一种编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3及其克隆方法和应用

摘要

本发明涉及一种编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3和所述基因ZmSmk3的克隆方法，包括以下步骤：分别提取若干纯合突变体和纯合野生型植株叶片的DNA；将提取的纯合突变体DNA混合构建纯合突变体DNA池；将提取的野生型DNA混合构建野生型DNA池；分别对构建的纯合突变DNA池和野生型DNA池进行热不对称交错PCR，获得PCR产物片段；用琼脂糖凝胶电泳检测获得的PCR扩增产物片段，回收纯合突变体DNA池中均出现的特异条带，进行测序获得突变基因ZmSmk3的序列。所述基因ZmSmk3编码mTERF蛋白，该基因的突变影响籽粒发育进程，以及对育种实践具有重要的指导意义。

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种编码玉米mTERF蛋白 的基因ZmSmk3及其克隆方法和应用。

背景技术

线粒体是重要的能量转换站，能够高效地将有机物中储存的能量转换为 细胞生命活动的直接能源ATP(三磷酸腺苷)，为生命活动提供能量来源 (Mackenzie andMcIntosh,1999；Gualberto et al.,2014)。它具有自主的DNA 复制、转录和蛋白质合成系统，是半自主细胞器。其中，大多数的线粒体蛋 白由核编码，受到细胞核的调控。

线粒体基因的表达是一个复杂的生物学过程，包括RNA(核糖核酸)的 转录、RNA编辑、内含子剪切、RNA的翻译、成熟及降解(Hammani and Giegé, 2014)。线粒体的基因组中包含20-23个第二类内含子，只有在某些物种中线 粒体cox1的内含子为第一类内含子(Bonen,2008)。大多数的线粒体基因内含 子能够被顺式剪切，而某些内含子因为缺乏剪切特异的元件，只能够被反式 剪切(Bonen,2008)。在细菌和酵母线粒体中，第二类内含子的剪切是由成熟酶 (MATs,maturases)的加工完成的(Singh et al.,2002)。MATs基因位于内含子 中并直接被编码，从而特异的剪切该宿主内含子。仅有一个成熟酶(MatR)基 因位于nad1的第四个内含子中，但是它对线粒体内含子的剪切功能还不明确。 除了MatR，还有几个核编码的成熟酶参与第二类内含子的剪切。在拟南芥中， 有4个核编码的成熟酶基因(nMAT1–4)参与线粒体内含子的剪切(Mohr and Lambowitz,2003；Keren et al.,2009；Keren et al.,2012；Cohen et al.,2014)。

除了成熟酶，为了精确调控这一复杂的生物学过程，核基因组进化出一 些特异的靶向细胞器的蛋白质家族。参与高等植物细胞器第二类内含子剪切 的蛋白家族还包括：PPR(pentatricopeptide repeat)蛋白家族(Barkan and Small, 2014))，染色质固缩调节因子(REGULATOR OF CHROMOSOME CONDENSATION，RCC)家族(Kühn etal.,2011)，植物细胞器RNA识别(plant organellar RNA recognition，PORR)蛋白家族(Kroeger et al.,2009；Colas des Francs-Small et al.,2012)，叶绿体RNA剪接及核糖体成熟(chloroplast RNAsplicing andribosome maturation，CRM)蛋白家族(Zmudjak et al.,2013)及线粒 体转录终止因子(mitochondrial transcription termination factor，mTERF)家族 (Hammaniand Barkan,2014)。虽然这些蛋白家族的起源和结构都各不相同， 但是它们共有的特点是具有RNA结合结构域(Xiu etal.,2016)。

mTERF最早作为人类mtDNA结合蛋白和线粒体转录终止因子被鉴定 (Kruse etal.,1989)，mTERF蛋白质由重复多个的mTERF基序(mTERF motif)组成，其中每个基序含有约30个氨基酸。保守的mTERF基序的第8 个氨基酸残基为脯氨酸，11、18和25位点形成3个X3LX3的亮氨酸拉链 (leucine zipper)(Roberti et al.,2009)。植物mTERF通常靶向线粒体或叶 绿体，调控细胞器的基因表达(Robles et al.,2012)。植物中被研究报道的 mTERF基因，大多集中在拟南芥中，迄今为止，大部分mTERF蛋白的功能 尚未解析。因此，解析mTERF蛋白的功能及生物学作用机理具有重要作用。 尤其对于籽粒发育进程中的mTERF蛋白功能的解析，明确其对籽粒生长发育 的影响和作用机理对育种实践将具有重要的指导意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3及其克 隆方法和应用。

本发明提供了一种编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3，所述基因 ZmSmk3的序列如Seq ID No.1所示。

本发明还提供了所述的基因ZmSmk3的克隆方法，包括以下步骤：

1)分别提取若干纯合突变体和纯合野生型玉米植株叶片的DNA；

2)将提取的纯合突变体DNA混合构建多个纯合突变体DNA池；将提取 的野生型DNA混合构建野生型DNA池；

3)分别对步骤2)中构建的纯合突变体DNA池和野生型DNA池进行热 不对称交错PCR，获得突变体和野生型的PCR扩增产物片段；

4)用琼脂糖凝胶电泳检测步骤3)获得的PCR扩增产物片段，回收纯合 突变体DNA池中均出现的，野生型DNA池未出现的特异条带，进行测序获 得突变基因ZmSmk3的序列。

