一种提高喜树碱在嵌段共聚物胶束中载药量的方法

摘要

本发明公开了一种提高喜树碱在嵌段共聚物胶束中载药量的方法。首先使用胱胺对喜树碱进行改性，然后将改性后的喜树碱与制备的PCL‑PEG‑PCL三嵌段共聚物制备成载药胶束。通过该种方法提高了疏水性喜树碱的水溶性，其包封率可由改性前的10％提高到60～80％，载药量从1％提高到7％～8％。另外，由于胱胺中含有的二硫键可以被肿瘤细胞内含量较高的GSH所剪切断裂促进喜树碱的释放，故该传递系统还具有响应释放的作用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药组合物，特别涉及用于治疗恶性肿瘤的药物组合物，本发明还涉及该中药组合物的制备方法及其制剂。本发明涉及一种提高喜树碱在嵌段共聚物胶束中的载药量的方法，同时赋予该载药系统GSH响应释放的性能，具体涉及一种用带有二硫键的胱胺对喜树碱进行的改性，用PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物胶束将其包载的方法。

背景技术

喜树碱是一种从植物中提取出来的疏水性抗癌药物，其对多种动物肿瘤有抑制作用，对肠胃道和头颈部癌症等有较好的效果，且与常用抗肿瘤药物无交叉耐药性。二硫键在生物化学领域中通常指在肽和蛋白质分子中的半胱氨酸残基中的键。还原性物质谷胱甘肽(GSH)、二硫苏糖醇等化合物可以将二硫键还原成巯基(-SH)基。由于肿瘤细胞内部的GSH含量较高，故含有二硫键的药物载体可以在肿瘤细胞内响应释放药物。两亲性嵌段共聚物是指同一高分子中既含有亲水链段又含有疏水链段，对水相和油相都具有亲和作用的特殊聚合物。两亲性嵌段共聚物可以自组装形成胶束，将疏水药物包裹在胶束的空腔中可以提高疏水性药物在溶液中的浓度。通过改变嵌段共聚物各链段的分子量、嵌段共聚物浓度及药物浓度等参数，可调控胶束的大小、结构、形状及其聚集数，从而使其广泛应用于生物化学、材料制备和分离净化等诸多领域。

由于胶束在提高疏水性药物水溶性方面具有较大的优势，所以其在生物医药方面具有广泛的应用。Wang等(Biomacromolecules,2008,9,388-395)采用分子量为15000-4000-15000的PEG-PCL-PEG三嵌段共聚物包载未改性的喜树碱，当药物和嵌段共聚物的比例为15:200时，药物的载药量为6.1±0.18％，包封率为85.7±0.1％；彭晶晶在毕业论文《HPLC法测定羟基喜树碱PEG-PCL聚合物胶束的包封率》中报道了当药物和嵌段共聚物的比例为1:10时，羟基喜树碱在PEG-PLA嵌段共聚物中的载药量为3.63％，包封率为36.3％。，但是以上方法所制备的载药胶束要么载药量低，要么没有响应释放的功能，这都限制了其在抗肿瘤领域的应用。

发明内容

本发明的目的在于解决上述背景技术中存在的不足，通过对喜树碱进行改性，然后将改性后的喜树碱与嵌段共聚物制备成载药胶束，从而达到提高其在药物传递系统中载药量的方法，且载药系统中二硫键的引入赋予了药物载体对肿瘤细胞中高浓度GSH响应释放药物的效果。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种提高喜树碱在嵌段共聚物胶束中载药量的方法，包括使用胱胺对喜树碱进行改性，然后将改性后的喜树碱与嵌段共聚物制备成载药胶束。

所述嵌段共聚物为PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物。

更优的，所述提高所述喜树碱在嵌段共聚物胶束中载药量的方法，包括如下步骤：

S1、喜树碱的胱胺改性

S1-1、以N,N-二异丙基乙胺和4-二甲氨基吡啶为催化剂，将过量三光气加入到胱胺二盐酸盐溶液中，反应后三光气的一端接到胱胺二盐酸盐上，生成胱胺中间体；然后向所述胱胺中间体中加入喜树碱，通过取代反应将喜树碱接到胱胺中间体的两端，生成改性喜树碱——喜树碱-胱胺化合物粗产物；

S1-2、将得到的喜树碱-胱胺化合物粗产物进行层析硅胶柱纯化处理，得到改性喜树碱纯化产物；

S2、嵌段共聚物制备

S2-1、取聚乙二醇(PEG)加入到无水甲苯当中，80-90℃下搅拌1-1.5小时后得混合溶液，然后取己内酯和异辛酸亚锡加入到混合溶液中，120-130℃下搅拌12-15小时，得粗产物；

