一种用于肠外营养相关性肝病药物的制备方法

摘要

本发明公开了一种用于肠外营养相关性肝病药物的制备方法，将慢病毒包装质粒、包膜表达质粒与干扰表达载体质粒组合成三质粒慢病毒表达系统，然后共转染至包装细胞，经培养后裂解得到肠外营养相关性肝病药物；本发明设计特异性干扰IRE1α基因的shRNA包装成慢病毒，从而高效导入BRL细胞，可实现IRE1α基因稳定的干扰效果，实现肠外营养相关性肝病的缓解、治疗。

说明书

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及一种用于肠外营养相关性肝病药物的制备方法。

背景技术

肠外营养(parenteral nutrition, PN)给不能通过正常肠道方式来满足生长的新生儿带来了革命性关爱。但长时间(＞2周)持续应用PN也存在许多相关问题， 肠外营养相关性肝病 (total parenteral nutrition-associated liver disease, PNALD) 是其中一种最常见的并发症。随着长时间PN的应用，PNALD发生率增加，PNALD具有不同程度的脂肪肝、黄疸，严重者可进展为肝硬化，最终发生肝功能衰竭危及生命。PN应用2周后可看到PNAC组织学证据，6周后可观察到不同程度的纤维化。然而，临床上因肝脏病理检查具有创伤性，不为人们接受，PNALD诊断多依赖生化结果：直接胆红素≥2mg/dL而无引起肝功能紊乱的其他原因。

多年来国内外学者对PNALD的病因、发病机制研究很多，但确切病因及发病机制仍尚不明确。人们对PN营养液中脂肪乳成分关注较多，最近研究表明，静脉营养液中的脂肪乳剂会导致肝脏脂肪变性、脂肪性肝炎、肝细胞损伤和胆汁淤积等，严重时可引起肝硬化导致肝衰竭。目前针对新生儿PNALD临床上主要治疗措施包括限制肠外营养液中的豆油脂肪乳、鱼油脂肪乳取代豆油脂肪乳和使用豆油脂肪乳和鱼油脂肪乳混合来源的脂肪乳剂等。

虽PNALD已被认识30年以上，但至今仍只有少数被认可的治疗方案。现就近年来临床上有效防治PNALD的一些方法综述如下：

一、预防方案：

1、减少肠外营养的使用时间，尽早开始经口喂养。

尽早开始肠内营养，可恢复粘膜的完整性，最大限度地促进胆汁引流。无法经口喂养的短肠综合征患者，可以尝试缩短PN的持续时间。如果可耐受间断的肠外营养，则可以减少肝脏毒性，而且间断的肠外营养支持更优于持续静脉营养，不仅可以提高肝细胞养分的氧化，同时也可以保护肝细胞免受肠道内毒素的侵袭。然而，在最近的一项研究并不支持此结论，该研究发现极低出生体重儿早期预防性间断应用PN，并没有降低胆汁淤积的发生率。

2、避免高热量碳水化合物、蛋白质和脂类的过度摄入。

ASPEN 指南推荐减少大豆乳化剂量为1g/kg/d。但降低肝酶的同时，也需要体重增加的减轻和缺少脂质引起脑发育的限制的负面影响。最近研究表明：长期限减少脂肪乳剂治疗的婴儿，在2–5岁时的评分在正常范围内。

3、熊去氧胆酸（ursodeoxycholic acid UDCA）

UDCA已被证明可以通过提高亲水性胆汁酸等机制改善和预防肝损伤，同时可减少胆囊胆管增厚及扩张。同时还有直接保护细胞的作用和调节免疫的功能。熊去氧胆酸也可通过抑制外周血单个核细胞中细胞因子的释放，如IL-2，IL-4和IFN-γ等，从而抑制细胞免疫反应。目前已有可靠证据表明接长期肠外营养的婴儿口服UDCA对于阻止胆汁淤积是有效的。最近的一项实验发现口服UDCA的实验组比对照组发生胆汁淤积更晚，但并无证据表明UDCA对于新生儿胆汁淤积症有积极的作用。总之，目前UDCA对于PNALD的预防作用不可确定。

4、导管相关性败血症的预防

肠衰竭性肝病患儿容易受细菌感染患脓毒血症和败血症。人们普遍认为感染的主要原因是由于中心静脉导管的外源性污染和细菌通过“漏”的和张力障碍的肠道易位进入血流。病原体包括革兰氏阴性肠道细菌和革兰氏阳性细菌。细菌过度生长和内毒素血症的动物模型为肝脏和胆道疾病提供了证据。因此，预防菌血症和内毒素血症在预防或治疗IFALD中可能起一定作用。