优选的，步骤2)中所述纯合突变体DNA池为3个；野生型DNA池为1 个。

优选的，步骤3)中所述的热不对称交错PCR包括第一轮PCR和第二轮 PCR；所述第一轮PCR的模板为3个纯合突变体DNA池和1个野生型DNA 池，所述第一轮PCR的引物包括第一轮特异扩增引物TIR9-1和随机引物，所 述引物TIR9-1的序列如Seq ID No.3所示。

优选的，所述第二轮PCR的模板为第一轮PCR获得的产物；所述第二轮 PCR的引物包括第二轮特异扩增引物TIR9-2和随机引物，所述引物TIR9-2 的序列如Seq ID No.4所示。

优选的，所述随机引物的序列如Seq ID No.5～16所示。

本发明提供了所述的突变基因ZmSmk3的检测方法，包括以下步骤：

a)将突变体混池特异的条带进行测序，测序结果与玉米基因组序列比对， 获得突变基因ZmSmk3在玉米基因组上的匹配位置；

b)以匹配位置的插入位点为中心设计引物S21F和S21R；

c)以S21F+S21R，S21F+TIR6，S21R+TIR6三对引物对玉米单株的DNA 进行扩增获得扩增条带，若扩增条带只有S21F+S21R相应的PCR产物条带， 则该玉米单株对应的基因型为野生型，基因ZmSmk3未发生突变；若扩增条 带包括三对引物扩增相应的PCR产物条带，则该玉米单株为杂合基因型，存 在杂合突变基因ZmSmk3；若扩增条带包括S21F+TIR6，S21R+TIR6两对引物 相应的PCR产物条带，则该玉米单株为纯合突变型，存在纯合突变基因ZmSmk3。

优选的，所述S21F的序列如Seq ID No.17所示；所述S21R的序列如Seq ID No.18所示。

优选的，所述TIR6的序列如Seq ID No.19所示。

本发明提供了所述突变基因ZmSmk3在玉米育种中的应用。

本发明的有益效果：本发明首次克隆了一个编码玉米mTERF蛋白的基因 ZmSmk3，所述基因ZmSmk3的突变使得线粒体nad4及nad1两个基因内含子 不能正常剪切，影响线粒体复合体Ⅰ组装效率和活性，从而影响玉米籽粒发 育。对于籽粒发育进程中的mTERF蛋白功能的解析，明确其对籽粒生长发育 的影响和作用机理以及对育种实践具有重要的指导意义。

附图说明

图1为突变基因ZmSmk3导致突变籽粒的表型观察；

图2为石蜡切片观察野生籽粒和突变籽粒发育形态结构对比图；

图3为ZmSmk3的基因结构示意图；

图4为实施例2中的玉米植株共分离鉴定图；

图5为ZmSmk3基因的表达分布、丰度和亚细胞定位示意图；

图6为RT-PCR检测35个线粒体编码基因在野生型和ZmSmk3突变体中 的表达胶图；

图7为RT-PCR检测线粒体tRNA及rRNA在野生型和ZmSmk3突变体 中的表达胶图；

图8为RT-PCR检测含内含子的线粒体基因在野生型和ZmSmk3突变体 中的表达示意图；

图9为qRT-PCR检测22个线粒体内含子在野生型和Zmsmk3突变体中 的剪切效率示意图；

图10为ZmSMK3对线粒体复合体的积累及线粒体结构的影响示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3，所述基因 ZmSmk3的序列如Seq ID No.1所示。本发明所述基因ZmSmk3编码蛋白的氨 基酸序列如Seq ID No.2所示。

本发明还提供了所述的基因ZmSmk3的克隆方法，包括以下步骤：

1)分别提取若干纯合突变体和纯合野生型玉米植株叶片的DNA；2)将 提取的纯合突变体DNA混合构建多个纯合突变体DNA池；将提取的野生型 DNA混合构建野生型DNA池；3)分别对步骤2)中构建的纯合突变体DNA 池和野生型DNA池进行热不对称交错PCR，获得PCR产物片段；4)用琼脂 糖凝胶电泳检测步骤3)获得的PCR扩增产物片段，回收纯合突变体DNA池 中均出现的特异条带，进行测序获得突变基因ZmSmk3的序列。

在本发明中，ZmSmk3突变体来自于UniFormMu突变体库，编号为 UFMu-06341。在ZmSmk3突变体自交的杂合果穗上存在籽粒粒型变小的突变 体，因而将其命名为Zea mayssmall kernel3。本发明在克隆ZmSmk3突变基因 前对ZmSmk3突变基因进行分析，确定突变基因的类型；所述分析包括统计 ZmSmk3突变体的杂合自交果穗上存在小粒突变的个数，确定小粒突变的个数 为总粒数的1/4，野生型：突变体符合3:1(WT:Zmsmk3＝1651:526,p＝0.37) 的规律，证明该突变性状受隐性单基因控制。

在本发明中，首先分别提取若干纯合突变体和纯合野生型植株叶片的 DNA；所述纯合突变体优选的为5～15个，更优选的为10个，编号为RS1～RS10， 所述野生型优选的为3～8个，更优选的为5个，编号为RW1～RW5。所述提 取植株叶片DNA的方法优选的为CTAB法，所述提取植株叶片DNA的具体 步骤参数采用本领域常规的CTAB法提取植物DNA的步骤参数即可，无其他 特珠要求。

本发明在提取获得上述纯合突变体RS1～RS10和纯合野生型RW1～RW5 植株叶片的DNA后，优选的对提取获得的DNA进行浓度测定。所述DNA 的浓度测定采用本领域常规的DNA浓度测定方法即可，无其他特殊要求，具 体的在本发明实施例中采用nanodrop超微量分光光度计进行所述DNA浓度 测定。本发明在测定所述DNA浓度后，对获得的DNA分别进行稀释；所述 稀释后的DNA的浓度优选的为45～55ng/μl，更优选的为50ng/μl。在本发明中优选的采用ddH₂O进行稀释；本发明在得到纯合突变体和纯合野生型植株叶>