S2-2、对步骤S2-2制备的粗产物进行蒸馏，将粗产物倒入50mL单口瓶中，30℃、80r/min转速下进行减压蒸馏，除掉甲苯，然后用冷乙醚将产物沉淀出来，得到PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物；

S3、载药胶束制备

取步骤S1制备的喜树碱-胱胺化合物和步骤S2制备的PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物，将其混合，超声溶解于二氯甲烷中，旋蒸1.5-2.5小时彻底除掉溶剂后逐滴加入蒸馏水，超声得到载药胶束。

所述步骤S1中加入的N,N-二异丙基乙胺、4-二甲氨基吡啶、三光气、胱胺二盐酸盐、喜树碱的质量配比为(0.5-2)：(0.5-2)：(0.2-1)：(1-3)：1。

所述步骤S1中胱胺二盐酸盐为经过氢氧化钠处理过的胱胺二盐酸盐。

所述氢氧化钠处理胱胺二盐酸盐方法为：精确称取氢氧化钠1.6g，胱胺二盐酸盐4.5g，混合加入盛有50mL四氢呋喃的100mL单口烧瓶中，室温条件下磁力搅拌48h；搅拌结束后过滤除掉固体产物后，在30℃、80r/min条件下旋蒸除掉溶剂，即得所需胱胺二盐酸盐。

所述步骤S1-2中将喜树碱-胱胺化合物粗产物进行层析硅胶柱纯化处理的条件为：流动相为氯仿：甲醇＝(6-8):(2-4)(体积比)；填料为柱层层析硅胶；温度为室温。

所述步骤S2-1中加入的聚乙二醇、甲苯、己内酯、异辛酸亚锡的质量配比为(1-3)：(20-40)：2：(0.01-0.03)。

所述步骤S2-2中对制备的粗产物进行蒸馏的条件为：将粗产物倒入50mL单口瓶中，30℃、80r/min转速下进行减压蒸馏。

所述步骤S2制备的PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物的分子量为5000-7000，其中PCL链段的分子量与PEG链段的分子量的比值为1.5-3。

所述步骤S3中加入的喜树碱-胱胺化合物、PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物、二氯甲烷的配比为(1-8)：10：250。

一种粒径在40～60nm的球形结构载药胶束。

本发明相对于现有技术具有如下有益效果：

(1)本发明以胱胺为中间体，将喜树碱接到胱胺两端以提高其在PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物胶束中的载药量，提高其水溶性，其包封率可由改性前的10％提高到60～80％，载药量从1％提高到7％～8％。另外，由于胱胺中含有的二硫键可以被肿瘤细胞内含量较高的GSH所剪切断裂促进喜树碱的释放，故该传递系统还具有响应释放的作用。

(2)本发明提供的喜树碱改性方法选取三光气为中间体，用胱胺对其进行改性，首先用过量的三光气与胱胺反应，这样可以使三光气的一端在催化剂的作用下接到胱胺上，另一端处于待反应状态；待反应一端在催化剂的作用下与喜树碱进行反应，即得到粗产物。随后将粗产物用层析硅胶柱进行分离提纯，得到改性喜树碱纯化产物。由于喜树碱上的官能团为羟基，胱胺上的官能团为氨基，三光气上的两个三氯甲基可以同时与羟基、氨基进行反应，自身作为中间体将喜树碱接到胱胺的两端。该方法操作简单、反应效率高。

(3)本发明通过熔融法制备的载药胶束粒径为40-60nm的纳米颗粒，从而使得载药胶束可以通过被动靶向作用富集于肿瘤组织。

附图说明

图1为实施例1所用的实验原理流程图；

图2为实施例1所得的改性前后载药胶束的光学照片；

图3为实施例1所得的载药胶束的透射电镜图；

图4为实施例1所得的载药胶束的DLS粒径分布图；

图5为实施例1所得的紫外谱图；

图6为实施例1所得的高效液相色谱标准曲线图；

图7为实施例1所得的高效液相色谱载药胶束样品曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的实施方式作进一步地详细描述。本发明可以以许多不同的形式实施，而不应该被理解为限于在此阐述的实施例。相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。

实施例1

本实施例的提高喜树碱在PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物中载药量的方法，包括下述步骤：