最近，美国疾病控制预防中心(CDC)有关预防导管相关性败血症的指南提出，清洁导管插入部位用洗必泰葡萄糖酸盐杀菌剂的效果可能优于酒精性洗手液。抗菌剂浸泡导管有很多优点，并在预防血流感染中得到认可，可能有成本效益。目前，非通道式、经皮穿刺中心静脉导管有3种消毒配方：洗必泰/磺胺嘧啶银、利福平/米诺环素和银/铂金属离子。尽管有资料显示经抗菌剂浸泡的导管可预防血流感染但并非所有研究都进行了随机化和病例对照设计。所以，抗菌剂浸泡导管的效果还需进一步研究。

二、治疗方案：

1、限制脂肪乳剂的剂量。

2000年Colomb等人首次报道对于PNALD患儿限制脂肪乳剂量这种方式帮助患儿减轻胆汁淤积。在10年时间里，10名患儿有23次出现胆汁淤积，他们都通过限制脂肪乳剂的剂量，使得患儿得到缓解。然而其中三名患儿出现必需脂肪酸缺乏，并且尽管葡萄糖为患儿提供的热卡在增加，但是所有患儿均生长发育迟缓。研究中，1例进行了肝移植，3例进行了多器官移植，5例等待移植，只有1例患儿不再需要肠外营养支持。

Cober等人最近的一项研究，通过比较2005~2007年间接受豆油脂肪乳1g/kg/d的大量患儿与2003~2005年间同样接受标准豆油脂肪乳2~3g/kg/d的大量患儿，来评估对于PNALD患儿限制脂肪乳剂剂量的有效性。结果发现，在限制脂肪乳剂组与正常剂量组，胆汁淤积发生无明显区别。

尽管限制脂肪乳剂量对于一些患儿是有效的，但限制脂肪摄入对于婴儿大脑的发育的影响仍是未知的。临床通常监测生化指标的必需脂肪酸，但一些特定脂肪酸的相对缺乏则是难以评估的。早产儿是特别容易受到DHA相对不足的影响，产妇的DNA转移给胎儿的是很有限的，DNA缺乏通常发生在三个月后期。限制脂肪乳剂量对于大脑发育的远期影响有待于进一步研究。

2、鱼油脂肪乳的应用

单独运用鱼油脂肪乳即用相同剂量（1g/kg·d）的鱼油脂肪乳替代豆油脂肪乳，目前一部分临床研究表明，经过鱼油脂肪乳治疗，胆汁淤积的发病率和死亡率明显降低。其机制可能是鱼油脂肪乳的组成成分相比豆油脂肪乳或植物油，肝脏毒性较小，因此可以缓解PNALD。鱼油脂肪乳中含有最小剂量的植物甾醇，而富含Ω-3多不饱和脂肪酸和α-生育酚。El Kasmi等在一个PNALD小鼠模型中也发现鱼油脂肪乳可以防止肝细胞损伤和胆汁淤积。

Gura 等人首次将鱼油脂肪乳单独运用于2名PNALD早产儿。Gura等研究表明运用鱼油脂肪乳的患儿相比传统脂肪乳，胆汁淤积恢复的更快。18名患儿中运用鱼油脂肪乳的有2名死亡，没有需要肝移植的，而在运用豆油脂肪乳组中有7名死亡，2名患儿需要肝移植。Puder 等随后也比较了42例PNALD患儿接受1g/kg.d鱼油脂肪乳与49例PNALD患儿接受1-4g/kg·d豆油脂肪乳，结果发现，鱼油脂肪乳组比豆油脂肪乳组死亡人数和肝移植率低。

尽管目前已有很多报道鱼油脂肪乳的有效性，但也有一些争议有待考证。鱼油脂肪乳富含DHA，花生四烯酸（AA；20:4n-6）和EPA，但其必须脂肪乳α-亚麻酸和亚油（18:2n-6），相对较少，提高了必需脂肪酸缺乏的风险。然而随后的临床研究也提供了大量证据表明鱼油脂肪乳不会推进必须脂肪缺乏的风险。

3、混合脂肪乳的运用

混合脂肪乳剂的使用，包括鱼油，植物油和中链甘油三酯（MCTs），也被用于PNALD，但很少有临床研究报告。这些混合脂肪乳剂包括SMOFL脂肪乳（30%豆油、30%MCTs、25%橄榄油、鱼油15%）（Fresenius Kabi）、ClinOleic（80%橄榄油，20%大豆油）（Baxter）和Lipofundin（50%豆油、50%MCTs）（B.Braun）。在一项研究中，比较SMOFL脂肪乳和ClinOleic 与纯鱼油脂肪乳和纯豆油脂肪乳用于肠外营养诱导的脂肪变性小鼠模型中的有效性。19天后，除了鱼油组，其余各组均有肝脂肪变性，SMOFL脂肪乳组和ClinOleic组均有必需脂肪酸缺乏的表现。目前研究混合脂肪乳用于PNALD患儿的报道很少，因此混合脂肪乳用于PNALD的治疗的临床安全和临床益处有待于进一步调查。