本发明在构建完成纯合突变体DNA池和野生型DNA池后，对得到DNA 池进行热不对称交错PCR，获得PCR产物片段。

在本发明中，所述的热不对称交错PCR包括第一轮PCR和第二轮PCR； 所述第一轮PCR的模板为构建得到的纯合突变体DNA池和野生型DNA池， 具体的在本发明的实施例中，采用上述技术方案所述3个纯合突变体DNA池 和1个野生型DNA池为第一轮PCR的模板；所述第一轮PCR的引物包括第 一轮特异扩增引物TIR9-1和随机引物，所述引物TIR9-1的序列如Seq ID No.3 所示。在本发明中所述随机引物的序列优选的如Seq ID No.5～16所示。

在本发明中，所述第一轮PCR的扩增体系包括DNA池模板，2XPCRMix， 特异扩增引物TIR9-1，随机引物，体积浓度为50％甘油，DMSO和水。所述 特异扩增引物TIR9-1的浓度优选的为8～12μM；更优选的为10μM；所述随机 引物的浓度优选的为8～12μM，更优选的为10μM。所述第一轮PCR的扩增体 系的体积优选的为20μl；所述第一轮PCR的扩增体系中各个成分的含量优选 的如表1所示：

表1第一轮PCR的扩增体系

反应组分体积(ul)DNA池模板22XPCRMix10TIR9-1(10uM)0.4随机引物(10uM)250％甘油2DMSO1H2O2.6

本发明所述的第一轮PCR扩增程序优选的如表2所示：

表2第一轮PCR的扩增程序

本发明所述第一轮PCR扩增结束后获得第一轮PCR扩增产物。

本发明在第一轮PCR结束后，进行所述第二轮PCR；在本发明中所述第 二轮PCR扩增的模板为第一轮PCR扩增产物，本发明优选的将所述第一轮 PCR扩增产物稀释后作为第二轮PCR扩增的模板，所述稀释的倍数优选的为 40～60倍，更优选的为50倍；在本发明中优选的使用ddH₂O对第二轮扩增模>

在本发明中，所述第二轮PCR的扩增体系包括第一轮PCR扩增产物， 2XPCR Mix，特异扩增引物TIR9-1，随机引物，体积浓度为50％甘油，DMSO 和水。在本发明中，所述特异扩增引物TIR9-2的浓度优选的为8～12μM；更 优选的为10μM；所述随机引物的浓度优选的为8～12μM，更优选的为10μM。 所述第二轮PCR的扩增体系的体积优选的为30μl；所述第二轮PCR的扩增体 系中各个成分的含量优选的如表3所示：

表3第二轮PCR的扩增体系

反应组分体积(ul)1:50(TAIL-PCR-1reactants)32XPCRMix15TIR9-2(10uM)0.6随机引物(10uM)350％甘油3DMSO1.5H2O3.9

本发明所述的第二轮PCR扩增程序优选的如表4所示：

表4第二轮PCR的扩增程序

本发明在获得PCR扩增产物片段后，用琼脂糖凝胶电泳检测获得的PCR 扩增产物片段，回收3个纯合突变体DNA池扩增产物中均出现的特异条带， 进行测序获得突变基因ZmSmk3的序列。本发明中，所述的琼脂糖凝胶电泳 的方法和步骤采用本领域常规的方法和步骤即可，无其他特殊限定。在本发 明中，具体的观察获得的PCR扩增产物片段琼脂糖凝胶电泳胶图，回收3个 纯合突变体DNA池扩增产物中均出现、野生型DNA池扩增产物中没有出现 的特异条带。在本发明中，所述PCR扩增产物的回收采用本领域常规的PCR 产物回收方法，具体的在本发明实施例中采用胶回收试剂盒。

本发明在获得回收产物后，优选的将回收产物连接到载体上进行转化细 胞，获得含回收产物的细胞；细胞扩繁后进行菌落PCR获得特异条带。在本 发明中，所述载体优选的为pGEM-T Vector，所述连接到载体的方法采用本领 域常规连接方法即可，具体的在实施例中采用连接试剂盒；所述转化细胞优 选的为Trans5a；所述细胞扩繁的时间优选的为10～14h，更优选的为12h；所 述菌落PCR的引物优选的为通用引物M13F/R。本发明优选的对获得的特异 条带进行琼脂糖凝胶电泳检测，确定条带正确后进行测序。

在本发明中所述的测序采用本领域常规的测序方法即可，具体的在本发 明实施例中交由测序公司完成测序。本发明在测序后获得基因ZmSmk3的序 列。

本发明还提供了所述的突变基因ZmSmk3的检测方法，包括a)将突变基 因ZmSmk3的序列与玉米基因组序列比对，获得突变基因ZmSmk3在玉米基因 组上的匹配位置；b)以匹配位置的插入位点为中心设计引物S21F和S21R； c)以S21F+S21R，S21F+TIR6，S21R+TIR6三对引物对玉米单株的DNA进 行扩增获得扩增条带，若扩增条带只有S21F+S21R相应的PCR产物条带，则 该玉米单株对应的基因型为野生型，基因ZmSmk3未发生突变；若扩增条带 包括三对引物扩增相应的PCR产物条带，则该玉米单株为杂合基因型，存在 杂合突变基因ZmSmk3；若扩增条带包括S21F+TIR6，S21R+TIR6两对引物相 应的PCR产物条带，则该玉米单株为纯合突变型，存在纯合突变基因ZmSmk3。