S1、喜树碱的胱胺改性

S1-1、取N,N-二异丙基乙胺0.5g、4-二甲氨基吡啶0.5g，以上述两种物质为催化剂，将1g三光气加入到含胱胺二盐酸盐3g的胱胺二盐酸盐溶液中，反应后三光气的一端接到胱胺二盐酸盐上，生成胱胺中间体；然后向所述胱胺中间体中加入喜树碱1g，通过取代反应将喜树碱接到胱胺中间体的两端，生成改性喜树碱——喜树碱-胱胺化合物粗产物；

S1-2、将得到的喜树碱-胱胺化合物粗产物进行层析硅胶柱纯化处理，得到改性喜树碱纯化产物；

层析硅胶柱纯化处理的条件为：流动相为氯仿：甲醇＝7:3(体积比)，填料为柱层层析硅胶，温度为室温；

S2、嵌段共聚物制备

S2-1、取2g聚乙二醇(PEG)加入到20g无水甲苯当中，80-90℃下搅拌1-1.5小时后得混合溶液，然后取2g己内酯和0.03g异辛酸亚锡加入到混合溶液中，120-130℃下搅拌12-15小时，得粗产物；

S2-2、对步骤S2-2制备的粗产物进行蒸馏，将粗产物倒入50mL单口瓶中，30℃、80r/min转速下进行减压蒸馏，除掉甲苯，然后用冷乙醚将产物沉淀出来，得到PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物；

S3、载药胶束制备

取步骤S1制备的喜树碱-胱胺化合物0.01g和步骤S2制备的PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物0.1g，及二氯甲烷3mL加入到50mL单口烧瓶内，将其混合，超声溶解后，旋蒸2小时彻底除掉溶剂；向单口烧瓶内加入10mL蒸馏水超声溶解得到载药胶束；将得到的胶束冷冻干燥待用；

S4、载药量及包封率的测定

S4-1、将改性前的喜树碱用甲醇配成不同浓度的溶液，以C18商品柱为样品柱，用高效液相色谱测定其在265nm的吸收峰，制成喜树碱的标准曲线；

S4-2、取步骤S3冷冻干燥好的胶束样品0.01g超声溶解于10mL溶度为0.05mol/L的DTT水溶液中，搅拌两小时后，取样品0.3μL用高效液相色谱测定其在265nm处的吸收峰，与S4-1中的标准曲线进行比较，计算胶束的包封率和载药量。

图1给出了施例1所用的实验原理流程图，包括喜树碱的重氮树脂改性、PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物合成以及载药胶束制备。首先将被DIEA活化的胱胺二盐酸盐，缓慢滴入到被DMAP活化的三光气中，在亲核试剂DMAP的Nu作用下三光气的三氯甲基与胱胺两端的氨基反应，由于三光气始终处于过量状态，所以胱胺的两端都接枝上三光气。三光气的另一端与接下来加入的喜树碱的羟基进行反应，即达到将喜树碱连接到胱胺两端的目的。

PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物的合成则采用己内酯在PEG为引发剂、异辛酸亚锡为催化剂的条件下开环聚合，得到两亲性的PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物。

图2为实施例1所得的改性前后载药胶束的光学照片，a图为嵌段共聚物包载未改性喜树碱的效果图，b图为嵌段共聚物包载改性喜树碱的效果图。从图中可以看出，未改性的胶束呈浑浊状态，且静置会发生沉降，而改性之后的喜树碱呈乳液状态，较稳定，静置不会发生沉降，即未改性的喜树碱在嵌段共聚物中的包封率明显低于改性之后的喜树碱。

图3为实施例1所得的载药胶束的透射电镜图，从图中可以看出载药胶束的粒径为40-60nm左右，且粒径分布较为均一。

图4为实施例1所得的载药胶束的DLS粒径分布图，从图中可以看出载药胶束的粒径为40-60nm左右，且粒径分布较为均一。

图5为实施例1所得载药胶束的紫外谱图，从图中可以看出嵌段共聚物在220、280处有吸收峰，在360处没有吸收峰。改性后的喜树碱在220、280和360处都有吸收峰。而载药胶束在220和280处的吸收峰都得到加强，360处也有吸收峰，由此可以看出改性之后的喜树碱被成功包载到胶束内部。

图6为实施例1所得的高效液相色谱标准曲线图，图7为实施例1所得的高效液相色谱载药胶束样品曲线图，对峰积分得到峰面积，与标准曲线的积分结果相比较得到样品中药品的含量，从而计算得到胶束的包封率和载药量，包封率在83％，载药量在8.4％。

实施例2

本实施例的提高喜树碱在PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物中载药量的方法，包括下述步骤：