综上所述，PNALD的预防目前主要减少肠外营养的使用时间，尽早开始经口喂养，和运用熊去氧胆酸；治疗主要包括限制脂肪乳剂的剂量，运用鱼油脂肪乳和运用混合脂肪乳。很有必要研发新的方法，为临床预防和治疗PNALD提供新思路和依据，从而改善PNALD患儿的预后。

发明内容

本发明公开了一种用于肠外营养相关性肝病药物的制备方法，设计特异性干扰IRE1α基因的shRNA包装成慢病毒，从而高效导入BRL细胞，可实现IRE1α基因长期、稳定的干扰效果，实现肠外营养相关性肝病的缓解、治疗。

本发明采用如下技术方案，一种用于肠外营养相关性肝病药物的制备方法，包括以下步骤，将慢病毒包装质粒、包膜表达质粒与干扰表达载体质粒组合成三质粒慢病毒表达系统，然后共转染至包装细胞，经培养后裂解得到用于肠外营养相关性肝病药物；所述干扰表达载体质粒包括由SEQ.ID.NO.1构成的shRNA序列。

本发明采用三质粒系统的慢病毒相关质粒：包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G和GV248表达质粒，从而持久、稳定的干扰目的基因的表达，取得了感染效率高，安全性高，长期稳定表达。在体外构建shRNA的表达载体，在293T细胞中表达包被，产生高滴度的慢病毒，再通过polybrene助感染试剂感染BRL细胞，从而使得基因表达的抑制效果增强，并可维持较长时间。

上述技术方案中，所述慢病毒包装质粒为psPAX2；所述包膜表达质粒pMD2.G；所述干扰表达载体质粒的载体为GV248；所述共转染试剂为Lipofectamine2000；所述包装细胞为293T细胞。

包装细胞(packaging cell)需要为慢病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，但本身不能产生任何形式的病毒颗粒，是获得完整慢病毒颗粒并感染靶细胞的关键；本发明选用人胚肾上皮细胞(293T细胞)作为包装细胞，使其在包装过程中能提供全面的蛋白以产生大量病毒颗粒，最终获得用于感染目的细胞的完整病毒，并且在感染过程中不产生其他有效的细胞免疫应答。

上述技术方案中，干扰表达载体质粒、包装质粒、包膜质粒的质量比为4:3:2，感染效率高，安全性高，长期稳定表达。

本发明还公开了一种可用于肠外营养相关性肝病治疗shRNA，所述shRNA的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1。

本发明还公开了一种可用于肠外营养相关性肝病治疗的干扰表达载体质粒；所述干扰表达载体质粒包括由SEQ.ID.NO.1构成的shRNA序列；还包括GV248载体。

本发明还公开了一种可用于肠外营养相关性肝病治疗的干扰表达载体质粒的制备方法，将shRNA克隆进GV248载体，得到可用于肠外营养相关性肝病治疗的干扰表达载体质粒；所述shRNA的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1。

本发明进一步公开了一种shRNA在制备治疗肠外营养相关性肝病药物或者在制备缓解肝细胞脂肪变药物中的应用；所述shRNA的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1。

本发明进一步公开了一种干扰表达载体质粒在制备治疗肠外营养相关性肝病药物或者在制备缓解肝细胞脂肪变药物中的应用；所述干扰表达载体质粒包括由SEQ.ID.NO.1构成的shRNA序列；还包括GV248载体。

本发明进一步公开了一种用于肠外营养相关性肝病制剂的制备方法，包括以下步骤，将慢病毒包装质粒、包膜表达质粒与干扰表达载体质粒组合成三质粒慢病毒表达系统，然后共转染至包装细胞，经培养后裂解取上清得到肠外营养相关性肝病药物；最后将肠外营养相关性肝病药物与药物辅料混合得到用于肠外营养相关性肝病制剂；所述干扰表达载体质粒包括由SEQ.ID.NO.1构成的shRNA序列，药物辅料为常规物质，比如生理盐水等。

本发明首次将特异性干扰IRE1α基因的shRNA包装成慢病毒，用于肠外营养相关性肝病的预防或者治疗，实施例研究结果表明，24小时后，药物组脂肪滴油酸图明显少于建模组，生化指标也有所优化。