在本发明中，将突变体混池特异的条带进行测序，测序结果与玉米基因 组序列比对，获得突变基因ZmSmk3在玉米基因组上的匹配位置。在本发明 中，优选的将所述测序获得的序列去除测序接头获得ZmSmk3的序列后与玉 米基因组序列比对，本发明所述比对采用本领域常规的序列比对软件进行即 可。

本发明在获得匹配位置后，以匹配位置的插入位点为中心设计引物S21F 和S21R；所述S21F的序列优选的如Seq ID No.17所示；所述S21R的序列优 选的如Seq ID No.18所示。本发明所述的检测方法中还包括引物TIR6；所述 引物TIR6的序列优选的如Seq IDNo.19所示。本发明以S21F+S21R，S21F+TIR6，S21R+TIR6三对引物对玉米单株的DNA进行扩增获得扩增条带， 根据获得的扩增条带的数量来判断所述玉米单株基因组中是否存在突变基因 ZmSmk3。若扩增条带只有S21F+S21R相应的PCR产物条带，则该玉米单株 对应的基因型为野生型；若扩增条带包括三对引物扩增相应的PCR产物条带， 则该玉米单株为杂合基因型；若扩增条带包括S21F+TIR6，S21R+TIR6两对 引物相应的PCR产物条带，则该玉米单株为纯合突变型。

本发明还提供了所述基因ZmSmk3在玉米育种中的应用，所述基因 ZmSmk3的突变使得线粒体nad4及nad1两个基因内含子不能正常剪切，影响 线粒体复合体Ⅰ组装效率和活性，从而影响玉米籽粒发育。

下面结合具体实施例对本发明所述的玉米mTERF蛋白的突变基因 ZmSmk3及其克隆方法和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但 不限于以下实施例。

实施例1 ZmSmk3突变基因的克隆

ZmSmk3的杂合自交果穗上存在1/4的小粒突变，野生型：突变体符合3:1 (WT:Zmsmk3＝1651:526,p＝0.37)，证明该突变性状受隐性单基因控制。 用CTAB法提取10株纯合突变体(编号：RS1-RS10)和5株纯合野生型(编 号：RW1-5)植株叶片DNA，测定浓度后，全部稀释为50ng/ul，分别将RS1-5、 RS4-8和RS6-10等量混合，构建了3个纯合突变体DNA池；RW1-5等量混 合构建一个野生型DNA池，四个混池分别作为后续PCR反应的模板。

利用热不对称交错PCR，即利用表5中mu转座子末端序列的特异引物 TIR9-1、TIR9-2以及随机引物进行扩增，具体扩增方法参考文献：刘文婷， 2006；Settles etal.,2004。具体的热不对称交错PCR反应体系和程序如表1、 表2、表3和表4所示。第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，以胶回 收试剂盒(OMEGA kit D2500-01)回收突变体混池均存在的特异条带，将回 收产物连接到pGEM-T Vector(Promega Kit)上，并转化到Trans 5a，过夜 培养后，以pGEM-T Vector上存在的通用引物M13F/R为PCR扩增引物进行 菌落PCR，琼脂糖检测，挑选片段大小正确的克隆进行测序获得突变基因 Zmsmk3的序列，具体序列如Seq ID No.1所示。在W22背景下对基因以及启 动子区域扩增测序，结果显示：和参考基因组相比，仅在启动子区存在一处 SNP。进一步通过测序确定该插入位点位于GRMZM2G177019的启动子区， 距离起始密码子44bp(结构如图3所示)。利用RACE技术，从W22中分离 ZmSmk3的全长cDNA，在5’端比B73注释序列长出11bp，3’端和注释信息一 致。

表5mu转座子末端序列的特异引物TIR9-1、TIR9-2以及随机引物序列

实施例2突变基因Zmsmk3在玉米单株中的检测

将突变基因Zmsmk3的序列与玉米基因组作比对，找出特异片段对应的基 因组位置。以匹配位置的插入位点为中心，设计引物与TIR6组合检测单株基 因型。若基因型与表型共分离则该位点插入的基因即为候选基因，进一步扩 大群体验证。本文采用的鉴定共分离的引物为S21F/R。其核苷酸序列：

S21F:GGAGGAGCTGGTGTAGATCG

S21R:TACGTGCCAGATTTGATGCT

TIR6AGAGAAGCCAACGCCAWCGCCTCYATTTCGTC

基因型检测以S21F/R，S21F+TIR6，S21R+TIR6，三对引物检测每一单 株的基因型。若某一单株三对引物的扩增条带只有S21F/R有相应PCR产物， 则该单株对应的基因型为野生型；若三对引物扩增均有条带，且大小正确， 则该单株为杂合型；而扩增条带只存在于后两对引物时，该单株为纯合突变 型。

2015年海南播种群体，检测播种群体各单株中是否存在突变基因Zmsmk3。

单株DNA的提取采用CTAB法，具体步骤：

1.在研钵中加入700μL CTAB(83.5mM Tris-HCl，pH 8.0，16.7mM EDTA pH 8.0，1.17MNaCl，1.67％CTAB)，取适量新鲜幼嫩叶片于冰上研磨至匀浆， 转移至2mL的离心管中；

2.65℃水浴40min，期间颠倒混匀几次；

3.冷却至室温后，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1，V/V)，轻摇混匀15min 左右后，12000rpm离心10min；

