musculus）

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caacctctga aattatacta tgtttctgtc ctgaatcata agcagctttt gcagatgatt120

aaagtgcaaa attgcaggga attcaagatt cttgaatcaa taaatctaag gcaaggctaa180

gaagggtcat gggtatagaa ccggttgaaa aggaccacag atttgttata tacatgctga240

aaagggagta atacttactt gtggatgaag tagtccccag caaggcttcc attccttcag300

tgtaggaaaa acctcctgca ctggctgtgt gaatctgttc atgggaacta ccacaaatgt360

atgtcaggtg gaagagagga aagggtgcag acttaaagtg gaatgtttaa ttggagtttc420

aggtctgaga aattggccat tagaaaggag aggcagaaaa taaacatctc caagagtaca480

tggctcacat tgtcatgact ccgacaccca aaaaaaggtg gttaattttt caatgtcctg540

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ctcatcacag tgaccatgtt tttttttccg ccacagtgag gtcaaccggg aatctctgga660

agcgatcctt ccacagctga agtgccattt cacctggaat ttattcaggg aaggaagtat720

gtccagtcat atggaagaca gggtgtgcaa ccaggtcgaa catttaaact ctgaggagaa780

ggcaacaatg tatgacttat tggcctacat aaagcaccta gatggcgaaa gcaaggccgc840

cctggagtgc ttagggcaag ctgaagattt aaggaagtca gagcacaatg atcaatcaga900

aattcgtcga ctggtcacct ggggaaacta cgcctggatc tactatcaca tgggccgtct960

ctcagaagct caggcttacg ttgacaaggt gagacaagtt tgccaaaagt ttgcgaatcc 1020

ttacagcatg gaatgcccag aacttgaatg tgaggaagga tggacacgcc taaagtgtgg 1080

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agagtgctcc tctgggatgg ccatcgccat gttccgccta gaagaaaaac ctgagaagca 1200

gttctccgtg gatgctctga agcaggccat ggagttgaat cctcagaacc agtacctgaa 1260

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taaagatgct ttggggaaag ctcctaatca aacggatgtc ctccaaaagg cagctcagtt 1380

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tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt tgtgtatccc taagaatgat tctaaagtta acatatatgc 2520

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<210>2

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

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<212>DNA

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gtatcaaaac acaggtgttt tagcatctat gtct394

<210>5

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<212>DNA

<213>小鼠（Mus musculus）

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caacctctga aattatacta tgtttctgtc ctgaatcata agcagctttt gcagatgatt120

aaagtgcaaa attgcaggga attcaagatt cttgaatcaa taaatctaag gcaaggctaa180

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