附图说明

图1为IRE1α沉默效果的Western blot灰度分析图；

图2为BRL稳定GFP蛋白表达的荧光显微镜检测图；

图3为BRL稳定细胞系的形态图；

图4为NC组BRL细胞油红O染色结果图；

图5为SO组BRL细胞油红O染色结果图；

图6为LV-IRE1α组BRL细胞油红O染色结果图；

图7为LV-CON组BRL细胞油红O染色结果图；

图8为24h四组大鼠肝细胞中IRE1α/XBP1s/JNK的蛋白表达图。

具体实施方式

本实施例中，干扰IRE1α基因的shRNA的核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1：5’-CACCAAGATGCTGGAGAGATT-3’；质粒由吉凯基因购买；细胞来自苏州大学；其他试剂都是市购。

细胞常用溶液的配置

（1） DMEM/1640培养液：以DMEM/1640培养基为基础培养基，含10%胎牛血清、青霉素100μL/mL、链霉素100 μL/mL，配好后分装，4℃保存；

（2）细胞冻存液：胎牛血清与DMSO按9：1的比例配好后4℃留存，备用；

（3）PBS 缓冲液：KCl 0.2g，NaCl 8.0g，KH2PO4g，Na2HPO4 1.42g，混匀后加1000ml双蒸水搅拌溶解，定容至1L，调节PH7.4，高压灭菌，冷却后 4℃保存；

（4）不同浓度的脂肪乳：用已配好的RPMI 1640培养基与20%的脂肪乳混合形成；

（5）LB液体培养基：Tryptone 10g，Yeast extract 5g，NaCL 10g充分溶解于适量水中，用NaOH调节PH7.5左右，定容1L，高压121℃灭菌20min，储存于4℃，使用前加入一定量氨苄青霉素；

（6）LB固体培养基：Tryptone 10g，Yeast extract 5g，NaCL 10g充分溶解于适量水中，用NaOH调节PH7.5左右，加入20g琼脂粉，定容1L，121℃灭菌20min，待冷却至50℃左右时加入一定量氨苄青霉素，混匀后铺入无菌平皿，使其冷凝。储存于4℃，储存时间不超过2周；

（7）甘油：向80ml甘油中加水定容100ml，充分混匀，高压灭菌20min。储存于4℃；

（8）氨苄青霉素（100mg/ml）：将1g氨苄青霉素充分溶解于10ml水中，0.22μm滤膜除菌，分装后于-20℃保存，使用时以1:1000比例加入培养基中；

（9）嘌呤霉素：将5mg嘌呤霉素充分溶解于1ml培养基（不加双抗）中，取200μL于10ml培养基中，稀释为0.1g/μL,分装保存于EP管中，-80℃冻存；

（10）Polybrene聚凝胺：用灭菌后的0.9%生理盐水4.5ml将500μL（10mg/ml） Polybrene稀释，分装保存于-20℃。

Western blot常用试剂配制

（1）10％APS：0.1g AP溶于lmL双蒸水中，现配现用；

（2）5％BSA：2.5g BSA，加入到50mL 1xTBST中，充分溶解，临用前配制；

（3）5%牛奶：2.5g封闭专用脱脂牛奶，溶于50mL 1xTBST，充分溶解，临用前配制；

（4）10×TBS缓冲液：80g NaCl、24g Tris base、900ml双蒸水，调至PH7.6，然后定容1L；

1×TBST缓冲液：8g NaCl、2.4g Tris base、1ml Tween-20、900ml双蒸水，调至PH7.6，然后定容1L；

（5）10×电泳缓冲液：30.3g Tris base、144g甘氨酸、10g（1%）SDS，加去离子水900ml搅拌使之溶解，定容至1L；

1×电泳缓冲液（1000ml）：100ml10×电泳缓冲液、900ml去离子水；混匀即为1×电泳缓冲液；

（6）10×转膜缓冲液：30.3g Tris base、188g甘氨酸，加去离子水900ml搅拌使之溶解，定容至1L；

1×转膜缓冲液：100ml10×转膜缓冲液、200ml无水甲醇、700ml去离子水，混匀即为1×转膜缓冲液

（7）10%SDS-PAGE分离胶：

SDS-PAGE浓缩胶：

大鼠正常肝细胞BRL细胞培养

（1）细胞准备：将大鼠BRL细胞放入含10%胎牛血清的完全RPMI 1640培养液中，37℃，5%CO2培养箱中培养，显微镜下每日观察细胞生长情况及细胞状态，隔日换液，细胞长至80%-90%汇片时进行细胞传代；