4.取200μL上清至另一新的1.5mL离心管中，加入二倍体积的冰乙醇， 轻摇混匀后静置30min；

5.12000rpm离心10min，弃上清。用75％的乙醇洗沉淀2次；

6.离心去上清，室温放置干燥后，加入100μL ddH2O溶解，-20℃保存备用。 PCR反应体系如表6所示，反应程序如表8所示。

表6检测单株突变基因Zmsmk3的PCR反应体系

表8检测单株突变基因Zmsmk3的PCR反应程序

检测单株基因型PCR扩增结果采用琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图4所示：RN62，RN63，RN64，RN67为杂合单株，RN61，RN65， RN66为野生型。每一单株对应的三条泳道的检测引物依次为：S21F/R， S21F+TIR6，S21R+TIR6。

实施例3 ZmSmk3基因的表达分析和亚细胞定位

利用qRT-PCR分析ZmSmk3基因在玉米各组织的表达情况。ZmSmk3是 组成型表达基因，在所有营养生殖和有性生殖的组织里，ZmSmk3基因都有 表达，表达量相对较高的组织茎秆、雌穗、子房和胚；表达量较低的是根、 叶、雄穗、花丝和胚乳，结果如图5A所示：qRT-PCR检测ZmSmk3在根、茎、 叶、雄穗、雌穗、花丝、子房及15DAP的胚和胚乳中的表达。这个结果表明 ZmSmk3基因在植物的生长发育的各个阶段和各种组织内组成型表达。同时 在授粉后15天的种子中检测到ZmSmk3基因在突变体中的表达量下降(结果 如图5B)。

将该基因连接到含有GFP标签的亚细胞定位载体pM999中，转化玉米原 生质体，观察其定位信号。实验证明ZmSMK3蛋白定位于线粒体，结果如图 5C所示，图5C中玉米黄化叶片原生质体中瞬时表达ZmSMK3：GFP融合 蛋白的荧光信号。线粒体用Mito-Tracker(红色)标记。绿色荧光信号和红色荧 光信号叠加(merge)可以形成黄色信号。Scale bar＝10μm。确定ZmSMK3在 线粒体中发挥作用。

具体操作步骤如下：

Trizol法提取植物基因组RNA、RNA纯化及反转录

Trizol法提取植物基因组RNA

1.液氮充分研磨样品，每1.5ml离心管分装0.1g样品，立刻加入1ml Trizol(Invitrogen),迅速混匀，室温静置10min。

2.加200ul氯仿，剧烈摇荡30s，室温静置15min；

3.4℃，12000rpm离心15min，转移上清至新离心管，加入2/3体积的异丙 醇，轻轻颠倒混匀，4℃沉淀2h(或-80℃沉淀30min)。

4.4℃，12000rpm离心15min，弃上清，加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制) 清洗RNA，

震荡片刻后(使沉淀悬浮)12000rpm离心5min,小心弃上清；

5重复4的操作；

6室温静置5-15min,使RNA沉淀恰好干燥，加入40ul DEPC水溶解,-80℃ 超低温冰箱保存。

总RNA纯化

1.向总RNA中依次加入4μL 10×buffer，4μL DNaseⅠ(1U/μL)，1μL RNA inhibitor(40U/μL)，补充DEPC-H2O至40μL；

2.37℃水浴锅水浴30min；

3.加入2.5μL EDTA(25mM)，80℃水浴2min；

4.加入核酸助沉剂4μL，2min后加入冰乙醇250μL，混匀后于-80℃静置 20-30min；

5.12000rpm，4℃离心5min，弃上清；

6.75％乙醇洗涤后干燥透明，加入40μL DEPC-H2O溶解。

7.测定总RNA的浓度。

反转录体系及程序

1.在离心管中依次加入1μg纯化后RNA(约3μL)，1μL dNTP(10mM each)，1μLoligodT primer(50μM)，7μL RNase free H2O；

2.65℃水浴5min，冰上骤冷；

3.向上述反应中加入4μL 5×PrimeScript Buffer，2μL 0.1M DTT，1μL RNAinhibitor(40U/μL)；

4.37℃处理2min；

5.室温下加入1μL M-MLV逆转录酶；

6.37℃反应50min；

7.70℃反应15min使酶失活，产物即为cDNA。

qRT-PCR(Quantitative real time PCR)

将上述cDNA稀释10倍左右，直接用作qRT-PCR的模板。

表9 qRT-PCR的反应体系如下

表10 qRT-PCR的反应程序

亚细胞定位

参考(Liu et al.2013)

1.载体构建

1)以引物ZmSmk3-Kpn1-F及ZmSmk3-Xba1-R，高保真酶PCR扩增ZmSmk3 全长CDS，且引物两端的酶切位点分别为Kpn1和Xba1；

ZmSmk3-Kpn1-F:ACGGTACC ATGGCCACCACCACATCTC

ZmSmk3-Xba1-R:GTTCTAGA TTTCAGTGATCCCACGAGAGACT

2)以Kpn1和Xba1酶切上述PCR产物及pM999，琼脂糖凝胶电泳检测并胶 回收该酶切产物；

3)以T4Ligase连接ZmSmk3全长CDS的酶切产物及线性化的pM999质粒， 转化大肠杆菌；

4)挑取单克隆菌斑，PCR鉴定后送公司测序；

5)比对测序结果，选取正确的单克隆，摇菌扩繁提取质粒，即可用于原生质 体转化。

2.玉米原生质体分离及PEG转化

1)玉米种植：取B73种子种植在营养土中，营养土提前加水拌匀，控制湿度， 于生化培养箱28℃黑暗培养8-10天。

2)配制酶解液：

20mM MES(pH5.7)+1.5％(wt/vol)Cellulase R10+0.4％(wt/vol)MacerozymeR10+0.4M Mannitol+20mM KCl，55℃水浴10min，以失活DNA酶和蛋白 酶。室温冷却后，加入10mM CaCl₂和0.1％BSA，充分混匀后酶解液应该是>

