内质网应激IRE1α/XBP1s信号通路在肠外营养相关性肝病——肝细胞脂肪变细胞水平的研究

摘要

目的：
　　通过建立IRE1α(inositol-requiring enzyme1)沉默的大鼠正常肝细胞BRL(buffalo rat liver)细胞的稳定细胞株，并建立肠外营养相关性肝病(Parenteral nutrition-associated liver disease，PNALD)细胞模型—肝细胞脂肪变模型，研究内质网应激（Endoplasmic reticulum stress，ERS）中IRE1α/XBP1s信号通路相关分子IRE1α、XBP1s、JNK的表达，进一步深入探讨ERS时IRE1α/XBP1s信号通路在PNALD发病机制中的作用，为临床预防和治疗PNALD提供新思路和实验依据。
　　材料与方法：
　　1.慢病毒颗粒的制备及干扰效果最佳的慢病毒颗粒的筛选：培养293T细胞，将慢病毒包装质粒psPAX2和包膜表达质粒pMD2.G与干扰表达载体质粒GV248-IRE1a、GV248-IRE1b、GV248-IRE1c和阴性对照表达载体质粒GV248-CON组合成三质粒慢病毒表达系统，Lipofectamine2000分别将其共转染至包装细胞(293T细胞)，命名为LV-IRE1a、LV-IRE1b、LV-IRE1c和LV-CON，感染293T细胞，Western blot检测IRE1α的表达效果，筛选出干扰效果最佳的慢病毒组。
　　2.IRE1α沉默的稳定细胞株的筛选：培养大鼠正常肝细胞 BRL细胞，用不同浓度的嘌呤霉素处理细胞，2~3天细胞全部死亡的嘌呤霉素最小浓度，即确定为嘌呤霉素的最佳筛选浓度；用已筛选的干扰效果最佳的干扰慢病毒和阴性对照慢病毒感染 BRL细胞72小时，用最佳浓度嘌呤霉素处理 BRL细胞，每三天更换含有嘌呤霉素的完全培养基，直至未感染慢病毒的空白组细胞全部死亡。扩增培养慢病毒感染的两组BRL细胞。
　　3.脂肪乳最佳诱导浓度的筛选：培养大鼠BRL细胞，对照组用正常培养基培养肝细胞，实验组用加入培养基稀释的不同浓度医用脂肪乳（浓度分别为0.2％、0.4%、0.6%、1%、2%、4%）诱导大鼠BRL细胞24、48小时，油红O染色观察各组细胞形态和脂滴形成情况，CCK-8检测各组细胞增殖，确定脂肪乳最佳诱导浓度。
　　4.实验分组：随机分为正常 BRL组（NC组）、豆油脂肪乳 BRL组（SO组）、LV-干扰豆油脂肪乳组（LV-IRE1α组）和LV-阴性对照脂肪乳组（LV-CON组）。除NC组外，其余三组均以最佳诱导浓度为0.6%脂肪乳培养。在不同时间点(12h、24h、48h)，通过油红O染色激光共聚焦显微镜观察肝细胞脂肪变情况；全自动生化仪检测各时间点(12h、24h、48h)细胞培养液生化指标变化；分别用RT-PCR和Western Blot方法检测IRE1α/XBP1s中相关分子IRE1α、XBP1s、JNK mRNA和蛋白的表达。
　　结果：
　　1.慢病毒颗粒的制备及干扰效果最佳的慢病毒颗粒的筛选：
　　成功包装四种慢病毒颗粒(LV-IRE1a、LV-IRE1b、LV-IRE1c和LV-CON)，感染BRL细胞，并筛选出干扰效果最佳的慢病毒组为LV-IRE1b组。筛选出嘌呤霉素处理BRL细胞的最小浓度为0.8μg/mL，并且建立了IRE1α沉默的稳定细胞株。
　　2.肝细胞脂肪变造模脂肪乳浓度确定：
　　2.1.不同浓度脂肪乳培养肝细胞后形态观察
　　正常BRL肝细胞形态正常，细胞间结合紧密，细胞内未见红色脂滴，而不同浓度脂肪乳培养肝细胞，0.2%浓度组肝细胞在24、48h两时间点形态正常、细胞间结合紧密、胞内未见红色脂滴，0.4%、0.6%浓度组细胞形态尚正常、细胞间结合尚紧密、胞浆内可见红色空泡脂滴，且随脂肪乳浓度的增加及培养时间延长脂滴增多。1%、2%和4%浓度组培养24、48h时，细胞肿胀，死亡细胞较多，胞内红色脂滴明显增多。