（2）细胞换液：吸弃培养液，1×PBS液清洗3次后加新鲜完全1640培养基4-6ml，37℃，5%CO2培养箱中继续培养；

（3）细胞传代：吸弃瓶中培养液，1×PBS液清洗3次后加1ml胰蛋白酶溶液，并放入培养箱中消化细胞2-3min，显微镜下观察，若胞质回缩、细胞间不再成片后立即加入3ml完全培养基终止消化，用枪尖反复轻柔吹打瓶壁使细胞脱落并制成细胞悬液，800rpm，5min离心，离心后加入12ml新鲜1640培养基，分装至3个培养瓶中继续培养；

（4）细胞冻存：吸弃培养瓶中培养液，1×PBS液清洗3次后，加入1ml 0.25%胰酶消化细胞，并放入培养箱中3min，显微镜下观察，若胞质回缩、细胞间不再成片立即加入3ml培养基终止消化，用枪尖反复轻柔吹打瓶壁使细胞脱落并制成细胞悬液，800rpm，5min离心，离心后吸弃上清，加1ml已经配置好的冻存液，移至冻存管，标明时间及细胞名称，放入冻存盒中，并放入-80℃冰箱，24h后取出冻存盒里的冻存管，-80℃冰箱保存；

（5）细胞复苏：水浴箱温度调至37℃，待水温恒定后，将冻存管迅速移至水浴箱中，1min内迅速解冻细胞，酒精擦拭冻存管管壁，细胞移至离心管，加3ml培养基，800rpm，离心5min，弃上清液，加入新鲜1640培养基，用1ml枪尖吹打细胞，使细胞悬浮于培养液中，放入T25培养瓶中，37℃，5%CO₂饱和湿度下培养细胞，24h后更换新鲜培养基。

实施例一

293T细胞的培养

(1)-80℃冰箱中取出冻存的293T细胞，立即置于37℃水浴锅中解冻，完全融化后，加入到1ml 完全培养基(含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基)中，1000rpm，离心5min；

(2)弃上清，用1ml枪尖吸取lmL完全培养基，吹散细胞，移入含有12mL完全培养基的10cm培养皿中，37℃、5%CO₂、饱和湿度培养；

(3)第二天，吸弃培养基，1×PBS清洗3次，更换DMEM培养基，继续培养，每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长状况及细胞状态，每2天更换一次培养基；

(4)待细胞90％以上融合时，吸去培养基，1×PBS清洗2次，加入0.25％胰酶2mL，轻轻晃动，使胰酶完全与培养皿底部接触，肉眼看到大片细胞不再贴壁，30s左右在倒置相差显微镜下观察细胞形态，显微镜下看到细胞变圆时，加入等体积完全培养基终止消化，并用移液枪反复吹打贴壁细胞，使细胞完全脱落下来；

(5)将细胞悬液收集至15mL离心管中，1000rpm,4℃，离心5min；

(6)轻轻倒出上清液，用移液枪吸取4mL完全培养基，反复吹打使细胞混匀，平均分成4份，分别加入含有10mL完全培养基的10cm培养皿中，混匀，待用。

质粒转染与慢病毒收获

（1）293T细胞密度达85%时，可用于转染，转染前2h更换为无血清培养基；

（2）向一灭菌EP管中加入常规抽提的各DNA溶液（干扰表达载体质粒GV248-IRE1b 8μg，包装质粒psPAX2 6μg，包膜表达质粒pMD2.G 4μg），加入无血清DMEM培养基，调整总体积为500μL；GV248-IRE1b干扰表达载体质粒被克隆入核苷酸序列为SEQ.ID.NO.1的干扰IRE1α基因的shRNA；

（3）根据Lipofectamine2000说明书，向另一灭菌EP管中加入460μL无血清培养基，并加入40μL Lipo2000转染试剂，总体积为500μL；

（4）将步骤（2）获得的稀释后的DNA溶液加入步骤（3）获得的稀释后的Lipo2000溶液中，室温下孵育5min；

（5）将混合液缓慢逐滴滴加至293T细胞培养液中，轻轻混匀，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；

（6）6h后弃去含有转染混合物的培养基，缓慢加入含10%血清的DMEM培养基10ml，继续培养48h，收集转染后48h的293T细胞裂解上清液，以0.45μm滤器过滤上清液后分装于EP管保存于-80℃冰箱中，并再次向293T细胞中加入10ml新鲜培养基，继续培养24h，重复以上步骤；合并上清液为重组慢病毒原液，命名为LV-IRE1α，可作为用于肠外营养相关性肝病药物，与药物辅料比如生理盐水混合可得到制剂。