3)挑取健康、长势良好的叶片，一般取第二片叶中间靠上端位置，在0.4MMannitol的环境中切成0.5-1mm宽的细丝(注意要用锋利的刀片，不能撕， 最好一个刀片切4-5片叶子后就换新的)。

4)切好的叶片立即放入酶解液中，使叶片完全浸没在酶解液里，切完之后于 黑暗中抽真空30min。

5)静置避光酶解3-4h后，再于40rpm摇床上避光酶解30min。不同材料所需 酶解时间不同，要摸索。

6)加入等体积的W5溶液(2mM MES(pH5.7)+154mM NaCl+125mM CaCl₂>2O定容至20ml)终止酶解反应，用50ml注射器(去掉>

7)加速减速设为2档，4℃，100g离心8min。

8)小心吸出上清弃去，视原生质体数目用适量的预冷W5溶液重悬原生质体 (至原生质体数目大约为2×10⁵mL^–1)，冰上静置原生质体30min。

9)经重力作用，原生质体应沉淀于是管底部。尽可能吸出上清弃去，用室温 保存的MMG溶液(4mM MES(pH5.7)+0.4M Mannitol+15mM MgCl₂)重悬>5mL^–1。

PEG/Ca²⁺介导原生质体转化(室温操作)

10)将质粒(5-10kb)浓度调至1-1.5ug/ul，取20ul质粒至2ml离心管中(两 种质粒共转化则各取10ul)。

11)每次操作一管：加200ul原生质体与质粒混匀，再加入220ul PEG/ Ca²⁺(20-40％(wt/vol)+0.2M>2)，立即轻柔颠倒混匀，室温>

12)加入800ulW5溶液，轻柔颠倒混匀，终止反应。

13)室温下100g离心2min，小心弃去上清，用1ml WI溶液(4mM MES(pH5.7) +0.5MMannitol+20mM KCl)重悬原生质体，室温下培养12-24h。

14)100g离心2min收集原生质体，剩余100-200ul液体重悬制片，Confocol 观察。

实施例4突变基因ZmSmk3的功能分析

ZmSMK3影响线粒体基因nad4及nad1内含子的剪切

对线粒体基因进行表达分析采用RT-PCR的方法检测35个线粒体编码基 因在野生型和ZmSmk3突变体中的表达。同时利用RT-PCR的方法检测线粒体 tRNA及rRNA编码基因在野生型和ZmSmk3突变体中的表达。

结果如图6和7所示，图6为RT-PCR检测35个线粒体编码基因在野生 型和ZmSmk3突变体中的表达。图7为RT-PCR检测线粒体tRNA及rRNA 编码基因在野生型和ZmSmk3突变体中的表达。每个胶图左边的泳道是野生 型，右边的泳道是ZmSmk3。RNA的提取来源于野生型和突变体15DAP去种 皮的籽粒，3次生物学重复，表达量以ZmActin(GRMZM2G126010)为内参。

根据图6和图7可以看出：大多数的线粒体基因在野生型和突变体中表 达量没有差异，某些线粒体tRNA在突变体中的表达量高于野生型。而线粒体 基因nad4在突变体中有大量前体mRNA积累，nad1在突变体中的表达量较 野生型严重下降。检测引物的位置分别在靠近起始密码子和终止密码子的 5’UTR(Untranslated Regions)和3’UTR。表明ZmSMK3是线粒体基因nad4 及nad1正常表达所必需的。

图8为线粒体基因内含子剪切效率分析图：RT-PCR检测含内含子的线粒 体基因在野生型和ZmSmk3突变体中的表达。引物设计在相邻两外显子上。 对于每个内含子的检测胶图，两条泳道依次为：野生型、Zmsmk3。

图9为qRT-PCR检测22个线粒体内含子在野生型和Zmsmk3突变体中的 剪切效率。RNA的提取来源于野生型和突变体15DAP去种皮的籽粒，3次生 物学重复，表达量以ZmActin(GRMZM2G126010)为内参。

已知玉米线粒体nad4包含3个内含子，nad1包含4个内含子(Clifton et al.,2004)。通过RT-PCR检测nad4及nad1的剪切效率发现，nad4 intron1及 nad1 intron4的剪切效率明显降低。qRT-PCR也得到同样的结果。证明 ZmSmk3是nad4 intron1及nad1intron4正常剪切所必需的。

ZmSMK3影响线粒体复合体Ⅰ的形成

线粒体复合体的分离及复合体Ⅰ的活性分析

参考(Meyer et al.,2009；Keren et al.,2012).