　　2.2.不同浓度脂肪乳培养肝细胞后活力观察
　　CCK-8检测细胞增殖 OD值：用0.6%及以下浓度脂肪乳培养肝细胞，24、48h细胞OD值与正常组比较均无明显差异(P>0.05)；而1%、2%及4%浓度脂肪乳培养肝细胞24、48h后，细胞活性OD值明显低于对照组(P<0.05)，肝细胞虽有明显脂肪变，但不能进行后续实验，结合培养后肝细胞形态和细胞增殖情况，选取0.6%脂肪乳作为最佳诱导浓度。
　　3.造模后四组肝细胞形态改变：
　　NC组：4个时间点(0、12、24、48h)肝细胞形态正常，细胞间结合紧密，细胞内未见红色脂滴。SO组和LV-CON组：培养12h肝细胞形态正常，细胞间结合紧密，胞内少许脂肪滴；培养24h开始出现细胞轮廓变化，细胞间结合欠紧密，脂肪滴增多；培养48h，出现细胞肿胀，胞内红色脂滴逐渐增多。LV-IRE1α组：培养12h细胞形态正常，细胞间结合紧密，胞内少许脂肪滴；培养24h、48h细胞形态改变、肿胀，细胞间结合欠紧密，细胞内脂肪滴明显、聚集成团。
　　4.细胞培养上清液生化指标变化：
　　四组组间及组内在三个时间点(12h、24h、48h)ALT、AST均有显著差异，LDH在两个时间点(24h、48h)组间及组内有统计学意义(P<0.05)，而ALP、GGT均无明显差异(P>0.05)；SO组、LV-CON组、LV-IRE1组三个时间点TBIL、DBIL、AST、ALT、TG显著高于NC组，随造模时间延长而升高，且组内12h、24h、48h三个时间点比较均有统计学意义(P<0.05)，LDH在24、48h均显著高于NC组(P<0.05)；LV-IRE1组三个时间点AST、ALT、LDH显著高于SO组和LV-CON组(P<0.05)，48h ALB显著低于其余三组(P<0.05)。
　　5.四组大鼠BRL细胞中IRE1α/XBP1s/JNK mRNA的表达变化：
　　5.1.四组肝细胞不同时间点IRE1αmRNA的动态表达
　　四组间不同时间点（12、24、48h）肝细胞IRE1αmRNA的表达均有显著差异(均P<0.05)。SO组与LV-CON组两组间不同时间点IRE1αmRNA表达均无明显差异(均P>0.05)。与NC组相比，SO组和LV-CON组在12、24、48h三个时间点IRE1αmRNA表达均显著升高(均P<0.05)，而LV-IRE1α组IRE1α mRNA表达降低(P<0.05)；SO组、LV-CON组IRE1α mRNA两组组内不同时间点间表达有显著差异，均自12h起升高、24h达高峰(均P<0.05)，48h下降，但较24h无显著差异（P>0.05)。
　　5.2.四组肝细胞不同时间点XBP1s mRNA的动态表达
　　四组间不同时间点（12、24、48h）肝细胞XBP1s mRNA的表达均有显著差异（均P<0.05）。SO组、LV-CON组两组间不同时间点XBP1s mRNA的表达均无明显差异(均P>0.05）。与NC组相比，SO组及LV-CON组XBP1s mRNA表达在12、24、48h三个时间点的表达均显著升高(P<0.05)，LV-IRE1α组XBP1s mRNA三个时间点均低于NC组（P<0.05）；NC组、LV-IRE1α组组内三个时间点无差异(P>0.05)；SO组、LV-CON组内比较均自12h起升高，24h达高峰，48h相比24h下降，有统计学意义(P<0.05)。
　　5.3.四组大鼠BRL细胞中JNK mRNA的动态表达