S1、喜树碱的胱胺改性

S1-1、取N,N-二异丙基乙胺1g、4-二甲氨基吡啶1g，以上述两种物质为催化剂，将0.5g三光气加入到含胱胺二盐酸盐1g的胱胺二盐酸盐溶液中，反应后三光气的一端接到胱胺二盐酸盐上，生成胱胺中间体；然后向所述胱胺中间体中加入喜树碱1g，通过取代反应将喜树碱接到胱胺中间体的两端，生成改性喜树碱——喜树碱-胱胺化合物粗产物；

S1-2、将得到的喜树碱-胱胺化合物粗产物进行层析硅胶柱纯化处理，得到改性喜树碱纯化产物；

层析硅胶柱纯化处理的条件为：流动相为氯仿：甲醇＝7:3(体积比)，填料为柱层层析硅胶，温度为室温；

S2、嵌段共聚物制备

S2-1、取1g聚乙二醇(PEG)加入到30g无水甲苯当中，80-90℃下搅拌1-1.5小时后得混合溶液，然后取2g己内酯和0.02g异辛酸亚锡加入到混合溶液中，120-130℃下搅拌12-15小时，得粗产物；

S2-2、对步骤S2-2制备的粗产物进行蒸馏，将粗产物倒入50mL单口瓶中，30℃、80r/min转速下进行减压蒸馏，除掉甲苯，然后用冷乙醚将产物沉淀出来，得到PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物；

S3、载药胶束制备

取步骤S1制备的喜树碱-胱胺化合物0.02g和步骤S2制备的PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物0.1g，及二氯甲烷3mL加入到50mL单口烧瓶内，将其混合，超声溶解后，旋蒸2小时彻底除掉溶剂；向单口烧瓶内加入10mL蒸馏水超声溶解得到载药胶束；将得到的胶束冷冻干燥待用；

S4、载药量及包封率的测定

取步骤S3冷冻干燥好的胶束样品0.01g超声溶解于10mL溶度为0.05mol/L的DTT水溶液中，搅拌两小时后，取样品0.3μL用高效液相色谱测定其在265nm处的吸收峰，与标准曲线进行比较，计算胶束的载药量，包封率在73％，载药量在7.6％。

实施例3

本实施例的提高喜树碱在PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物中载药量的方法，包括下述步骤：

S1、喜树碱的胱胺改性

S1-1、取N,N-二异丙基乙胺2g、4-二甲氨基吡啶2g，以上述两种物质为催化剂，将1g三光气加入到含胱胺二盐酸盐2g的胱胺二盐酸盐溶液中，反应后三光气的一端接到胱胺二盐酸盐上，生成胱胺中间体；然后向所述胱胺中间体中加入喜树碱1g，通过取代反应将喜树碱接到胱胺中间体的两端，生成改性喜树碱——喜树碱-胱胺化合物粗产物；

S1-2、将得到的喜树碱-胱胺化合物粗产物进行层析硅胶柱纯化处理，得到改性喜树碱纯化产物；

层析硅胶柱纯化处理的条件为：流动相为氯仿：甲醇＝7:3(体积比)，填料为柱层层析硅胶，温度为室温；

S2、嵌段共聚物制备

S2-1、取2g聚乙二醇(PEG)加入到40g无水甲苯当中，80-90℃下搅拌1-1.5小时后得混合溶液，然后取2g己内酯和0.03g异辛酸亚锡加入到混合溶液中，120-130℃下搅拌12-15小时，得粗产物；

S2-2、对步骤S2-2制备的粗产物进行蒸馏，将粗产物倒入50mL单口瓶中，30℃、80r/min转速下进行减压蒸馏，除掉甲苯，然后用冷乙醚将产物沉淀出来，得到PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物；

S3、载药胶束制备

取步骤S1制备的喜树碱-胱胺化合物0.03g和步骤S2制备的PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物0.1g，及二氯甲烷3mL加入到50mL单口烧瓶内，将其混合，超声溶解后，旋蒸2小时彻底除掉溶剂；向单口烧瓶内加入10mL蒸馏水超声溶解得到载药胶束；将得到的胶束冷冻干燥待用；

S4、载药量及包封率的测定

取步骤S3冷冻干燥好的胶束样品0.01g超声溶解于10mL溶度为0.05mol/L的DTT水溶液中，搅拌两小时后，取样品0.3μL用高效液相色谱测定其在265nm处的吸收峰，与标准曲线进行比较，计算胶束的载药量，包封率在69％，载药量在7.3％。

实施例4

本实施例的提高喜树碱在PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物中载药量的方法，包括下述步骤：