同样方法用shRNA阴性对照表达载体质粒GV248-CON可以得到阴性对照LV-CON组。

收集正常293T细胞及各组包装细胞蛋白，Western blot检测IRE1α蛋白表达，结果如图1显示：IRE1α/GAPDH的相对比值NC组、LV-IRE1α和LV-CON组分别为1.33、0.08和1.23(P<0.05，经靶向IRE1α慢病毒处理72小时后，LV-IRE1b组蛋白表达降低明显，提示该组靶向IRE1α的shRNA慢病毒沉默IRE1蛋白的表达效果最佳。

LV-IRE1α稳定细胞株的制备

(1)将BRL细胞接种于6孔细胞培养板中，37℃，5％CO₂，培养过夜；

(2)细胞25%融合后，吸弃1.0ml完全培养基，NC组加入1.0ml完全培养基，LV-IRE1α组和LV-CON组加入慢病毒LV-IRE1α和LV-CON；每孔分别加入病毒原液1.。0mL，除正常对照组外，每孔加入polybrene至终浓度为1μg/mL，轻轻混匀，37℃、5％CO₂条件培养48h，在倒置荧光显微镜下观察到GFP荧光，见附图2；

(3)第三天移除含慢病毒感染的培养基，加入含10％胎牛血清新鲜完全培养基；

(4)第四天LV-IRE1α慢病毒颗粒组和LV-CON组加入含0.8μg/mL嘌呤霉素的完全培养基开始进行筛选；

(5)每三天更换一次含0.8μg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基，四天后空白组全部死亡，LV-IRE1α组和LV-CON组的稳定细胞系形态见附图3；将获得的稳定表达LV-IRE1α慢病毒颗粒组和LV-CON组的BRL细胞株放入T25培养瓶中，继续培养。

LV-IRE1α效果表征

实验分组：正常BRL组（NC组）、豆油脂肪乳 BRL 组（SO组）、LV-干扰豆油脂肪乳组（LV-IRE1α组）和LV-阴性对照脂肪乳组（LV-CON组）。大鼠正常BRL细胞及之前已获得的稳转细胞株重组慢病毒LV-IRE1α组、LV-CON组分别培养至95%后胰酶消化收集细胞，使得细胞密度为2.0×10⁴个/ml，接种于6孔板，每孔2ml，72h后更换新鲜培养基2ml，并将已配置好的1ml浓度分别为3%的脂肪乳溶液加入SO组、LV-IRE1α组、LV-CON组，正常BRL组(NC组)加入1ml完全培养基，继续培养0h、12h、24h。

细胞内脂滴形成的观察（油红O染色法），在3个时间点（0h、12h、24h）分别观察各组细胞内脂滴形成情况

NC组：3个时间点(0、12、24h)的细胞形态正常，呈多边形，体积小，胞核圆，边缘清晰，细胞间结合紧密，胞浆丰富，核膜完整，细胞内未见红色脂滴，见附图4。

SO组：培养12h开始出现细胞轮廓变化，细胞间结合欠紧密，红色脂肪滴增多；培养24h，肝细胞体积肿胀，胞核居中，胞浆内可见明显红色空泡脂滴，脂滴数量增多，见图5。

LV-IRE1α组：培养12h细胞形态均正常，细胞间结合紧密，边缘清晰，在24h细胞形态亦正常，细胞间结合紧密，边缘清晰，胞质丰富，少许红色脂肪滴，见图6。

LV-CON组：培养12h开始出现细胞轮廓变化，细胞间结合欠紧密，脂肪滴开始增多；培养24h，肝细胞体积肿胀，胞核居中，胞浆内可见明显红色空泡脂滴，脂滴数量明显增多，见图7。

细胞培养上清液生化指标测定

分别收集四组细胞2个时间点(12h、24h)的细胞培养上清液，离心（1500r/min）5min后取上层培养液，全自动生化仪测定血清总胆红素（TBIL）、结合胆红素(DBIL)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、碱性磷酸酶（ALP）、白蛋白（ALB）、乳酸脱氢酶（LDH）、甘油三酯（TG），结果见表1、表2。

表112小时四组细胞培养上清液生化指标比较

注：*表示与NC组比较，*P<0.05；a表示组内比较，与前一时间点相比，P<0.05

表2 24小时四组细胞培养上清液生化指标比较

注：*表示与NC组比较，*P<0.05；#表示与LV-IRE1组比较，#P<0.05；a表示组内比较，与前一时间点相比，P<0.05

RT-PCR技术检测大鼠肝细胞BRL细胞IRE1α/XBP1s/JNK的表达

采用逆转录-多聚酶链式反应(Reverse Transcriptase Polymerase ChainReaction，RT-PCR)法检测肝细胞中IRE1α mRNA 的表达。