线粒体复合体的分离(BN-PAGE)

1.取新鲜的12DAP的玉米籽粒，去种皮，于冰上研磨，研磨过程中加入 提取缓冲液(0.3M sucrose,5mM tetrasodium pyrophosphate(Sigma, 221368-100g),10mM KH₂PO₄,pH7.5,2mM>

2.将研磨好的匀浆用双层神奇滤布过滤至50mL离心管，4℃3,000g离 心5min，取上清。在于4℃20,000g离心10min，得到沉淀即为线粒体粗提 物。

3.用洗脱缓冲液(0.3M sucrose,1mM EGTA,and 10mM MOPS/KOH,pH 7.2)重悬沉淀，并将重悬液转移至2mL离心管，20,000g离心5min。重复 一次。

4.用ACA缓冲液1(750mM amino caproic acid(Sigma,A2504-25g),0.5 mM EDTA,and 50mM Tris-HCl,pH 7.0)重悬3所得的沉淀，转移至1.5mL离 心管，20,000g离心5min。

5.再次加入ACA缓冲液1，对提取的线粒体蛋白定量，根据上样个数取 部分线粒体蛋白用于增溶。将用于上样的蛋白加入ACA缓冲液2(1-2％[w/v] β-DM(Sigma,D4641-1g),750mM amino caproic acid(Sigma,A2504-25g),0.5 mM EDTA,and 50mM Tris-HCl,pH7.0)，冰上孵育30min。

6.对5增溶后的蛋白定量进行上样。(预制梯度胶，上样试剂盒选用 Invitrogen公司产品)

复合体Ⅰ的活性分析

从BN胶上切下用于检测活性的胶条置于活性染色缓冲液(25mg ofnitrotetrazolium blue(NTB,Sigma N6876-250mg)and 100ul of NADH(Sigma, N8129-100mg)(10mg/ml)added to 10ml of 5mM Tris/HCl,pH 7.4)，3-5min 即显色。固定液[40％甲醇/10％醋酸(v/v)]用于终止染色反应。

NAD1是复合体Ⅰ的中心亚基，nad1表达量的降低很可能会影响复合体 Ⅰ的组装，稳定性及活性。通过BN-PAGE(Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis)及活性检测线粒体复合体发现(图10A和图10B)，突变体 中复合体Ⅰ的积累量及活性下降，从而证明，ZmSMK3是通过影响nad4及 nad1的剪切来调控线粒体复合体Ⅰ的组装，ZmSMK3的突变体缺失导致复合 体Ⅰ的积累量及活性下降。

同时，对交替呼吸途径中交替氧化酶AOX1，AOX2，AOX3的表达分析得 出，突变体中AOX2明显高于野生型；AOX1，AOX3的表达量也高于野生型 (图10C和图10D)。表明Zmsmk3的突变导致交替氧化酶途径中交替氧化 酶的上调表达。

对野生型与突变体10DAP胚乳进行透射电镜观察发现，野生型中线粒体 结构完整，脊排布整齐致密且形态完整，而突变体线粒体结构不完整，脊的 排布松散，结构不完整，出现空泡化(图10E和图10F)。推测线粒体结构 的缺陷可能不能够为生命活动提供充足的能量。

根据上述实验得出结论对应于图10A～F：

(A)突变体的复合体I的积累降低。12DAP的野生型及突变体去种皮的籽粒 用于线粒体复合体的提取，3-12％的BN-PAGE用于线粒体复合体的分离。图 中标注了线粒体复合物I、复合物V和超级复合物III的位置。

(B)复合物I的NADH脱氢酶活性降低。通过二氢硫辛酰胺脱氢酶(dihydrolipoamide dehydrogenase，DLDH)的活性染色来控制等量上样。

(C)RT-PCR检测AOX1 AOX2及AOX3在野生型及Zmsmk3突变体中的表达。 RNA的提取来源于野生型和突变体15DAP去种皮的籽粒，表达量以ZmActin (GRMZM2G126010)为内参。

(D)qRT-PCR检测AOX1AOX2及AOX3在野生型及Zmsmk3突变体中的表 达。

(E-F)电镜观察野生型(E)及Zmsmk3突变体(F)中线粒体结构。线粒体如箭头 所指，scalebars＝0.5μm。

综上的实验结果表明，Zmsmk3的突变体导致nad4及nad1不能够正常 剪切，复合体Ⅰ的积累量及活性下降，线粒体结构不完整，使得氧化磷酸化 途径受阻。在能量供应不足的情况下，交替氧化酶途径被激活，交替氧化酶 的在突变体中的表达量上升。因此在玉米籽粒上表现出小粒现象。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种编码玉米mTERF蛋白的基因ZmSmk3及其克隆方法和应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1776