S1、喜树碱的胱胺改性

S1-1、取N,N-二异丙基乙胺1g、4-二甲氨基吡啶2g，以上述两种物质为催化剂，将0.5g三光气加入到含胱胺二盐酸盐1g的胱胺二盐酸盐溶液中，反应后三光气的一端接到胱胺二盐酸盐上，生成胱胺中间体；然后向所述胱胺中间体中加入喜树碱1g，通过取代反应将喜树碱接到胱胺中间体的两端，生成改性喜树碱——喜树碱-胱胺化合物粗产物；

S1-2、将得到的喜树碱-胱胺化合物粗产物进行层析硅胶柱纯化处理，得到改性喜树碱纯化产物；

层析硅胶柱纯化处理的条件为：流动相为氯仿：甲醇＝7:3(体积比)，填料为柱层层析硅胶，温度为室温；

S2、嵌段共聚物制备

S2-1、取1g聚乙二醇(PEG)加入到35g无水甲苯当中，80-90℃下搅拌1-1.5小时后得混合溶液，然后取2g己内酯和0.02g异辛酸亚锡加入到混合溶液中，120-130℃下搅拌12-15小时，得粗产物；

S2-2、对步骤S2-2制备的粗产物进行蒸馏，将粗产物倒入50mL单口瓶中，30℃、80r/min转速下进行减压蒸馏，除掉甲苯，然后用冷乙醚将产物沉淀出来，得到PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物；

S3、载药胶束制备

取步骤S1制备的喜树碱-胱胺化合物0.04g和步骤S2制备的PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物0.1g，及二氯甲烷3mL加入到50mL单口烧瓶内，将其混合，超声溶解后，旋蒸2小时彻底除掉溶剂；向单口烧瓶内加入10mL蒸馏水超声溶解得到载药胶束；将得到的胶束冷冻干燥待用；

S4、载药量及包封率的测定

取步骤S3冷冻干燥好的胶束样品0.01g超声溶解于10mL溶度为0.05mol/L的DTT水溶液中，搅拌两小时后，取样品0.3μL用高效液相色谱测定其在265nm处的吸收峰，与标准曲线进行比较，计算胶束的载药量，包封率在61％，载药量在7％。

实施例5

本实施例的提高喜树碱在PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物中载药量的方法，包括下述步骤：

S1、喜树碱的胱胺改性

S1-1、取N,N-二异丙基乙胺2g、4-二甲氨基吡啶1g，以上述两种物质为催化剂，将1g三光气加入到含胱胺二盐酸盐1g的胱胺二盐酸盐溶液中，反应后三光气的一端接到胱胺二盐酸盐上，生成胱胺中间体；然后向所述胱胺中间体中加入喜树碱1g，通过取代反应将喜树碱接到胱胺中间体的两端，生成改性喜树碱——喜树碱-胱胺化合物粗产物；

S1-2、将得到的喜树碱-胱胺化合物粗产物进行层析硅胶柱纯化处理，得到改性喜树碱纯化产物；

层析硅胶柱纯化处理的条件为：流动相为氯仿：甲醇＝7:3(体积比)，填料为柱层层析硅胶，温度为室温；

S2、嵌段共聚物制备

S2-1、取2g聚乙二醇(PEG)加入到20g无水甲苯当中，80-90℃下搅拌1-1.5小时后得混合溶液，然后取2g己内酯和0.01g异辛酸亚锡加入到混合溶液中，120-130℃下搅拌12-15小时，得粗产物；

S2-2、对步骤S2-2制备的粗产物进行蒸馏，将粗产物倒入50mL单口瓶中，30℃、80r/min转速下进行减压蒸馏，除掉甲苯，然后用冷乙醚将产物沉淀出来，得到PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物；

S3、载药胶束制备

取步骤S1制备的喜树碱-胱胺化合物0.05g和步骤S2制备的PCL-PEG-PCL三嵌段共聚物0.1g，及二氯甲烷3mL加入到50mL单口烧瓶内，将其混合，超声溶解后，旋蒸2小时彻底除掉溶剂；向单口烧瓶内加入10mL蒸馏水超声溶解得到载药胶束；将得到的胶束冷冻干燥待用；

S4、载药量及包封率的测定

取步骤S3冷冻干燥好的胶束样品0.01g超声溶解于10mL溶度为0.05mol/L的DTT水溶液中，搅拌两小时后，取样品0.3μL用高效液相色谱测定其在265nm处的吸收峰，与标准曲线进行比较，计算胶束的载药量，包封率在60％，载药量在7.2％。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。