BRL细胞总RNA的提取

（1）将各个时间点的四组细胞，在六孔板中，分别加入1ml Trizol，室温放置20min，待细胞完全裂解，收集于1.5ml无酶EP管中；

（2）加入氯仿200μL，振荡混匀15s，室温静置15min；

（3）4℃，12000rpm离心15min；

（4）小心吸取上层水相(约500μL)至一新的EP管(1.5ml)；

（5）加入异丙醇500μL混匀后，冰上放置20min；

（6）4℃，12000rpm离心20min，弃上清，RNA沉于管底；

（7）加入75%的乙醇(DEPC水配制)1ml，温和震荡离心管，悬浮沉淀；

（8）4℃，7500rpm离心5min，尽量弃上清；

（9）室温晾干。

RNA定量

DEPC处理液20μL溶解沉淀，55-60℃10min，取2μL稀释50倍，用分光光度计测量260nm和280nm波长处的OD值及OD260nm/OD280nm值，比值在1.8-2.0时为RNA样品的纯度满意。OD260与OD280，OD260/OD280的比值确定RNA的完整性与纯度，以OD260的值确定RNA的量并稀释到浓度为lμg/1μL。

cDNA反转录

（1）PCR引物设计与合成

基因名称引物序列IRE15'—GCCACCCTGCAAGAGTATGT—3'5'—ACGATGTTGAGGGAGTGGAG—3'XBP1s5'—GCTTGTGATTGAGAACCAAGG—3'5'—GGCCTGCACCTGCTGCGGACTC—3'JNK5'—AGCACCAGAGGTCATTCTCG—3'5'—TTGAGGCAAACCATTTCTCC—3'β-action5'—GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC—3'5'—CATCTGCTGGAAGGTGGACA—3'

（2）总RNA2 ug、随机引物1 μL、DEPC水14μL加入微量离心管中颠倒混匀(可稍许离心)，并于70℃温育5min后，迅速置于冰上；

（3）依照以下顺序加入以下试剂建立反应体系：反转录缓冲液5μL、10Mm dNT P混合物1.25μL、DEPC水1.75μL、RNAsin核糖核酸酶抑制剂1μL、反转录酶1μL；将上述反应体系置于37℃温育60min，95℃ 5min。

实时PCR检测

PCR反应体系：2×SYBR PCR minister Mix7.5μl、前引物0.5 μl、后引物0.5μl、去离子水6.0μl、cDNA0.5μl；PCR反应条件及定量分析按上述反应体系加样，每个样品做四个复孔，然后将样品置于荧光定量仪上，根据设定好的程序进行反应，反应条件为： 95 ℃，10min；95 ℃，15 s,，60 ℃， 15 s，72 ℃，30 s，72 ℃收集荧光，共40-50个循环；循环结束后做相应的溶解曲线。运用LightCyler 480自带的软件进行实时数据收集和定量分析。

四组大鼠肝细胞中IRE1α mRNA 的动态表达结果见表4，与NC组相比，SO组和LV-CON组IRE1α mRNA表达在12h、24h均增高(均P<0.05)；LV-IRE1α组IRE1α mRNA表达在不同时间点均降低(P<0.05)。NC组、LV-IRE1α组组内不同时间点无差异(P>0.05)；SO组与LV-CON组内比较均自12h起升高，24h达高峰。

表4 四组细胞不同时间点IRE1α mRNA的相对表达量的变化

组别12h24hNC组0.0022±0.00020.0021±0.0003SO组0.0066±0.0006*#0.0082±0.0000*#LV-IRE1α组0.0015±0.0000*0.0016±0.0000LV-CON组0.0071±0.0005*#0.0078±0.0001*#F221.94161.22P＜0.05＜0.05

四组间不同时间点XBP1s mRNA的表达结果见表5。SO组、LV-CON组两组间不同时间点XBP1s mRNA的表达均无明显差异(均P>0.05）；与NC组相比，SO组及LV-CON组XBP1s mRNA表达在12h、24h表达均增高(P<0.05)，与LV-IRE1α组比较，SO组、LV-CON组XBP1s mRNA表达在12h、24h均升高均P<0.05)；LV-IRE1α组XBP1s mRNA不同时间点均低于NC组（P<0.05）。NC组、LV-IRE1α组组内不同时间点无差异(P>0.05)；SO组、LV-CON组内比较均自12h起升高，24h达高峰。

表5 四组细胞不同时间点XBP1s mRNA的相对表达量的变化

分组12h24hNC组0.0017±0.00040.0021±0.0002SO组0.0062±0.0007*#0.0066±0.0006*#LV-IRE1α组0.0010±0.00040.0012±0.0005*LV-CON组0.0065±0.0007*#0.0071±0.0002*#F96.854271.799P＜0.05＜0.05