<212> DNA

<213> maize

<400> 1

acagagggaa aagagagagt atctgatatt ctgatcatgg ccaccaccac atctccagtt 60

ctcctcggtc ctcgccgcgg cgccggcatg tctctcgctc tccaagccct ccgccgcagc 120

cgccccctcg tcgggttcct cccccactcc tcccctctct ccacctcagc ctcacctccc 180

gacgcccacg agctcctccg cattgaccgc atcctaacca accccgccgc cggcggcggc 240

ggcagcctac cctcgcaatc ccaacaacac ccacgcgccg ccaccgatct acaccagctc 300

ctccgccgcg ccgccggcct caccgcagcg gagtccgcct ccctcctccg ccgcctccct 360

ggcgcccagc cccacccccg cctgggccgc ctcctccagg agctcgcggg cctcggcctc 420

cctaggggcg aagtcaaggc cgccctggcg tccgaccagg aaggtctcct ctccatggac 480

cccggcgaac cgtcccggct cctcgacctc ctgcgcgacc tccggtgccg ggaggcggtg 540

agggaccgga tcctcgctca cggcgctctc cgcgccgccg tcgccgcccg gcggcgggtg 600

gagctcctcc acgcgcgcgg gctgtcccgc cacgacgccc tgcgtgtgct cgccgccgag 660

ccgcggacga tgctgtactc gccggaggac gtggagagga agctggagtt cttggtggaa 720

acaatggggt ttgaggtcgg ctggctagtg cagtacccgg agttcctggg cgtgaacctg 780

gacaggtgga tcatcccgcg gcacaatgtg gtggagcacc tgaaatccgt cggcgggctc 840

ggagaccccg ttgaaatgaa gcactatgtg aggctcaccc gcaggaggtt ttacaacatg 900

tttgtgaagc cgtaccctga gtgtgagagg atatttgggg gcctggtcag ggagagggac 960

gagatggcga ggcggcgcca tccggctggg ctatggaaac tgtttaagcc agcgaagcat 1020

gagaggactc aggaggatgt gcagaacatg aagtctctcg tgggatcact gaaatgagta 1080

atgttatgcc caagggaaca ttggtggtct caaacaacag caaatgctga accaatgatg 1140

tattgtgatc tttcgcttat gcacggatac cccagactag ttctgataac caagaaggac 1200

catttgagaa tttcatgttt gaggtgacat gctagggcgc gaagaggtgt gggtggtgtt 1260

gtgaaaccat aactgttcat gaagtgcttg tgtggtgaca gaagtggcag ttattctgaa 1320

cggacataga tcatgttcaa tattctcaaa aatatcttgc taaggcattt caccgcagat 1380

tgcaagatta aaatttgagc aattctagta ttctgatcag catttctttc actggagagt 1440

agcagataac aagttcagga aatctggcag ctgatggaat ggttacctca agatttcgat 1500

gggatggata gagcagcagc agaagctcat tgcatatttt cttttgagaa atttatgatg 1560

atcagaagat tctgctcaga agatgagcgt gctaatttaa tacagaaatg ttttcttgtg 1620

tgtacatcgt ggcactggtt agtttagaga catttcgctg ctttctattg tttagtgtta 1680

tgtgattacc ttcttacatt cttgttcaac actagtgtaa ttcattattc atgacttctt 1740

tattggtgca tcttaaaaaa aaatattgca tttata 1776

<210> 2

<211> 346

<212> PRT

<213> maize

<400> 2

Met Ala Thr Thr Thr Ser Pro Val Leu Leu Gly Pro Arg Arg Gly Ala

1 5 1015

Gly Met Ser Leu Ala Leu Gln Ala Leu Arg Arg Ser Arg Pro Leu Val

202530

Gly Phe Leu Pro His Ser Ser Pro Leu Ser Thr Ser Ala Ser Pro Pro

354045

Asp Ala His Glu Leu Leu Arg Ile Asp Arg Ile Leu Thr Asn Pro Ala

505560

Ala Gly Gly Gly Gly Ser Leu Pro Ser Gln Ser Gln Gln His Pro Arg

65707580

Ala Ala Thr Asp Leu His Gln Leu Leu Arg Arg Ala Ala Gly Leu Thr

859095

Ala Ala Glu Ser Ala Ser Leu Leu Arg Arg Leu Pro Gly Ala Gln Pro

100 105 110

His Pro Arg Leu Gly Arg Leu Leu Gln Glu Leu Ala Gly Leu Gly Leu

115 120 125

Pro Arg Gly Glu Val Lys Ala Ala Leu Ala Ser Asp Gln Glu Gly Leu

130 135 140

Leu Ser Met Asp Pro Gly Glu Pro Ser Arg Leu Leu Asp Leu Leu Arg

145 150 155 160

Asp Leu Arg Cys Arg Glu Ala Val Arg Asp Arg Ile Leu Ala His Gly

165 170 175

Ala Leu Arg Ala Ala Val Ala Ala Arg Arg Arg Val Glu Leu Leu His

180 185 190

Ala Arg Gly Leu Ser Arg His Asp Ala Leu Arg Val Leu Ala Ala Glu

195 200 205

Pro Arg Thr Met Leu Tyr Ser Pro Glu Asp Val Glu Arg Lys Leu Glu

210 215 220

Phe Leu Val Glu Thr Met Gly Phe Glu Val Gly Trp Leu Val Gln Tyr

225 230 235 240

Pro Glu Phe Leu Gly Val Asn Leu Asp Arg Trp Ile Ile Pro Arg His

245 250 255

Asn Val Val Glu His Leu Lys Ser Val Gly Gly Leu Gly Asp Pro Val

260 265 270

Glu Met Lys His Tyr Val Arg Leu Thr Arg Arg Arg Phe Tyr Asn Met

275 280 285

Phe Val Lys Pro Tyr Pro Glu Cys Glu Arg Ile Phe Gly Gly Leu Val

290 295 300

Arg Glu Arg Asp Glu Met Ala Arg Arg Arg His Pro Ala Gly Leu Trp

305 310 315 320

Lys Leu Phe Lys Pro Ala Lys His Glu Arg Thr Gln Glu Asp Val Gln

325 330 335

Asn Met Lys Ser Leu Val Gly Ser Leu Lys

340 345

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atagaagcca acgccatggc ctccatttcg tc 32

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcctccatt tcgtcgaatc cct 23

<210> 5

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gvctycgwss gc 12

<210> 6

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ntcagstwts gwgwt 15

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agwghagsah cadaas 16

<210> 8

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

wtccasntgs nacg 14

<210> 9

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcngnwcgwc gwg 13

<210> 10

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtantcgwaw ncst 14

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gwwggtscwa swctg 15

<210> 12

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> modified_base

<222> (3)..(3)

<223> i=肌苷

<400> 12

gwsdramsct gctc 14

<210> 13

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gkykgckgcn gc 12

<210> 14

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gngwsastng agc 13

<210> 15

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gtgasntgsw atgg 14

<210> 16

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gscncsgwnc c 11