　　四组间三个时间点（12h、24h、48h）细胞JNK mRNA表达有统计学意义（P<0.05）。SO组与LV-CON组组间不同时间点JNK mRNA基因表达均无显著差异(P>0.05)。与NC组相比，SO组、LV-CON两组JNK mRNA表达12h无明显统计学意义(P>0.05)，而24h、48h两时间点JNK mRNA表达则明显升高(P<0.05)；LV-IRE1α组12h、24h JNK mRNA表达低于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)，48h明显高于NC组(P<0.05)；SO组、LV-CON组、LV-IRE1α组三组组内自12h开始逐渐升高，48h达高峰，差异有统计学意义(P<0.05)。
　　6.24h四组大鼠肝细胞中P-IRE1α/XBP1s/JNK的蛋白表达水平比较
　　6.1.24h四组大鼠肝细胞中P-IRE1α的蛋白表达水平比较：
　　24h细胞P-IRE1α蛋白表达在四组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。与NC组相比，SO组、LV-CON组P-IRE1α蛋白表达明显升高差异有统计学意义（P<0.05），而LV-IRE1α组明显降低（P<0.05）；SO组、LV-CON组两组间则无显著差异（P>0.05）；与LV-IRE1α组相比，SO组与LV-CON组两组P-IRE1α蛋白表达明显升高（P<0.05）。
　　6.2.24h四组大鼠肝细胞中XBP1s的蛋白表达水平比较：
　　24h细胞XBP1s蛋白表达在四组之间比较差异有统计学意义（P<0.05）。与NC组相比，SO组、LV-CON组XBP1s蛋白表达均显著升高（P<0.05）；SO组、LV-CON组两组间则无显著差异（P>0.05）；LV-IRE1α组XBP1s蛋白表达较NC组升高，较SO组、LV-CON组低（P<0.05）。
　　6.3.24h四组大鼠肝细胞中JNK、P-JNK的蛋白表达水平比较：
　　24h细胞JNK、p-JNK蛋白表达在四组之间比较差异均无统计学意义（P<0.05）；SO组、LV-IRE1组、LV-CON组JNK和P-JNK蛋白两两比较均无明显差异（P>0.05），但均明显高于NC组(P<0.05)。
　　结论：
　　1、本实验成功包装出IRE1α干扰的慢病毒，成功感染BRL细胞；
　　2、本实验通过不同浓度脂肪乳诱导大鼠BRL细胞，筛选出实验造模的最适脂肪乳浓度，为进一步开展后续实验研究奠定基础；
　　3、本实验成功建立了PNALD细胞模型—肝细胞脂肪变模型，为进一步研究其发病机制奠定了基础；
　　4、SO组肝细胞中IRE1α/XBP1s/JNK信号通路中相关分子IRE1α、XBP1s mRNA表达在12h、24h升高，48h下降，JNK mRNA表达随造模时间延长逐渐升高，P-IRE1α、XBP1s蛋白表达在24h升高；LV-IRE1α组相关分子IRE1α、XBP1s mRNA和P-IRE1α、XBP1s蛋白表达在12、24h明显下降，JNK mRNA和P-JNK蛋白在24h明显升高。提示ERS时IRE1α/XBP1s/JNK信号通路可能参与了PNALD肝细胞脂肪变的发生、发展。

目录

前言

材料和方法

1. 实验材料：

2. 主要实验方法

结果

1. 慢病毒感染293T细胞及干扰效果最佳的慢病毒颗粒的筛选。

2. IRE1沉默的稳定细胞株的筛选

3. 筛选最佳诱导浓度

4. 四组细胞油红O染色及光镜观察

5.四组细胞培养液生化指标测定结果

6.四组大鼠肝细胞中IRE1α/XBP1s/JNK mRNA的表达变化

7. 24h四组大鼠肝细胞中IRE1α/XBP1s/JNK的蛋白表达

讨论

1. 慢病毒三质粒系统及稳定细胞株的建立

2. PNALD 细胞模型——肝细胞脂肪变模型的建立

3. IRE1α/XBP1s/JNK信号通路在PNALD发病机制中的作用

结论

参考文献

附图

综述:新生儿肠外营养相关性肝病临床防治研究进展

中英文对照缩略词表

致谢