四组间于12h、24hBRL细胞JNK mRNA表达结果见表6。SO组、LV-CON组两组组间不同时间点JNK mRNA基因表达均无显著差异(P>0.05)。LV-IRE1α组12h、24h JNK mRNA表达低于NC组,差异有统计学意义(P<0.05)，与LV-IRE1α组相比，SO组、LV-CON组JNK mRNA表达在12、24h升高。

表6 四组细胞不同时间点JNK mRNA的相对表达量的变化

组别12h24hNC组0.00012±0.00000.00013±0.0000SO组0.00017±0.00003#0.00033±0.0000*#LV-IRE1α组0.00008±0.0000*0.00015±0.0000*LV-CON组0.00015±0.0000#0.00031±0.0000*#F5.588118.002P<0.05<0.05

注：*表示与NC组相比*P<0.05；#表示与LV-IRE1组相比，#P<0.05，可以看出，LV-IRE1α组有效缓解细胞脂肪变带来的问题。

Western blot检测大鼠BRL细胞中相关标志蛋白的表达

Western blot检测结果显示：24h细胞IRE1α 蛋白表达在四组之间比较差异有统计学意义（P<0.05），p-IRE1α 蛋白表达在四组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。与NC组相比，SO组、LV-CON组IRE1α、P-IRE1α蛋白表达明显升高差异有统计学意义（P<0.05），而LV-IRE1α组明显降低（P<0.05）；SO组、LV-CON组两组间则无显著差异（P>0.05）；与LV-IRE1α组相比，SO组与LV-CON组两组IRE1、P-IRE1蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），具体见下表7。

Western blot检测结果显示：24h细胞XBP1u、XBP1s 蛋白表达在四组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。与NC 组相比，SO组、LV-CON组XBP1u、XBP1s的蛋白均有统计学意义，较NC组升高（P<0.05）；SO组、LV-CON组两组间则无显著差异（P>0.05）；LV-IRE1α组XBP1u蛋白表达低于NC组，而XBP1s则较NC组升高；SO组、LV-CON组XBP1u、XBP1s的蛋白均较LV-IRE1α升高LV-IRE1α，具体见下表7。

Western blot检测结果显示：24h细胞JNK、p-JNK蛋白表达在四组之间比较差异均统计学意义（P<0.05）SO组、LV-IRE1组、LV-CON组JNK和P-JNK蛋白两两比较则无明显差异（P>0.05），但均高于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)，具体见下表7。

表724h四组大鼠BRL细胞中IRE1α/XBP1s/JNK的蛋白表达

分组IREαP-IREαXBP1uXB1sJNKP-JNKNC组0.3422±0.00050.2003±0.00010.3573±0.0050.3511±0.04761.0739±0.10080.7079±0.0096SO组0.7461±0.0436*#0.6914±0.0476*#0.6717±0.0606*#0.7232±0.0287*#1.6756±0.4297*0.9021±0.1190LV-IRE1α组0.0141±0.0001*0.0856±0.0013*0.4224±0.0096*0.2932±0.0191*1.5365±0.0957*0.8276±0.0957*LV-CON组0.6978±0.0520*#0.6643±0.1356*#0.7468±0.0691*#0.7535±0.0332*#1.6767±0.0096*0.9479±0.0539*P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

注：*表示与NC组相比,*P<0.05；#表示与LV-IRE1α组相比，#P<0.05

本发明采用三质粒系统的慢病毒相关质粒：包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G和GV248表达质粒，经过转染，从而实现持久、稳定的干扰目的基因的表达，并成功制备出IRE1α沉默的BRL稳定细胞株，慢病毒携带的干扰IRE1α的shRNA表达质粒可整合至宿主细胞染色体基因组上，Western Blot检测可见，空白对照组中IRE1α的蛋白表达明显高于LV-IRE1α组，提示该慢病毒介导的IRE1α沉默效果佳，可以说明IRE1α缓解了BRL细胞脂肪变，具备治疗肠外营养相关性肝病的条件。

SEQUENCE LISTING

<110>苏州大学附属儿童医院

<120>一种用于肠外营养相关性肝病药物的制备方法

<160> 9

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

CACCAAGATGCTGGAGAGATT 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

GCCACCCTGCAAGAGTATGT20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ACGATGTTGAGGGAGTGGAG20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

GCTTGTGATTGAGAACCAAGG 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

GGCCTGCACCTGCTGCGGACTC22

<210> 6

<211>20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

AGCACCAGAGGTCATTCTCG20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

TTGAGGCAAACCATTTCTCC20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

CATCTGCTGGAAGGTGGACA20